ES2239004T3 - Purificacion de polihidroxialcanoatos. - Google Patents
Purificacion de polihidroxialcanoatos.Info
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Abstract
Un método para aislamiento y purificación de polihdroxialcanoatos (PHAs) derivados de biomasa que tiene PHA, método que comprende: extracción de PHA desde la biomasa utilizando al menos un disolvente mientras se somete simultáneamente la biomasa a un proceso de filtración para separar el PHA así extraído de las células de la biomasa.
Description
Purificación de polihidroxialcanoatos.
La presente invención se refiere en general a
métodos para recuperación de polihidroxialcanoatos ("PHAs") a
partir de biomasa microbiana o de plantas. Una comprensión mejorada
de los caminos de biosíntesis de PHA ha permitido la utilización de
organismos microbianos, tanto naturales como recombinantes, así como
las células de plantas, para producir cantidades significativas de
PHA. Las dificultades permanecen, sin embargo, en cuanto al
desarrollo de una recuperación eficaz y económica del PHA a niveles
útiles de calidad y pureza a partir de los materiales de la fuente
biológica. Los métodos previos para aislar y purificar PHAs a partir
de biomasa han incluido, por ejemplo, medios acuosos y medios de
disolvente orgánico.
Por ejemplo, la Patente estadounidense No.
5.364.778 para Byron describe un método acuoso donde la biomasa que
comprende PHA se mantiene como suspensión acuosa espesa en la que el
PHA es generalmente insoluble. La suspensión espesa se somete a
diversos tratamientos proyectados para digerir, degradar u otra
forma de hacer hidrosoluble la biomasa sin PHA. Esta biomasa
solubilizada se separa entonces de la suspensión espesa por
centrifugación, filtración o por otro medio. Las vías de base
acuosa, sin embargo, tienen ciertas desventajas, en particular las
aplicadas a procesado a gran escala. Entre los ejemplos de estas
desventajas se incluyen (a) la mayor dificultad para una
purificación eficaz debido a que muchas impurezas, entre las que se
incluyen algunos compuestos tensioactivos para tratamientos los
solubilizantes, pueden quedar fuertemente adsorbidas en la
superficie de las partículas de PHA; (b) pueden requerirse volúmenes
grandes (es decir, grandes cantidades) de agua de lavado para el
proceso, generándose agua de lavado usada y las correspondientes
dificultades para su eliminación, (c) se pueden requerir múltiples
tratamientos de solubilización para obtener PHA de elevada pureza;
(d) el secado de la suspensión espesa de PHA de base acuosa puede
ser largo y costoso; (e) las partículas de PHA pueden dar lugar a un
extenso estropeado de las membranas de filtración, centrífugas y
otro equipo del proceso; y (f) los tratamientos de solubilización
pueden requerir reactivos caros y tiempos de proceso prolongados y/o
temperaturas elevadas para ser eficaces.
Entre los ejemplos de procesos de métodos basados
en disolventes orgánicos están los descritos en las Patentes
estadounidenses número 4.101.533 para Lafferty y otros y número
5.422.257 para Ohleyer. En estos métodos, se mezcla con la biomasa
un disolvente orgánico para el PHA contenido en una biomasa, lo que
da por resultado la disolución del PHA. La solución orgánica que
comprende el PHA se separa entonces de la biomasa insoluble
remanente por filtración, centrifugación u otro medio. Se elimina
entonces el disolvente de la solución orgánica para recuperar el
PHA. Estas vías de utilización de un disolvente orgánico tienen
desventajas similares a las desventajas asociadas a los métodos de
base acuosa, que incluyen (a) la necesidad de un volumen de
disolvente relativamente grande para extraer por completo el PHA de
la biomasa; (b) la posible necesidad de secado de la biomasa antes
de la extracción con disolvente, lo que puede resultar costoso y
consumir mucho tiempo; y (c) los disolventes pueden
co-extraer impurezas junto con el PHA, tales como
lípidos u otros materiales biológicos hidrófobos, necesitándose
tratar el extracto para obtener un PHA de pureza satisfactoria.
Sería ventajoso desarrollar un procedimiento mejorado y más
económico para recuperar PHA de biomasa que contiene PHA.
Un objeto de esta invención es, por tanto,
proporcionar un método de recuperación de PHA a partir de la biomasa
que contiene PHA que utiliza un procedimiento que es más sencillo,
es relativamente más rápido, emplea los disolventes acuoso y/u
orgánicos con mayor eficacia, y conduce posiblemente a un producto
de PHA más puro que los procedimientos convencionales.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método de recuperación de PHA de la biomasa que
contiene PHA utilizando un procedimiento que se puede emplear
económicamente en un proceso de producción a escala comercial.
