MXPA06006073A - Procedimiento para recuperar polihidroxialcanoatos a partir de biomasa celular - Google Patents
Procedimiento para recuperar polihidroxialcanoatos a partir de biomasa celularInfo
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Abstract
Un procedimiento para recuperar polihidroxialcanoatos (PHAs) de biomasa celular de bacteria, dicha masa siendo obtenida a través de fermentación y en la forma de una lechada de biomasa celular en suspensión acuosa, que comprende los pasos de:someter la lechada a las operaciones de inyección del solvente PHA, agitación y calentamiento, con el fin de formar una suspensión que comprende el solvente PHA, agua, y residuos insolubles;recuperar el solvente enriquecido con PHA;rápidamente enfriar la solución del solvente PHA para precipitar el PHA disuelto;microfiltrar la suspensión de PHA precipitado en el solvente, con el fin de separar una pasta concentrada con PHA precipitado;lavar con agua, calentar y agitar la pasta de pH concentrada, para promover la evaporación el solvente y para obtener una suspensión que contiene gránulos de PHA;agitar y someter a esfuerzo cortante los gránulos de PHA y reducir el solvente residual;y separar las partículas de pH purificadas de la suspensión.
Description
PROCEDIMIENTO PARA RECUPERAR POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE BIOMASA CELULAR
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento ya probado como siendo industrialmente factible para la extracción y recuperación de polihidroxialcanoatos (PHAs) a partir de una biomasa húmeda bacterial, empleando solventes no halogenados que no son agresivos para el ambiente, cuyo procedimiento permite la obtención de polihidroxialcanoatos (PHAs) de alta pureza y alto peso molecular a través del uso de materias primas renovable y fuentes de energía, generalmente originados de la industria del azúcar y del alcohol utilizando caña de azúcar.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se conoce actualmente en la industria mundial la necesidad de producir materiales biodegradables y biocompatibles mediante el uso de materias primas renovables y fuentes de energía a través de procedimientos que no son agresivos con el ambiente. En la sociedad moderna, aunque el uso de materiales plásticos a gran escala ha representado una marca en la historia del desarrollo tecnológico, la utilización en aumento de estos materiales está conduciendo a una diversidad de serios problemas ambientales. En el caso de la industria de resinas plásticas derivadas de petroquímicos, las cantidades anuales producidas son de alrededor de 200 millones de toneladas. Estos materiales, que son muy resistentes a la degradación natural, rápidamente se acumulan en áreas de desecho principalmente alrededor de grandes centros urbanos. En vista de estos problemas, el desarrollo de resinas plásticas biodegradables han recibido una atención mundial, principalmente aquellas producidas a través de una tecnología limpia utilizando fuentes renovables. Al considerar la relevancia de estos hechos, el mercado potencial para utilizar estos nuevos materiales es enrome. Las aplicaciones de estos biopolímeros biodegradables con grandes oportunidades de éxito en los productos involucrados en el Mercado, tales como materiales desechables, por ejemplo paquetes, receptores de agroquímicos de cosméticos y tóxicos, artículos médicos y farmacéuticos, etc. Una familia importante de biopolímeros biodegradables es de
Polihidroxialcanoatos (PHAs), que son poliésteres naturalmente sintetizados a través de un gran número de seres humanos. Con más de 170 representantes descritos en la literatura, el interés comercial en los PHAs está directamente relacionado no solamente con la biodegradabilidad sino también con sus propiedades termo-mecánicas y costos de producción. De esta forma, solamente algunos PHAs han encontrado aplicación industrial, la mayor parte de los representantes siendo el PHB (poli-3-hidroxibutirato), PHB-V (poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)), P4HB (poli (4-hidroxibutirato)), P3HB4HB (poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato)) y algunos PHAmcl
(polihidroxialcanoatos de cadena media), los representantes típicos de esta última familia siendo PHHx (polihidroxihexanoato). La estructura química de los PHAs se puede describir como una cadena polimérica formada por repeticiones de la siguiente unidad:
En donde R es un grupo alquilo o alquenilo de longitud variable y m y n son enteros, en los polímeros mencionados anteriormente en R y m asumiendo los siguientes valores: PHB: R=CH3, m=1 PHB-V: R=CH3 o CH3-CH2-, m=1 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H o CH3, m=1 o 2 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1 La mayor parte de los PHAs se pueden procesar en equipos de extrusión e inyección convencionales, sin requerir modificaciones significativas para un buen procesamiento. También es posible procesar estos polímeros en sistemas de película de fundición y revestimiento para utilizarse como materiales de empaque para la industria alimenticia, por ejemplo. Como una función de la etapa de desarrollo de estos polímeros, es posible utilizarlos para producir paquetes de productos higiénicos personales de corto uso y paquetes de agroquímicos, aceites de motor, pañales desechables, y similares. Además, cuando se requiere la propiedad intrínseca de biodegradabilidad, los PHAs se aplican de acuerdo con aspectos técnicos y comerciales bien definidos, tales como: bolsas para basura, tees de golf, artículos de pesca, y otros productos directamente conectados con el manejo de materiales plásticos en al aire libre. En la agro-industria, los PHAs se pueden aplicar en macetas de plantas, tubos de reforestación, invernaderos y películas para revestimiento y principalmente para nutrientes del sistema de liberación controlado, fertilizantes, herbicidas e insecticidas. Para aplicaciones biomédicas, los PHAs se pueden utilizar para microencapsular fármacos de liberación controlada, suturas médicas y alfileres de fijación para fracturas de hueso, gracias a su biocompatibilidad total y con la pequeña reacción del organismo receptor a la presencia de un cuerpo extraño. Además, con un grado de biodegradación in vivo que es muy lenta pero continua y completa, los PHAs presentan un excelente potencial que se aplicará como una estructura básica para prótesis re-absorbibles. El gran desarrollo de las ciencias naturales en las últimas dos décadas, particularmente en biotecnología, ha permitido el uso de los organismos naturales más diferentes o genéticamente