Se proporciona un método para aislar y purificar
PHA desde biomasa que contiene PHA. El método incluye la etapa de
extracción de PHA desde la biomasa utilizando al menos un disolvente
y sometiendo simultáneamente la biomasa a un proceso de filtración
para separar las células. En un modo de realización preferido del
método, la biomasa que comprende PHA (por ejemplo una suspensión
espesa acuosa de células microbianas obtenidas por un proceso de
fermentación) se extrae directamente por diafiltración empleando un
disolvente orgánico, para obtener PHA.
En un proceso de diafiltración preferido, se hace
recircular una suspensión espesa acuosa de células microbianas que
comprenden PHA a través de una membrana de filtración, donde las
membranas tienen un tamaño de poro suficientemente pequeño para
rechazar las células individuales o agregados de estas células
cuando los hay en la suspensión espesa. En condiciones en que hay
una caída de presión a través de la membrana de filtración tiene
lugar un flujo de líquido desde la membrana de filtración. A medida
que el líquido se separa progresivamente desde la suspensión espesa
de la biomasa, se añade a la suspensión espesa de biomasa un
disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente miscible con agua
que también es un disolvente para el PHA. La adición de disolvente
deberá hacerse a una velocidad que esté próxima a la velocidad de
permeación del líquido a través del filtro con el fin de mantener el
volumen de la suspensión espesa de biomasa. A medida que aumenta la
concentración de disolvente orgánico en la suspensión espesa, varias
impurezas que son insolubles en agua se disuelven en la mezcla
disolvente-agua y pasan a través de la membrana del
filtro. Cuando la concentración de disolvente orgánico alcanza un
cierto nivel, el PHA se hace soluble y fluye a través de la membrana
filtrante. Se elimina entonces el disolvente del filtrato que
comprende PHA para recuperar el polímero.
El método tiene las ventajas de (a) no ser
necesario por lo general el filtrado de la biomasa para extracción
con disolvente; (b) se puede separar fácilmente el PHA por
fraccionado de otras impurezas para obtener PHA relativamente puro
en un solo proceso, ya que la biomasa se somete a un gradiente de
concentración de disolvente; (c) el proceso entero de extracción y
purificación de PHA de biomasa se puede realizar empleando un mínimo
de etapas y equipo de proceso; y (d) el método utiliza los
disolventes con eficacia, especialmente cuando la suspensión espesa
de biomasa es relativamente concentrada y cuando la diafiltración se
lleva a cabo a una diafiltración de volumen constante. Además, al
utilizar disolventes orgánicos volátiles, es relativamente fácil
eliminar el disolvente de las soluciones de PHA y recuperar y volver
a utilizar el disolvente de los filtratos generados en el proceso de
diafiltración.
Se ha desarrollado un método para aislar y
purificar polihidroxialcanoatos ("PHAs") a partir de biomasa
que comprende PHAs. El método incluye la etapa de extracción de PHA
de la biomasa utilizando al menos un disolvente mientras se somete
simultáneamente la biomasa a un proceso de filtración para separar
células.
Los materiales de biomasa derivan de plantas que
producen PHA o microorganismos que producen PHA.
Tal como aquí se utilizan,
"polihidroxialcanoato" y "PHA" se refieren a polímeros que
contienen una o más unidades, por ejemplo entre 10 y 100.000, y
preferiblemente entre 100 y 30.000 unidades de la siguiente fórmula
I:
-OCR^{1}R^{2}(CR^{3}R^{4})_{n}CO-
;
donde n es un entero, por ejemplo
entre 1 y 15, y en un modo de realización preferido entre 1 y 4;
y
donde R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4},
independientemente, pueden ser radicales hidrocarburo que incluyen
radicales hidrocarburo de cadena larga; radicales sustituidos con
halo y con hidroxilo: radicales hidroxi; radicales halógeno;
radicales nitrogenados; radicales oxigenados; y/o átomos de
hidrógeno.
Tal como aquí se emplea, la fórmula
-(CR^{3}R^{4})_{n}- se define por su inclusión de las
siguientes fórmulas:
-CR^{3}R^{4}- \hskip0.5cm
(donde n =
1);
-CR^{3}R^{4}CR^{3}'R^{4'}-
\hskip0.5cm (donde n=2);
y
-CR^{3}R^{4}C
R^{3}'R^{4'}CR^{3''}R^{4'}'- \hskip0.5cm (donde
n=3);
donde R^{3}, R^{4}, R^{3}',
R^{4'},R^{3''} y R^{4'}' pueden ser independientemente
radicales hidrocarburo que incluyen radicales hidrocarburo de cadena
larga; radicales halogenados o hidroxilados; radicales hidroxi;
radicales halógeno; radicales nitrogenados; radicales oxigenados;
y/o átomos de hidrógeno. Según esto, la fórmula I incluye unidades
derivadas de 2-hidroxiácidos (n=0),
3-hidroxiácidos (n=1),
4-hidroxiácidos (n=2) y
5-hidroxiácidos (n=3) y
6-hidroxiácidos
(n=4).
Estas unidades pueden ser iguales, en un
homopolímero, o ser diferentes, como por ejemplo en un copolímero o
terpolímero. Los polímeros tienen típicamente un peso molecular por
encima de 300, por ejemplo, entre 300 y 10^{7}, y en un modo de
realización preferido 10.000 a 10.000.000 Daltons.
Los PHAs preferidos incluyen
poli-3-hidroxioctanoato (PHO) u
otros poliésteres microbianos que comprenden hidroxiácidos de C6 a
C14.
Otros polímeros preferidos incluyen
poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxi-valerato,
poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxipropionato,
poli-3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato,
poli-3-hidroxibutirato-co-4-hidroxivalerato,
poli-3-hidroxi-butirato-co-3-hidroxihexanoato,
poli-4-hidroxibutirato,
poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxioctanoato,
poli-4-hidroxibutirato,
poli-3-hidroxipropionato,
poli-4-hidroxivalerato.
La biomasa de PHA se genera típicamente por un
proceso de fermentación (donde la fuente biológica es un
microorganismo que produce de forma natural los PHAs o al que puede
inducirse a que produzcan PHAs por manipulación de las condiciones
de cultivo y materiales de alimentación, o microorganismos) o pueden
ser producida por una planta, o por parte de una planta, que ha sido
sometida a ingeniería genética para que produzca PHAs.
En la Patente estadounidense No. 4.910.145 para
Holmes y otros; Braunegg y col., J. Biotechnology
65:127-161 (1998), se describen métodos que se
pueden utilizar para producir polímeros de PHA a partir de
microorganismos que producen de forma natural
polihidroxialcanoatos.
Métodos para producir PHAs en organismos
naturales o sometidos a ingeniería genética están descritos en
Microbiol.Mol. Biol.Rev. 63:1-53 (1999),
Madison & Huisman; Appl. Microbiol. Biotechnol.
51:13-21 (1999) Choi & Lee; Current Opinion
in Biotechnology, 10:279-285 (1999) Witholt
& Kessler; CHEMTECH, 26:38-44(1996)
Williams & Peoples; las Patentes estadounidenses Nos. 5.245.023;
5.250.430; 5.480.794, 5.512.669, 5.534.432 para Peoples y Sinskey; y
la Patente U.S. No. 5.563.239 para Hubbs y col. La Patente
estadounidense No. 5.292.860 para Shiotani y otros describe la
producción del copolímero de PHA
poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato.
La Patente estadounidense No. 5.871.890 para Naylor describe la
producción de PHAs por fermentación de Alcaligenes europhus
sobre material de alimentación de aceite vegetal.
El PHA se puede recuperar a partir de cualquier
tipo de planta esencialmente, incluyendo plantas transgénicas lo que
ofrece muchas ventajas para la producción de PHAs. Las plantas de
cultivos transgénicos para producción de PHAs se pueden obtener
utilizando métodos disponibles en la técnica (Patentes
estadounidenses US 5.245.023 y US 5.250.430, Patentes
estadounidenses US 5.502,273, US 5.534.432, US 5.602.321; US
5.610.041, Patente PCT WO 9100917, WO 9219747, WO 9302187, WO
9302194 y WO 9412014; Poirier y col. 1992 Science 256;
520-23; van der Leij & Witholt, 1995, Can. J.