modificados en la producción comercial de PHAs. Particularmente relevante para la presente invención es el uso de estirpes bacterianas determinadas que son capaces de producir y acumular cantidades expresivas de estos polímeros en su interior. Cultivadas en condiciones específicas, que permiten alcanzar una alta densidad celular, alto contenido de polímero intracelular, y una producción compatible con el procedimiento industrial, estas estirpes bacterianas pueden utilizar diferentes materias primas renovables, tales como azúcar de caña, melazas, o extractos de celulosa hidrolizada. Aunque se han hecho intentos para aplicar las células bacterianas naturalmente (sin utilizar agentes solubilizadores de PHA) como material moldeable, tal como se describe en la Patente de E.U.A. No. 3107172, las aplicaciones comerciales de PHAs en la mayoría de los casos requiere de una suficientemente alta pureza para lograr las propiedades plásticas deseadas. Con el fin de lograr los niveles adecuados de pureza para el procesamiento del polímero, especialmente los PHAs, existen pasos normalmente requeridos en donde el uso de solventes para la extracción y recuperación del PHA a partir de biomasa residual es indispensable. En la patente EPA-01455233 A2, se describen varias posibilidades para llevar a cabo la digestió?n en una suspensión acuosa de células conteniendo PHA, utilizando enzimas y/o agentes tensioactivos para solubilizar el material celular no de PHA. Esta patente menciona como una posible restricción a los procedimientos que utilizan solvente el hecho de que requieren de grandes cantidades de solventes y por consiguiente tiene altos costos de producción. Sin embargo, menciona que el paso del solvente no se elimina, si se desea un producto de alta pureza. Además, aunque las enzimas utilizadas en este procedimiento se agregan con relación a bajas cantidades (1% en relación con el material de célula seco) son muy costosos y no se pueden recuperar en el procedimiento, contrariamente a lo que ocurre cuando se utiliza el solvente. También, la alta dilución del material celular es requerida, lo cual conduce a un alto volumen de efluentes generados en el procedimiento. Los procedimientos de extracción usualmente propuestos básicamente consistes de exponer la biomasa seca o húmeda conteniendo el biopolímero en un vigoroso contacto con un solvente que lo solubiliza, seguido por un paso en donde el residuo celular se separa. La solución conteniendo el biopolímero entonces recibe la adición de un agente de insolubilización, que induce su precipitación en el solvente (ver, por ejemplo, la patente Brasileña Pl 9103116-8 presentada el 16 de julio de 1991 y publicada el 24 de febrero de 1993. En los procedimientos de extracción a través de solventes orgánicos por lo general citados en la literatura para la extracción y recuperación de PHA de biomasa bacteriana, los solventes utilizados son hidrocarburos parcialmente halogenados, tales como cloroformo (patente de EUA-3275610), cloruro de metileno-etanol (EUA-3044942), cloroetanos y cloropropanos con un punto de ebullición en la escala de 65 a 170°C, 1 ,2-dicloroetano y 1 ,2,3-tricloropropano (patentes EP-0014490 B 1 y EP 2446859). Otros compuestos halogenados, tales como diclorometano, dicloroetano y dicloropropano se citan en las patentes de EUA 4,562,245 (1985), 4,310,684 (1982), 4,705,604 (1987) y en la patente Europea 036.699 (1981) y la patente Alemana 239.609 (1986). Los procedimientos de extracción y purificación de biopolímeros de biomasa que utilice solventes halogenados son totalmente prohibitivos hoy en día, ya que son altamente agresivos para el ambiente y la salud del ser humano. Por consiguiente, un solvente que se va a utilizar como un extractor potencial del polímero de una biomasa celular deberá primero cumplir con la condición de no ser agresivo para el ambiente. En este sentido, la patente Brasileña Pl 9302312-0 (presentada en 1993 y concedida el abril 30 del 2002) presenta un procedimiento para la extracción del biopolímero de biomasa bacteriana que utilice como solventes alcoholes de cadena alta con 3 carbonos o los acetatos derivados de los mismos. Esta patente prefiere el alcohol isoamílico (3-metil-butanol), acetatos de amilo (o éster amil-acético) y aceite de acre, una mezcla de halcones altos obtenidos común subproducto de la fermentación alcohólica y que tiene un componente principal de alcohol ¡soamílico. Esta patente también se caracteriza por el uso de un solo solvente como extractor y purificador, no requiriendo el uso de un agente insolubilizador o contra-solvente y/o no solvente marginal. La precipitación del soluto (biopolímero) de la solución PHA se lleva a cabo a través del enfriamiento de la solución. La Patente de E.U.A. No. 6,043, 063 (presentada el 14 de abril del 1998, concedida el 11 de julio del 2000) y la solicitud de patente internacional WO-98/46783 (presentada el 15 de abril de 1997) describe una lista extensiva de solventes halogenados que podrían potencialmente utilizarse como solventes para extraer el biopolímero de la biomasa, pero muchos de estos presentan características tales como manipulación industrial difícil, toxicidad, aparte del costo. En dicha lista extensiva, que también incluye los solventes citados en la patente Brasileña Pl 9302312-0, solamente un pequeño número de solventes tienen el potencial de ser industrialmente utilizados para la extracción del biopolímero de la biomasa vegetal o bacteriana, ya sea debido a problemas con respecto a la incompatibilidad con el biopolímero, o debido a su toxicidad, calidad explosivo, en el alto costo. Además, la patente Brasileña Pl 96102256, presentada en Brasil el 16 de agosto de 1996 y publicada el 6 de julio de 1999 es aún más selectiva, ya que incluye compuestos que son altamente perjudiciales para la salud humana, aparte de aceites minerales y vegetales, gas carbónico (o una tecnología de extracción super crítica y costosa) entre otras, como solventes probables útiles para extraer el biopolímero de la biomasa vegetal o bacteriana. Al mismo tiempo, la patente contempla la necesidad de evitar los solventes que son potencialmente dañinos a la salud y al ambiente. Ya que los biopolímero son sensibles al calor, es decir, cuando se someten a temperaturas por arriba de un valor determinado, se degradan irreversiblemente, perdiendo peso molecular, lo que definitivamente puede aceptar las propiedades que las caracteriza como termoplásticos, es fundamental tener en mente que la lista de solventes con un potencial para ser industrialmente utilizados cada vez se vuelve más estricta.