Microbiol. 41 (sup): 222-38; trabajo de Nawrath
y Poirier, 1996, presentado en El Simposio Internacional sobre
Polihidroxialcanoatos bacterianos. Eggink y col. eds. Davos Suiza,
Agosto 18-23, Williams and Peoples, 1996. CHEMTECH
26:38-44). La producción de cultivos de plantas
transgénicas pueden producir polímeros de PHA a precios y a escala
competitivos con los plásticos derivados de la petroquímica. Los
polímeros de PHA derivados de plantas transgénicas o sus derivados
se pueden tratar y separar de la biomasa vegetal en formas
comercialmente útiles. La localización del PHA en el cultivo de
plantas se puede hacer variar para conseguir un mayor rendimiento
del PHA de la planta. Por ejemplo, las plantas pueden ser
monocotiledoneas o dicotiledoneas y los materiales de la fuente
vegetal adecuada pueden derivar de las raíces, ramas, hojas, flores,
frutos y semillas.
Los PHAs pueden aislarse de la biomasa vegetal
derivada de plantas tales como soja, algodón, coco, cacahuete,
semilla de colza, semilla de girasol, oliva, palma, semilla de
sésamo, semilla de lino, ricino, semilla de cártamo, tabaco, caña de
azúcar, y patata. Además de los polímeros de PHA, se puede aislar el
aceite vegetal en las plantas de cultivo de siembra y recuperarse
durante el tratamiento, como se describe en PCT WO 97/15681 para
Metabolix, Inc, y Patente US No. de serie 08/548.840. Los métodos de
procesado de biomasa de plantas se pueden diseñar basándose en las
propiedades del polímero de PHA particular o derivado que se aísla,
y basándose en el tipo de cultivo de planta y componentes de la
planta que se extrae.
El método incluye la etapa de extracción de PHA
desde la biomasa utilizando al menos un disolvente mientras se
somete simultáneamente la biomasa a un proceso de filtración para
eliminar las células.
En un modo de realización preferido del método,
la biomasa que comprende PHA (por ejemplo, una suspensión espesa de
células microbianas obtenidas por un proceso de fermentación) se
extrae directamente por modificación de un proceso de diafiltración
típico en que se utiliza un disolvente orgánico en lugar de un
diluyente acuoso. Los procesos de diafiltración convencionales son
muy conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo por Zeman
y Zidney en Microfiltration and Ultrafiltration Principles and
Aplications, Marcel Dekker, Inc, Nueva York, páginas
391-96 (1996). Durante este procedimiento
modificado, a medida que aumenta la concentración del disolvente
orgánico, el PHA se solubiliza y aparece en el eluyente que se
recoge. El PHA se recupera entonces desde el eluyente por
procedimientos convencionales que incluyen precipitación en un
no-disolvente, evaporación del disolvente o arrastre
para recuperar el PHA. El eluyente que contiene disolvente es
retenido y el disolvente se recupera por destilación u otras
técnicas muy conocidas en la especialidad.
En un modo de realización preferido del método,
la biomasa que comprende PHA (por ejemplo una suspensión espesa
acuosa de células microbianas obtenidas por un proceso de
fermentación) se extrae directamente por diafiltración utilizando un
disolvente orgánico, para obtener PHA.
El método tiene las ventajas de que (a) no es
necesario generalmente secar la biomasa antes de la extracción con
disolvente; (b) se puede fácilmente separar por fraccionamiento el
PHA de otras impurezas para obtener PHA relativamente puro en un
solo proceso, ya que la biomasa es sometida a un gradiente de
concentración de disolvente; (c) el proceso entero de extracción y
purificación de PHA de la biomasa se puede llevar a cabo utilizando
un mínimo de etapas y equipo de proceso; y (d) el método utiliza
eficazmente los disolventes, especialmente cuando la suspensión
espesa de biomasa está relativamente concentrada y cuando la
diafiltración se lleva a cabo a volumen de suspensión espesa
constante ("diafiltración a volumen constante"). Además,
utilizando disolventes orgánicos volátiles, es relativamente fácil
separar el disolvente de las soluciones de PHA y recuperar y volver
a usar el disolvente desde los filtratos generados en el proceso de
diafiltración.
En un procedimiento de diafiltración preferido,
se hace recircular una suspensión acuosa espesa de células
microbianas que comprenden PHA a través de una membrana filtrante,
teniendo la membrana un tamaño de poro lo suficientemente pequeño
para rechazar las células individuales o los agregados de células
que puedan existir en la suspensión espesa. Tiene lugar un flujo de
líquido, el eluyente que puede ser una solución acuosa, una mezcla
solución acuosa/disolvente miscible, o disolvente, desde la membrana
de filtración bajo condiciones en las que existe una caída de
presión a través de la membrana de filtración. A medida que el
líquido se separa progresivamente de la suspensión espesa de
biomasa, se añade a la suspensión espesa de biomasa un disolvente
orgánico, preferiblemente un disolvente miscible con agua que
también es un disolvente para PHA. La adición de disolvente se
deberá hacer a una velocidad que es aproximada a la velocidad de la
permeación de líquido a través del filtro con el fin de mantener el
volumen de la suspensión espesa de biomasa. A medida que aumenta la
concentración del disolvente orgánico en la suspensión espesa, se
llegan a disolver en la mezcla disolvente-agua las
diversas impurezas que son insolubles en agua y pasan a través de la
membrana del filtro. Cuando la concentración de disolvente orgánico
alcanza un cierto nivel, el PHA se hace soluble y fluye a través de
la membrana de filtración. Se separa entonces el disolvente del
filtrado que comprende PHA para recuperar el polímero.
Disolventes adecuados para extracción del PHA
desde la biomasa son cualesquiera de los disolventes miscibles
capaces de extraer el PHA. Es bien conocido en la técnica el tipo de
disolvente adecuado para extracción de las diferentes composiciones
de polímero PHA como se describe por ejemplo en las Patentes
estadounidenses números 5.821.299 y 5.942.597 para Noda; Patente
estadounidense número 6.043.063 para Kurdikar; y Patente PCT WO
97/15681 para Metabolix, Inc.
Un disolvente orgánico preferido para PHAs, tales
como poli-3-hidroxioctanoato (PHO)
u otro de los poliésteres microbianos que comprende hidroxiácidos de
C6 a C14 de longitud de cadena, es la acetona. La acetona es
adecuada también para extraer
poli-3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato.
Se pueden emplear otras cetonas y alcoholes, especialmente alcoholes
de más de C2, como se ha descrito antes. Para PHO, la solubilización
del poliéster tiene lugar a una concentración de acetona de
85-98% en agua (en volumen).
Entre los disolventes orgánicos útiles en los
métodos aquí descritos se incluyen disolventes halogenados y
disolventes no halogenados. Entre los ejemplos representativos se
incluyen disolventes seleccionados de alcoholes
R'-OH cíclicos y acíclicos (lineales y ramificados)
donde R' es igual a C_{4}-C_{10}, ésteres
R''-COOR'' cíclicos y acíclicos donde R'' es igual a
H o C_{1}-C_{6} y R''' es igual a
C_{1}-C_{7}, y ésteres
R''-COOR'' cíclicos y acíclicos donde R'' es igual a
H o C_{1}-C_{6} y R''' es igual a
C_{1}-C_{7} y donde al menos un oxígeno
sustituye a al menos un carbono en R'' ó R''', amidas
R^{1}-CON-(R^{2})_{2} cíclicas y
acíclicas donde R^{1} es igual a H ó
C_{1}-C_{6} y R_{2} es igual a
C_{1}-C_{6} y cetonas cíclicas y acíclicas
R^{3}-CO-R^{4} donde R^{3} es
igual a C_{1}-C_{6} y R^{4} es
C_{1}-C_{6}.
Entre los ejemplos específicos se incluyen
acetona, acetato de butilo, acetato de isobutilo, lactato de etilo,
acetato de isoamilo, acetato de bencilo, acetato de
2-metoxi etilo, acetato de tetrahidrofurfurilo,
propionato de propilo, propionato de butilo, propionato de pentilo,
butirato de butilo, isobutirato de isobutilo, butirato de etilo,
valerato de etilo, valerato de metilo, benzoato de bencilo, benzoato
de metilo, succinato de dimetilo, glutarato de dimetilo, adipato de
dimetilo, alcohol isobutílico, 1-butanol,
2-metil-1-butanol,
3-metil.1.butanol, 1-pentanol,
3-pentanol, alcohol amílico, alcohol alílico,
hexanol, heptanol, octanol, ciclohexanol,
2-etilhexanol, alcohol tetrahidrofurfurílico,
alcohol furfurílico, alcohol bencílico,
2-furaldehido, metil isobutil cetona, metil etil
cetona, g-butirolactona, metil
n-amil cetona,
5-metil-2-hexanona,
etilbenceno, 1,3-dimetoxibenceno, cumeno,
benzaldehido, 1,2-propanodiol,
1,2-diaminopropano, éter dietílico de etilen glicol,
1,2,3-trimetilbenceno,
1,2,4-trimetilbenceno, 1,3-dioxano,
1,4-dioxano, 1-nitropropano,
toluen-2,4-diisocianato, ácido
acético, ácido acrílico, anhidrido acético,
alfa-metil estireno, acetofenona, tolueno, diacetato
de etilen glicol, dimetil sulfóxido, dimetilacetamida, dimetil
formamida y carbonato de propileno.