El potencial para el uso industrial del solvente seleccionado para promover la extracción del biopolímero se incrementará fiesta asociado con un procedimiento adecuado que permite la extracción del biopolímero sin causar alteraciones significativas en el peso molecular. Notablemente, en el caso del solvente que necesita calentarse por arriba de los 70°C para solubilizar el biopolímero, mientras más tiempo permanezca expuesto a esta temperatura durante el procesamiento, se degradará más, cuyo hecho irremediablemente dañará sus propiedades termoplásticas. La mínima alteración que PHA sufra durante el procedimiento de extracción, más amplia será la escala de sus posibles aplicaciones comerciales. Como se enseña en la literatura, los cinéticos de degradación del polímero especialmente de PHA, obedece a una reacción en el orden de cero (de por ejemplo, la tesis de la maestría: Berger, E., Elaboration des techniques de separation pour des biopolymeres d'origine bacterienne: les acides poly-p-hydroxyalcanoiques', Departement de Genie Chímique- Ecole Polytechnique-Universite de Montreal, Canadá, 1990, páginas 72-75). Considerando la relación de degradación de su peso molecular con el tiempo que se expone a una temperatura T como dMW/dt, la ecuación que define esta degradación es: (d MW / dt) T = (1 ) en donde: k: es una constante con un solvente dado a una temperatura dada T.
de esta forma, si la ecuación (1 ) está integrada para un intervalo de tiempo 0-t, se tendrá: M WT = k. t + MWo (2) en donde: MWT: es el peso molecular del biopolímero después de tiempo de extracción t, para una temperatura dada T, que ha transcurrido, en un solvente S; MWo: es el peso molecular del biopolímero contenido en la biomasa, en el tiempo t=0, antes de ser sometido al extracción; K: es una constante de la proporcionalidad para una temperatura dada T y el solvente S. A manera de ejemplo, 20 g de biomasa de Alcaligenes eutrophus seco, conteniendo 70% de PHB sobre una base seca se mezclaron con 1500 g de alcohol isoamílico (grado técnico) a 110CC, sometiendo la mezcla diferentes tiempos de extracción y filtración para remover las partículas insolubles de la biomasa. La solución de PHB obtenida después es rápidamente enfriada a 30°C para garantizar la precipitación de PHB, la cual subsiguientemente se filtra y se seca en una corriente de aire a temperatura ambiente hasta que se completa la reducción del solvente. Después, el PBH se somete a la evaluación del peso molecular a través de la técnica GPC
(Cromatografía de Penetración de Gel) para dar como resultado, después de un ajuste matemático a través de regresión lineal, la siguiente ecuación de degradación:
MWT = -9753. 81. t + 1 ,000, 000, R2 = 0.98 (3) en donde: MWT: es el peso molecular del polihidroxibutirato después de la extracción en alcohol isoamílico a 45°C, en Daltons; T: es el tiempo, en minutos, exposición del polihidroxibutirato una temperatura de extracción del 110°C en alcohol isoamílico; R: es el coeficiente de correlación de los puntos experimentales con ecuación de ajuste. Esta forma, a partir de la ecuación (3) se tendrá que el polihidroxibutirato, originalmente conteniendo un peso molecular de 1 ,000,000 Da y sometido a un extracción en alcohol isoamílico a 110°C podría dar, durante un tiempo de cinco minutos, un peso molecular de 951 ,230 Da; por 15 minutos exposición, 853,692 Da; por 30 minutos exposición, 707,410 Da; por 60 minutos, 414,771 Da; y por 90 minutos 122,230 Da. Considerando que aparte de la extracción otras operaciones tales como evaporación y secado del solvente son necesarias para obtener producto puro con buenas las propiedades mecánicas, y que estas operaciones muchas veces exponen el biopolímero a situaciones críticas con respecto al material, no es difícil imaginar las dificultades inherentes del procesamiento de este tipo de material. Además se desea que el solvente tenga un procedimiento adecuado que no degrade la característica térmica del producto.
De esta forma, para propósitos en simplificación, los solventes mencionados en la Patente de E.U.A. No. 6,043, 063 y sus respectivas temperaturas de extracción de PHA, en grados Celsius entre paréntesis, se presentan en la siguiente lista: butirato de etilo (120°C), propionato de propilo ( 8°C), acetato de butilo (120°C), propionato de butilo (123°C), acetato de tetrahidrofurfurilo (121 °C), propionato de metilo (75°C), valerato de metilo normal (115°C), 1- butanol (116°C), 2-metil-1 -butanol (117°C), 3-metil-1-butanol(125°C y 126°C), 1-pentanol (125°C y 126°C), 3-pentanol (115°C), alcohol amílico (128°C), 1- hexanol (134°C), diacetato de alcohol etilénico (137°C), 1- hexanol (134°C), diacetato de glicol etilénico (137°C), alcohol tetrahidrofurfurílico (117°C), metil- amil-cetona (120°C), metil-isobutil-cetona (115°C), acetofenona (110°C), 1 ,2- diaminopropano (115°C), alfa-metilestireno (126°C), sulfóxido de dimetilo (117°C), carbonato de propileno (110°C), 1 ,2,3-trimetil-benceno (120°C), acetamida de dimetilo (90°C) y dimetilformamida (90°C). Esto solventes tendrán un potencial para ser industrialmente utilizados si están asociados con procedimientos efectivos en donde ocurre muy poca exposición del biopolímero a la degradación térmica. Sin embargo, no se hace mención a las propiedades de los materiales obtenidos, especialmente aquéllas que se refieren al peso molecular del producto. Otro hecho relevante con respecto a la viabilidad industrial de este modo de extracción PHA es que, ya que es un procedimiento de alto consumo de energía, deberá tenerse en mente que la viabilidad del producto también está íntimamente relacionada con una fuente de energía renovable a bajo costo. Considerando todos los factores mencionados anteriormente, en general las propiedades de biodegradabilidad continuidad de los PHAs, ante pueden justificar precios más altos que aquellos en los primeros tradicionales de la industria petroquímica, la posibilidad de que el mercado asimile estos precios están muy limitada (Braunegg G, Lefebvre G, Genser FK (1998) Polyhydoxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and engineering aspects. J. Biotech. 