Entre los disolventes que se pueden utilizar se
incluyen disolventes o mezclas de disolventes que incluyen
disolventes orgánicos clorados tales como cloroformo, cloruro de
metileno, diclorometano, dicloroetano, tricloroetano,
tetracloroetano y dicloroacetato. Por ejemplo se puede emplear
cloroformo estabilizado con hidrocarburo. También se pueden utilizar
otros disolventes para extraer PHAs de fuentes microbianas que
incluyen carbonatos de alquilo, tales como carbonato de propileno y
carbonato de etileno, trifluoroetanol, anhidrido acético,
dimetilformamida, acetoacetato de etilo, trioleína, tolueno,
dioxano, tetrahidrofurano, éter dietílico, piridina, hidroxiácidos y
alcoholes que tienen más de 3 átomos de carbono, así como mezclas de
ellos.
La recuperación del disolvente se puede llevar a
cabo por procedimientos muy conocidos por los especialistas en la
técnica que incluyen destilación o extracción en un segundo
disolvente o mezcla con disolvente que no es miscible con agua y
subsiguiente separación por destilación.
Una vez que el polímero aparece en el filtrado o
eluyente, es necesario recuperar este polímero desde el disolvente y
recuperar también el disolvente. Las técnicas para efectuarlo son
muy conocidas en la especialidad e incluyen arrastre o evaporación
del disolvente, arrastre con vapor o precipitación del disolvente
con un no-disolvente.
Las composiciones y métodos aquí descritos se
comprenderán con referencia a los siguientes ejemplos
no-limitativos.
Se sometieron a fermentación bacterias de la
especie Pseudomonas como se describe a continuación, para
producir PHA. Se adquirió ácido octanoico (Prifrac 29201) de
Unichema International, Chicago, Illinois; todos los demás productos
químicos fueron de calidad reactivo.
El Medio A contenía agua desionizada más lo
siguiente (por litro de volumen final): ácido octanoico (2,16 g;
NaNH_{4}HPO_{4} (3,8 g), K_{2}HPO_{4} (5,7 g),
KH_{2}PO_{4} (3,7 g), MgSO_{4} (0,12 g), CaCl_{2} (20 mg),
FeSO_{4}.7H_{2}O (40 mg), MnSO_{4}.H_{2}O (10 mg),
CoCl_{2}.6H_{2}O (4,5 mg), ZnSO_{4}.7H_{2}O (2 mg),
Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O (2 mg), CuCl_{2}.2H_{2}O (1 mg),
Al_{2}(SO_{4})3.16H_{2}O (1,3 mg),
H_{3}BO_{4} (465 \mug), NiSO_{4}.6H_{2}O (180 \mug),
licor de maceración de maíz (Sigma, 0,5 ml). Todos los componentes
con la excepción de ácido octanoico se esterilizaron con calor
(121.5ºC) o filtración y se pasaron asépticamente a la vasija. Se
ajustó el pH a 6,7 y se mantuvo a través de toda la fermentación a
este valor (\pm0,1 unidades de pH). El control del pH se efectuó
utilizando amoníaco acuoso al 30% (peso/peso) y ácido fosfórico al
85% (peso/peso) que se añadió según se necesitaba a través de un
controlador automático de pH. Se añadió, cuando fue necesario,
agente antiespuma (Breox FMT30 adquirido de Inspec Group,
Southampton, Reino Unido) durante la fermentación.
Se alimentó el cultivo como se describe después
con dosis de medio definidas bajo control metabólico ([DO]). Cada
dosis de medio definida consistía en tres subdosis que se añadieron
simultáneamente al cultivo a través de portillos de adición
separados. La subdosis #1 consistió en ácido octanoico (1,46 g por
litro de volumen de cultivo inicial); la subdosis #2 consistió en
amoníaco acuoso al 30% (peso/peso) (0,36 g por litro de volumen de
cultivo inicial); la subdosis #3 consistió en MgSO_{4} 0,3M (0,4
ml, por litro volumen de cultivo inicial). El tiempo requerido para
proporcionar una dosis del medio definida individual en el
fermentador era de aproximadamente dos minutos. Cada dosis de medio
antes definida proporcionaba suficiente nutrición para generar
aproximadamente 1.3 g/litro de total de sólidos.
Se puso Pseudomonas putida en cultivo
congelado y se dejó propagar sobre placas de agar al 1,5% (Medio A).