65: 127-161 ). Esta forma, los procedimientos industriales para producir PHAs deberán contemplar: estirpes de microorganismos que presentan una alta eficiencia en la conversión de la materia prima en polímero, con un simple y eficiente protocolo de producción; materias primas a bajo costo y alto rendimiento; un procedimiento de extracción y purificación del polímero que permite la obtención de un producto de alta pureza, conservando al máximo las características originales del biopolímero, con un alto rendimiento y eficiencia y a través de procedimientos que no son agresivos para el ambiente. Aparte de estos aspectos económicos, ya que es un producto amigable para el ambiente, el procedimiento completo del mismo deberá ser compatible. Esta forma, el uso de productos dañinos ambientalmente en cualquier paso de producción deberán ser evitados. Además, la fuente de energía utilizada para correr el procedimiento de producción deberá venir en una fuente renovable. No tiene sentido producir un plástico de un bajo impacto ambiental si solamente se utilizan fuentes de energía no renovables. Un método bastante interesante a este problema este de la cadena productiva completa del bioplástico incorporado a través de la agro-industria, en particular la industria del azúcar y del alcohol (Nonato, R. V., Mantelatto, P. E., Rossell, C. E. V., "Integrated Production of Biodegradable Plástic (PHB), Sugar and Ethanol", Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:1-5, 2001). Uno de los mayores éxitos a nivel mundial en la producción de combustibles alternativos es la industria del azúcar y el alcohol en Brasil, que es responsable de alrededor del 25% de la cantidad total de alcohol y azúcar producidos en el planeta. Ya que se presenta una imagen ambientalmente negativa al inicio del programa brasileño PROÁLCOOL, este tipo de industria actualmente es un ejemplo de tecnología soportable. Toda energía requerida para correr un procedimiento de producción se genera en el lugar, quemando los bagazos de la caña de azúcar en calderas para producir energía térmica y eléctrica. Además, existe exceso de energía que se puede utilizar en otros procedimientos industriales incorporados. Una energía renovable llegar hasta aliada con la disponibilidad de material prima barata, tal como el azúcar y las molazas y los solventes naturales obtenidos como subproductos de la fermentación alcohólica convierte a la industria del azúcar y el alcohol en la una ideal para la producción de bioplásticos.
Por consiguiente, la presente invención abarca todas las características citadas anteriormente que son necesarias para hacer viable un procedimiento industrial para recuperar polihidroxialcanoatos (PHAs), preferiblemente de biomasa bacteriana húmeda, estando solventes no halogenados y no son agresivos para el ambiente, generando un producto de alta pureza y alto peso molecular, a través del uso de materia prima renovable y fuentes de energía de la industria del azúcar y el alcohol utilizando caña de azúcar.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento, ya probado como siendo industrialmente factible para el extracción y recuperación de polihidroxialcanoatos (PHAs), de biomasa celular bacteriana, obtenida través de la fermentación y en la forma de una lechada del biomasa celular en suspensión acuosa y con un contenido de material celular seco no inferior a aproximadamente 18% en peso la suspensión. En una posible forma de llevar acabo la invención, la biomasa celular concentrada se obtiene sometiendo la biomasa celular, en suspensión en el medio de cultivo fermentado, operaciones de floculación y concentración de células de biomasa. De acuerdo con ei procedimiento, la biomasa celular concentrada inicialmente se somete al paso de extracción de PHA, el cual comprende operaciones concomitantes de inyección de solvente PHA, agitación vigorosa y rápido calentamiento el interior de un reactor, con el fin de formar una suspensión que comprende el solvente PHA enriquecido con PHA disuelto, quedando agua de la lechada de la biomasa celular y vestidos insolubles de biomasa celular concentrada. La suspensión formada en el reactor entonces se somete a una separación, para recuperar el solvente enriquecido con PHA disuelto, de los residuos insolubles restantes de la biomasa celular. Entonces, la solución del solvente PHA enriquecida con PHA rápidamente se enfría una temperatura que es suficiente para precipitar substancialmente todo el PHA disuelto. El procedimiento presente además comprende los pasos de: - microfiltrar en frío la suspensión de PHA precipitado en el solvente PHA conteniendo agua e impurezas disueltas ahí, con el fin de separar una pasta concentrada de PHA precipitado; - someter la pasta de PHA concentrada a operaciones simultáneas de lavado con agua, calentamiento y agitación, con el fin de promover la evaporación de parte de una cierta cantidad el solvente, es adecuada para tener una suspensión conteniendo granulos de PHA provistos con una alta porosidad y que son frágiles y el solvente del agua restantes pueden fácilmente someterse a esfuerzo cortante; - someter los granulos de PHA lavados calentados a agitación y esfuerzo cortante, una fácilmente cortar los mientras se lleva a cabo el procesamiento de extracción del solvente residual a través de inyección de vapor de agua en la suspensión conteniendo el solvente y agua restantes, con el fin de obtener partículas PHA purificadas en la suspensión; y - separar las partículas de PHA purificadas de la suspensión. Aparte de los PHAs encontrados, aquellos con aplicabilidad industrial y utilizados en la presente invención son: poli-3-hidroxibutirato (PHB), poli(hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV), y mezclas de estos polímeros y copolímeros.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La invención se describirá continuación, con referencia a la figura 1 anexa, dada a manera de ejemplo de una posible forma de llevar acabo inven?ión, que es una gráfica de flujo simplificada de dicho procedimiento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se describirá continuación una lista de las definiciones de los términos utilizados en la descripción de la presente invención: "Alquenilo" significa una cadena carbónica insaturada, de C1 a Cn, en donde n varía de 2 a aproximadamente 20, cuya cadena carbónica puede ser lineal, ramificada o cíclica y la insaturación puede ser monoinsaturada, es decir, con un enlace doble o triple la cadena carbónica; o poliinsaturada, es decir, con dos o más enlaces dobles o con dos o más enlaces triples en la cadena carbónica. "Alquilo" significa una cadena carbónica saturada, de C1 a Cn, en donde n varía de 2 a aproximadamente 20, cuya cadena carbónica puede ser recta, ramificada o cíclica. "Biomasa celular" significa cualquier biomasa que viene de cualquier microorganismo o planta, que es capaz de producir PHA naturalmente o a través de modificación genética, con el fin de convertirla en un productor de PHA o un productor de PHA alto. "Comprende" o "que comprende" significa que se pueden adicionar un estar presentes otros pasos, u otras etapas, u otros compuestos, u otros ingredientes, que no afectan el resultado final. Este término también está sustituido por, o sustituir los términos: "constituido de", "constituido por" "esencialmente constituido de" y "esencialmente constituido por". "Da" significa Dalton, la unidad para la medición del peso molecular de los polímeros. "Para extraer polihidroxialcanoatos de una biomasa" o "Extracción de polihidroxialcanoatos de una biomasa" significa extraer con la extracción de un PHA determinado producido a través de una biomasa que produce un solo tipo de PHA, y adicionalmente también puede significar extraer o la extracción de más de un tipo de PHA producido a través de una biomasa, para situaciones en donde la biomasa que produce PHA, produce más de un solamente un tipo de PHA.
"Extracto abrasivo" significa la suspensión constituido por el solvente PHA enriquecido con PHA extraído de masa celular PHA conteniendo, disuelta ahí, agua e impurezas extraídas de la masa celular, y a través de sólidos insolubles, que son el residuo de la biomasa celular aparte de la fase las el PHA. "Polihidroxialcanoatos" y "PHA" significa un polímeros que abarca la siguiente unidad de repetición:
Cuando R es preferentemente el H puede radicar alquilo o el radical alquenilo y m varía de 1 a 4. "Substancialmente presión atmosférica" significa una presión muy cercana al atmosférica, es decir, igual o ligeramente superior o inferior a la presión atmosférica. "Reactor de extracción" significa el equipo en el cual se procesa la operación de extracción de PHA a partir de la biomasa celular productora de PHA. "Medios para rápidamente enfriar una corriente (solución no suspensión)" significa: enfriar esta corriente (solución o suspensión) en algunos segundos, a través de expansión, a través de intercambio calor con otra corriente enfriadora y/o enfriar por medio de intercambiadores de calor.
"Solvente" significa una sustancia capaz de disolver otra sustancia denominada soluto, con el fin de formar una mezcla denominada solución, de un soluto uniformemente disperso en el solvente, con respecto al tamaño molecular o tamaño iónico. "Solvente PHA" significa una sustancia capaz de disolver polihidroxialcanoatos. "Solvente PHA enriquecido" o "solución del solvente PHA enriquecida" significa una solución de solvente PHA que contiene PHA extraído de biomasa celular productora de PHA. "Virtualmente libre de" o "prácticamente libre de" significa "que tiene una cantidad muy pequeña de" o "tener la presencia de rastros de" o "tener una cantidad no significativa" o "tener una cantidad casi imperceptible de". La presente invención está relacionada con un procedimiento, ya probados para ser industrialmente factible, para la extracción y recuperación de polihidroxialcanoatos(PHAs), preferiblemente de biomasa húmeda (diluida en agua) de microorganismos, utilizando solventes no halogenados que no son agresivos para el ambiente, permitiendo la obtención de polihidroxialcanoatos de alta pureza y peso molecular alto, a través del uso materias primas y fuentes de energía renovables de la industria del azúcar y el alcohol utilizando caña de azúcar. Existe un número relativamente grande de publicaciones que describen extracción de PHA por medio de solventes no halogenados de microorganismos o biomasa vegetal. Sin embargo, cuando se desean aplicar las enseñanzas aún escala comercial, existe una gran dificultad en la obtención de un producto en donde las propiedades originales del biopolímero entre celular se conservan, cuyas características la mayor parte del tiempo son fundamentales para elaborar productos comerciales. Se observa que la mayor parte de dichas publicaciones, se le da poca atención a la termo- sensibilidad del producto a altas temperaturas. La mayor parte de los solventes no halogenados considerados como candidatos para ser utilizados en extracción PHA presentan una baja solubilidad a este soluto y requieren de altas temperaturas, normalmente por arriba de 70°C, para la extracción y recuperación de PHA. Cuando se desean procesar la extracción de PHA con dichos solventes a escala comercial, los tiempos necesarios para recuperar el PHA son usualmente demasiado largos, degradándolo térmicamente en una forma irreversible. En producto así obtenido, dependiendo del tiempo de exposición alta temperatura, se restringe a un número muy limitado de aplicaciones en la industria, o para cualquier otro tipo de aplicación. La presente invención provee un procedimiento que se llevará a cabo a escala industrial, en donde los pasos de procedimiento se combinan de tal forma que permiten: a) minimizar el tiempo de exposición de la mayor parte del PHA extraído de la biomasa celular a altas temperaturas, utilizando solventes no halogenados, permitiendo minimizar su degradación, con el fin de conservar al máximo sus propiedades originales, especialmente su peso molecular;
b) obtener un producto de alta pureza, normalmente superior al 99%, conservando el color natural del biopolímero y con la ausencia natural del solvente residual, sin necesidad de incluir en el procedimiento pasos adicionales específicos de decoloración y purificación del PHA producido; c) obtener un alto nivel de PHA recuperado de la biomasa, normalmente superior a 90%; d) utilizar, en una forma integrada, materia prima y fuentes energía renovables originadas de la industria del azúcar y el alcohol, de esta forma incrementando las utilidades para los grupos industriales que produce azúcar y alcohol. Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a PHAs producidos a través de microorganismos o plantas naturales o genéticamente modificados, o para PHAs sintéticamente producidos. PHA es un polímeros constituido por repeticiones de la siguiente unidad:
En donde R es un grupo alquilo o alquenilo de longitud variable y m y n son enteros, en los polímeros mencionados anteriormente R y m asumiendo los siguientes valores: PHB: R=CH3, m=1 PHB-V: R=CH3 or CH3-CH2-, m=1 P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H or CH3, m=1 o 2 PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1 Esta invención se aplica a PHAs recuperados de biomasa de microorganismos, preferiblemente a PHB (poli-3- hidroxibutirato), PHB-V (poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)), P4HB (poli-4-hidroxibutirato),
P3HB4HB (poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) ) y algunos PHAmcl (polihidroxialcanoatos de cadena media), el representante típico de esta última familia siendo PHHx (polihidroxihexanoato). Procedimiento para la extracción de PHAs a través del uso de solventes no halogenados, un corto tiempo de exposición del biopolímero a una condición del degradación térmica. La presente invención se refiere a un procedimiento, ilustrado en la Figura 1 , se utiliza un material fermentado de biomasa celular bacteriana, obtenido a través de la fermentación y en la forma de una lechada de biomasa en suspensión acuosa y teniendo un contenido celular seco no menor de aproximadamente 18% en peso. De acuerdo con la presente invención, la lechada concentrada formada de la biomasa celular se puede obtener directamente de una fermentación que puede lograr la concentración mínima necesaria del material seco, o a través del sometimiento de la biomasa celular en suspensión en el medio de cultivo fermentado para las operaciones de floculación y concentración de las células de biomasa.