Los cultivos congelados se dejaron descongelar, se cultivaron en
placa y se dejaron crecer durante 48 horas a 30ºC. Se volvieron a
colocar en placa las colonias individuales y se dejaron crecer
durante 24 horas a 30ºC. Se seleccionaron entonces colonias
individuales y se pasaron a Medio líquido A (I litro) y se dejaron
crecer en una sacudidora durante 24 horas a 30ºC. Este segundo
cultivo se pasó entonces a un fermentador de 150 litros que contenía
el Medio A definido (60 litros) a 30ºC. El fermentador se equipó con
una sonda de [DO] individual y sonda de pH. Se dejó fermentar el
cultivo a 30ºC con agitación (velocidad de impulsor de
150-600 rpm) y aireación con aire atmosférico (60
litros/minuto) bajo una presión de cabeza de 20,7 MPa.) Se
incrementó la velocidad de agitación de forma progresiva a través
del curso de la fermentación. Se hizo el seguimiento de forma
continua de la concentración de oxígeno disuelto y se proporcionó
una dosis de medio definida como respuesta a cada incremento
sostenido (> 10 segundos), significativo (>10% de incremento
de saturación por encima de la línea de referencia prevalente) en
[DO] medida. Durante las primeras 8-9 horas de
fermentación, [DO] caía estacionariamente de 100% a casi 0% de
saturación. Después la [DO] mantenía una condición de línea de
referencia de cerca de 0% de saturación. Se controlaron las
velocidades de agitación y aireación dentro de estos intervalos para
probar a mantener una saturación de [DO] = 1%. Los incrementos
sostenidos en [DO] por encima de saturación de 10% se consideraron
el resultado del agotamiento de la fuente de carbono y se puso en
funcionamiento la adición automática de una dosis definida del
medio. La adición de cada dosis daba lugar a un decrecimiento de
[DO] hacia atrás de la condición de la línea de referencia. Sin
embargo, un mecanismo de retroalimentación evitaba adiciones de
dosis del medio definidas múltiples en el caso de que la [DO] fuera
lenta de retornar a saturación por debajo de saturación del 10%. Se
proporcionaron un total de 24 dosis del medio definidas sobre el
curso de una fermentación de 21 horas.
Inmediatamente después de concluir la anterior
fermentación, se transfirió asépticamente el cultivo a un
fermentador de 1500 litros que contenía 640 litros de Medio A
definido. El fermentador se equipó con una sonda de [DO] individual
y una sonda de pH y un analizador de masas de descarga gaseosa. La
fermentación se llevó a cabo bajo condiciones similares a las
anteriores, con una temperatura de 30ºC, agitación (velocidad del
impulsor 60-210 rpm), y aireación con aire
atmosférico (600-950 litros/minuto) bajo una presión
de cabeza de 20,7 MPa. Después de la inoculación la [DO] caía
rápidamente (en 3 horas) a casi 0% de saturación. Las velocidades de
agitación y aireación se controlaron dentro de los intervalos antes
mencionados para probar a mantener [DO] = 1% de saturación. La
fermentación se continuó durante 41 horas.
El cultivo final consistía en 750 litros que
contenían 116,7 g/l de sólidos secos, de los cuales 66,3% era PHA.
El PHA tenía la siguiente composición monomérica: ácido
R-3-hidroxihexanoico (10%), ácido
R-3-hidroxioctanoico (88%), ácido
R-3-hidroxidecanoico (2%). El
polímero aislado mostraba M_{w} = 115.000; M_{n} = 70.000
(cromatografía GPC en CHCl_{3}); T_{m} = 50ºC; y T_{g} =
-38ºC.
Se trató como sigue una suspensión espesa de
células que contenía polihidroxialcanoato (PHA) para obtener un
polímero purificado: Se hicieron fermentar células de bacterias
Pseudomonas sp. como se ha descrito en el Ejemplo 1 sobre una
mezcla comercial que comprendía principalmente ácidos octanoico y
decanoico (Ácido graso C810, Procter & Gamble, composición: 56%
C8, 39% C10, el resto otros ácidos grasos). La suspensión espesa
inicial (5 litros), que comprendía aproximadamente 13% (peso/peso)
de sólidos suspendidos, se centrifugó a 4000 g durante 20 minutos.
La fracción de aglomerado se volvió a suspender a su volumen
original en agua desionizada y luego se
re-centrifugó en idénticas condiciones. La fracción
aglomerada se re-suspendió entonces en acetona a su
volumen original. Esta suspensión espesa que comprendía material
celular, agua, y acetona (total de sólidos = 12,8% p/p) se trató
entonces utilizando el aparato experimental descrito después.