En una forma preferida de la invención, la biomasa celular en suspensión acuosa que se va a suministrar al procedimiento además se puede diluir en agua, para así presentar una relación de agua/masa de material fermentado con un máximo de 3.0:1.0. En otra forma de llevar a cabo la invención, la biomasa celular bacteriana obtenida a través de fermentación que se va procesar puede ser previamente térmicamente desactivada. En otra forma preferida de llevar a cabo la invención, las operaciones de floculación comprenden un paso de coagular la biomasa celular efectuada través de la acidificación de la biomasa celular diluida aún pH de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 5.5, así, través de la adición de un agente de alcalización hasta que se alcance un pH de aproximadamente 7 aproximadamente 12, la operación de floculación de las células de biomasa conteniendo PHA acumulado siendo efectuada través de la adición de un agente de floculación. La acidificación de la biomasa celular diluida en agua se puede obtener a través de la adición de un ácido definido por al menos uno de ácido sulfúrico y fosfórico. El agente de alcalización puede comprender hidróxido del calcio. En otra forma preferida de llevar a cabo la invención, la acidificación de la biomasa celular diluida se efectúa para así obtener un pH de aproximadamente 2.0 a aproximadamente3.0 y la adición del agente de alcalización se hace para ajustar el pH de la suspensión de la biomasa celular diluida aún escala de aproximadamente 7 a aproximadamente 12.
La adición secuencial de dichos elementos en el paso de floculación permite la formación de fosfatos del calcio, que forman puentes con las paredes celulares del microorganismo conteniendo el PHA, con una carga positiva resultante y que se agregan en una escama a través del agente de floculación, conduciendo la formación de una escama estable presentando una densidad más alta que aquella de líquido que las involucra. Se debe entender que el paso de coagulación de la biomasa celular bacteriana en suspensión en el medio de cultivo fermentado también se podría llevar a cabo a través de la adición de solamente el agente a alcalización, hasta que se alcance un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 12, la floculación de la biomasa celular conteniendo PHA acumulado siendo llevada cabo a través de la adición del agente de floculación, como se mencionó anteriormente. Las escamas formadas conteniendo las células con PHA acumulado entonces fácilmente se separan del medio de cultivo líquido fermentado circundante conteniendo las impurezas originadas de la fermentación, por medio de la acción de la fuerza gravitacional, utilizando por ejemplo decantadores estáticos o fuerza centrifuga, en pleno por ejemplo en este caso centrífugos o decantadores. Cuando la opción es utilizar centrífugos o decantadores, el efluente aclarado se puede tratar otra vez con ácido y base, flocularse, someterse decantación y con la lechada concentrada obtenida siendo enviada al paso subsiguiente junto con otra parte obtenida en las centrífugos o decantadores. De esta forma, el procedimiento permite, en las formas preferidas de la invención en donde ocurre la floculación de la biomasa, promover la remoción parcial de las impurezas extracelulares disueltas en el medio de cultivo fermentado, a través de la separación de las escamas de la misma, removiendo principalmente los elementos de color y otros sales solubles que son perjudiciales para los siguientes pasos de procesamiento. El procedimiento además permite la formación de una lechada de biomasa concentrada conteniendo escamas estables y con una densidad que se incrementa con relación al líquido y las involucra. En otra forma preferida de la invención, la biomasa celular floculada se somete a un procedimiento de concentración y lavado, dando como resultado una lechada del biomasa concentrada el escala de 18-45% (peso/peso), más preferiblemente 25-45%. La biomasa húmeda concentrada entonces se somete a la extracción del PHA intracelular mediante la inyección del solvente PHA preferiblemente en la forma de líquido calentado y la forma de vapor, bajo agitación vigorosa en un reactor, con el fin de rápidamente provocar el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura entre aproximadamente 90°C y temperatura de ebullición del solvente (sustancialmente a la presión atmosférica), y para formar: una fase líquida que comprenden solvente PHA enriquecido con PHA y el agua restante de la lechada del biomasa celular; una fase sólida definida por los residuos insolubles de la biomasa celular residual; una fase de vapor conteniendo los vapores de agua y los solventes de pH. Los vapores del agua y del solvente PHA se condensan y se separan en dos fase líquidas: una fase rica y solvente, que regresa al procedimiento en la fase de extracción y recuperación de pH; y una fase pobre en solvente, que se recircula en el procedimiento para permitir la recuperación del solvente PHA contenido ahí. Este procedimiento, además de calentar la biomasa celular, también promueve el efecto de remover la mayor parte de la suministrar una lechada en la forma de un vapor, las cuales una mezcla binaria constituida del solvente PHA y agua. Después, la fase de vapor se puede traer el reactor que se va condensar después, dejando atrás una suspensión que contiene una solución del solvente PHA enriquecido con PHA y una pequeña fracción del agua disuelta en el solvente, además de residuos insolubles de la biomasa celular extraída. De esta forma, a manera de ejemplo, los solventes de PHA se pueden seleccionar del grupo de solventes inconsistente: acetato de butilo, acetato de isobutilo, acetato de amilo, acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, 1 -butanol, 1-pentanol (alcohol metílico), 2-metil-1 -butanol, 3-metil-1-butanol (alcohol isoamílico), 3-pentanoI, 1 -hexanol, ciclohexanol, propionato de propilo, propionato de butilo, propionato de isobutilo, butirato de etilo, isobutirato de isobutilo, mezclas de los mismos. Preferiblemente, el solvente puede ser alcohol isoamílico, o mezclas isoméricas de alcohol isoamílico, más preferiblemente el alcohol isoamílico se puede obtener del fraccionamiento del aceite de acre como un subproducto de la fermentación de etanol, el aceite de acre principalmente consistiendo de alcohol isoamílico y sombras del mismo, aparte de impurezas, tales como: etanol, n-propanol, isobutanol, n-butanol y agua. El contacto entre el solvente de extracción y la biomasa celular
PHA se promueven condiciones controladas y a través de un sistema de agitación que se dimensiona para permitir contacto vigoroso entre las partes, y para garantizar un residuo de biomasa ¡nsoluble con un tamaño de partícula uniforme, que facilita las subsecuentes operaciones. Como se ilustra la Figura 1 , la corriente obtenida, aquí denominada como corriente F consistiendo de la suspensión conteniendo