El aparato de microfiltración experimental
comprendía una bomba de tornillo excéntrico, de velocidad variable,
a prueba de explosiones (Alweiler) capaz de un flujo de al menos 15
litros/minuto frente a una presión de cabeza de 0,6 MPa; un circuito
de tuberías de acero inoxidable y polipropileno; y un alojamiento
que contenía un elemento de microfiltración tubular de cerámica de
alúmina (U.S. Filter Membralox 1T1-70,5 \mum de
intervalo nominal. Area de membrana 0,0055 m^{2}). Además, el
aparato estaba equipado con calibres de presión, sondas de
temperatura, una válvula esférica para regulación de la presión y un
depósito para la suspensión espesa cubierto de 20 litros. El nivel
del líquido en el depósito de la suspensión espesa se mantuvo
aproximadamente constante a través de la adición continua de acetona
por medio de una bomba de alimentación ajustable. Durante la
operación, la suspensión espesa se hizo circular continuamente a
través de la membrana cerámica tubular a un flujo transversal de
aproximadamente 15 litros/minuto y una presión
trans-membrana de media de 0,3-0,6
MPa. La velocidad del flujo trans-membrana variaba
desde 8- a 30 ml/minuto (90-330 litro/m^{3}/hora).
La temperatura del sistema se mantuvo a 20-32ºC por
medio de una camisa enfriada mediante glicol/agua instalada en la
cabeza de la bomba. Como resultado de la separación continua de
permeato y adición continua de acetona pura, aumentaba la
concentración de acetona en la suspensión espesa a través de la
operación.
Se recogió el permeato que comprendía
acetona/agua en una serie de fracciones. Cuando la relación de
acetona a agua en la suspensión espesa sobrepasaba un valor crítico,
de aproximadamente 9:1 (peso/peso), el copolímero de PHA se hacía
soluble y pasaba a través de una membrana cerámica. La concentración
de polímero en el permeato se ajustó al 5,8% peso/peso. Se recogió
el permeato hasta que la concentración de sólidos era <0,1%
(peso/peso). Se combinaron las fracciones que contenían PHA (14
litros) y el polímero se hizo precipitar por adición de 10%
(volumen/volumen) de agua desionizada. El concentrado del filtro
comprendía acetona, agua y esencialmente detritus de células libre
de PHA.
Claims (13)
1. Un método para aislamiento y purificación de
polihdroxialcanoatos (PHAs) derivados de biomasa que tiene PHA,
método que comprende:
extracción de PHA desde la biomasa utilizando al
menos un disolvente mientras se somete simultáneamente la biomasa a
un proceso de filtración para separar el PHA así extraído de las
células de la biomasa.
2. El método según la reivindicación 1 donde el
proceso de filtración comprende diafiltración.
3. El método según la reivindicación 2 donde la
diafiltración se lleva a cabo a volumen constante de la suspensión
espesa.
4. El método según la reivindicación 1 donde la
biomasa se somete a un gradiente de concentración de disolvente.
5. El método según la reivindicación 1 donde la
biomasa deriva de una fuente microbiana.
6. El método según la reivindicación 1 donde la
biomasa deriva de una planta o de una parte de una planta.
7. El método según la reivindicación 6 donde la
planta es una planta de semilla oleosa.
8. El método según la reivindicación 1 donde la
biomasa se proporciona como una suspensión espesa acuosa y el
disolvente es un disolvente orgánico.
9. El método según la reivindicación 8 donde el
disolvente orgánico es acetona.
10. El método según la reivindicación 8 donde la
suspensión acuosa espesa y el disolvente orgánico forma una mezcla
de disolvente-agua, método que comprende además el
aumento gradual de la concentración de disolvente orgánico en la
mezcla de disolvente-agua.
11. El método según la reivindicación 10 llevado
a cabo en una unidad de diafiltración que comprende una membrana
filtrante donde la concentración de disolvente orgánico se
incrementa para hacer que las impurezas de la biomasa que son
insolubles en agua se disuelvan en la mezcla
disolvente-agua y pasen a través de la membrana de
filtro.
12. El método según la reivindicación 11 donde la
concentración de disolvente orgánico se incrementa para hacer que el
PHA se disuelva en la mezcla disolvente-agua y pase
a través de la membrana filtrante para formar filtrato de PHA.
13. El método según la reivindicación 12 que
comprende además la separación del disolvente desde el filtrato de
PHA para recuperar el PHA.
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