PHA y agua disueltas en el solvente y a través de residuos insolubles de biomasa, en una forma preferida de la invención entonces se alimenta en un elemento separador centrífugo, por ejemplo un hidrociclón, en el cual la aplicación de una fuerza centrifuga a baja intensidad (algunas veces la fuerza gravitacional) conduce a la generación de los corrientes: una corriente que consiste de una suspensión, la concentración de sólidos insolubles residuales de biomasa en una solución conteniendo PHA y una pequeña fracción de agua disuelta en un solvente PHA, aquí denominada corriente O, y la otra corriente conteniendo una suspensión con residuos insolubles de biomasa concentrados en una solución conteniendo PHA y una pequeña fracción de agua disuelta, aquí denominada corriente U. la separación de las los corrientes que fluyen a partir del elemento de separación centrífugo se hace para que la corriente U sea de aproximadamente 15-35% (peso/peso) de la corriente F y contiene aproximadamente 55-75% (peso/peso) de los sólidos originalmente presentes en la corriente F y además conteniendo una fracción del PHA intracelular que se va a recuperar. La separación de estas dos corrientes como se describe aquí y se lleva a cabo bajo un efecto de una fuerza centrifuga a baja intensidad en equipos estáticos, resistentes y de bajo costo tales como los hidrociclones por ejemplo, dispensan el uso de centrífugos mecánicos de alto costo que podrían requerir el uso de atmósferas de gas inerte, como la función de los límites de la calidad explosión e inflamabilidad de los solventes PHA. La separación se asegura aquí a través de una densidad más alta de las partículas de los sólidos insolubles residuales con relación al solvente que las involucra, el cual se imparte a través de acumulación inicial en donde las partículas pesadas, tales como aquellas de fosfato de calcio, se enlazan las células que contienen PHA intracelular y constituyentes de la biomasa celular. Otro efecto importante es la capacidad del sistema de extracción para producir partículas con una distribución granulométrica uniforme durante la extracción, io cual asegura una alta eficiencia en la separación y concentración de los sólidos conteniendo el PHA intracelular no extraído, sobre la utilización de un elemento de separación centrífugo de baja densidad.
Opcionalmente, la corriente O se puede someter a un procedimiento de micro filtración de membrana codificación en filtros pre- recubiertos, en donde las los corriente generan: una corriente P, que penetra través de la membrana, y una corriente C de concentrado de membrana. La corriente P entre aproximadamente 50%-90% (peso/peso) de la corriente O esta libre de sólidos insolubles y contienen PHA, agua y pequeña fracciones de cenizas y compuestos de color disueltas en el solvente PHA, siendo inmediatamente enfriados a una temperatura de alrededor de 45°C o menor. La corriente C ese aproximadamente 10-50% de la corriente O, está concentrada con relación a la concentración de los residuos sólidos de la biomasa extraída aproximadamente de 2-10 veces el contenido original de estos sólidos en la corriente O y contiene una fracción de PHA, agua, cenizas, y compuestos de color disueltas en el solvente PHA. Opcionalmente, la corriente U y la corriente c, están concentradas en residuos insolubles de biomasa extraída y pobre en PHA, se pueden enlazar y enviara un procedimiento recuperación del PHA restante disueltos en el solvente PHA, a través de un procedimiento de separación, por ejemplo, través de filtración, en donde la corriente filtrada (denominada F1 ) se genera conteniendo PHA, agua, cenizas, compuestos de color, disueltos en el solvente PHA, y una harina final, aquí denominada T, conteniendo los sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. Opcionalmente, la corriente U, la corriente C la nueva cantidad de solvente PHA en la forma de líquido y una forma de vapor, se pueden mezclar otra vez incondicional de filtración adecuadas, de esta forma formando una nueva corriente que se someterá otra vez al procedimiento previamente descrito. De esta forma, en efluente final resultante, concentrado en residuos insolubles de biomasa celular extraída y pobre en PHA, finalmente se somete al procedimiento recuperación del PHA restante, disueltos en el solvente PHA a través del procedimiento de separación, por ejemplo través de filtración. El procedimiento de extracción descrito comprende un número de pasos de tal forma que permite la recuperación de cantidades más altas de aproximadamente 95% (peso/peso) del PHA originalmente contenido en la biomasa, con tiempos retención más cortos de aproximadamente 10-20 minutos, con el fin de obtener un PHA que presenta un peso molecular mínimo de aproximadamente 850,000 Da de una elección de biomasa que contienen PHA con un peso molecular con un mínimo de aproximadamente 850,000 Da. Aún opcionalmente, la corriente O que contienen los sólidos insolubles restantes del procedimiento efectuado del elemento de separación centrífugo (por ejemplo, un hidrociclón), se puede enviar a un procedimiento para separar los sólidos insolubles, sin estar sometido a un procedimiento de micro-filtración de membrana, de esta forma obteniendo una corriente de filtrada conteniendo PHA disuelto en el solvente y libre de cualquier sólido insolubles de la biomasa y dejando atrás una harina conteniendo dichas impurezas ¡nsolubles. El PHA así recuperado en un peso molecular ligeramente más bajo que aquel obtenido a través de la micro-filtración de membrana. En la forma preferida de la invención, la corriente F de extracto un abrasivo conteniendo los residuos insolubles de biomasa extraída también se pueden enviar directamente al procedimiento de recuperación del PHA disuelto en el solvente PHA, sin pasar a través del elemento de separación centrífugo y la micro-filtración de membrana; en este caso, con relación a la opción previa, el PHA presenta una calidad similar en un peso molecular está ligeramente reducido debido al tiempo de retención más largo del polímero resultante del procedimiento de separación de los sólidos insolubles. La corriente P la corriente F1 descritas anteriormente, liberadas de los residuos insolubles de la biomasa celular y conteniendo PHA, agua, cenizas, y algunos compuestos de color disueltos en el solvente PHA, una vez que son rápidamente enfriados a temperaturas alrededor de 45°C o menores, originan la precipitación de PHA, formando una suspensión cuyo peso molecular está al mínimo a aproximadamente 750,000 Da, partiendo de una lechada de biomasa que contienen PHA con un peso molecular a un mínimo de alrededor de 1,000,000 Da. Esta precipitación además puede auxiliarse a través de la introducción de un germen de cristalización. La suspensión de PHA en un solvente PHA obtenido a través de precipitación mediante enfriamiento, conteniendo agua disueltas ahí, cenizas y compuestos de color disueltos, entonces se somete al procedimiento de separación, preferiblemente a través de membranas polémicas microporosas.
Este procedimiento permite la obtención de una corriente PE de filtración, que es de aproximadamente 60%-90% de alimentación de flujo de masa a la membrana, comprendiendo el solvente PHA, agua, cenizas solubles, y compuestos de color disueltos en el solvente PHA y virtualmente libre de PHA; y otra corriente, de aproximadamente 40%-10% de la corriente de alimentación, que consiste de una suspensión de PHA concentrada, y una fracción de cenizas y compuestos disueltos en el solvente PHA. Este paso, tal como se describe en esta invención, aparte permitir concentrar la suspensión PHA a una concentración de hasta 3.5-8% (peso/peso) en condiciones que son altamente favorables para conservación del peso molecular de PHA y un procedimiento que emplea una temperatura que está cerca de temperatura ambiente y a través de medios físicos (membranas), además conduce a la eliminación simultánea, a través de medios de penetración, de aproximadamente 70%-90% de las impurezas disueltas, que eran los constituyentes de la suspensión PHA. La suspensión previamente concentrada con PHA, con la concentración de PHA en escala de 3.5%-810%(peso/peso) (y definida a través de la corriente S en la Figura 1, entonces se somete a un paso de concentración por medio de evaporación, a presión atmosférica, y preferencialmente en múltiples efectos de vacío, en donde simultáneamente se alimentan de la suspensión PHA y una corriente de agua débil AF, recuperado en el procedimiento y conteniendo el solvente PHA disuelto ahí. Esta agua débil se alimenta en los evaporadores en una proporción tal que permite la obtención de una suspensión básicamente conteniendo PHA, solvente PHA y agua, formando aglomerados de granulos de PHA presentando alta porosidad, en una aglomeración frágil y que puede ser fácilmente sometida esfuerzo cortante. Esta suspensión entonces se somete simultáneamente con evaporación a un procedimiento de pulverización en un elemento de esfuerzo cortante mecánico, por ejemplo una bomba centrífuga de circulación, en donde las aglomerados de los granulos PHA, con alta porosidad y fragilidad, son rápidamente adecuadamente rotos, por el fin de obtener una suspensión de partículas de PHA mucho más finas, las cuales se pueden lavar abundantemente durante el procedimiento de evaporación del solvente PHA. Esta suspensión, a la cual se agrega una corriente de agua débil (AF1), entonces se somete a evaporación del solvente residual final (disolución), hasta que se extrae completamente de líquido restante (licor madre), una vez que se inyecta bajo mínimo simultáneamente con la recirculación de la suspensión obtenida en el paso anterior. A repetir el procedimiento de esfuerzo cortante durante la evaporación, es posible obtener una pulverización controlada de PHA hasta que se convierten en polvo suspensión en líquido restante libre de solvente. Esta forma, al final del procedimiento, se obtiene una suspensión de partículas PHA finamente disfrazadas en el líquido restante (licor madre), que a su vez contiene disueltas ahí las impurezas removidos de PHA. Esta suspensión entonces enfría rápidamente a alrededor de 45°C o menos y se somete a un procedimiento de separación de sólidos de líquido, por ejemplo a través de filtración, y enjuagando las tortas filtrada con agua fresca, conteniendo las partículas de PHA. De esta forma, los pasos finales de la evaporación, disolución, enfriamiento y filtración permiten, al mismo tiempo en el que la evaporación se está llevando a cabo, efectúa la reducción del solvente PHA a partir del medio y la purificación final de las partículas PHA sin daños al peso molecular de PHA. Además, también permite obtener partículas una distribución granulométrica, que es adecuada para el procedimiento de secado, en escala de 40-400 µm, y preferiblemente a alrededor de 100-200 µm, con el fin de permitir el uso de condiciones de secado leves, es decir, el PHA se somete a temperaturas moderadas y un corto tiempo de retención. El biopolímero de PHA obtenido después del paso de secado presenta un alto nivel de pureza, extremadamente bajos niveles de solvente residual, color, cenizas impurezas, y un alto rendimiento global, es decir, una cantidad de PHA recuperado con relación al PHA contenido en la biomasa original más alta de aproximadamente 90% (peso/peso).
EJEMPLOS
EJEMPLO 1.1 Inactivación de biomasa fermentada
10m3 de una suspensión de biomasa cementada de Alcaligenes eutrophus, conteniendo150 g/l del material seco total, formado a través de células bacterianas conteniendo alrededor de 60-75% de PHB por peso, se hicieron pasar a través de un intercambiador del calor regenerativo TCR1 o una velocidad de flujo de 4m3/hora, subsecuentemente recibiendo inyección directa de vapor, con el fin de incrementar la temperatura a 85°C. Esta suspensión se llevó a un recipiente de retención con un volumen útil de Im3 y se bombeó de regreso al intercambiador TCR-1 , en donde se en frío mediante la suspensión de biomasa, la cual entra en el procedimiento de su vez calentada. La suspensión de biomasa, que deja el procedimiento a aproximadamente través de 45°C, mantiene prácticamente invariables las concentraciones de material seco y PHB. Sin embargo, las células bacterianas ahora tienen su sistema enzimático inactivado, y por consiguiente son incapaces de degradar el PHB enzimático. Esta suspensión entonces se conduce al procedimiento de coagulación y decantación.
EJEMPLO 1.2 Lavado y concentración de biomasa fermentada
A 5m3 de la biomasa fermentada PHB previamente inactivada de Alcaligenes eutrophus, se agregaron 5m3 de agua bajo agitación leve, y después ha sido fosfórico, hasta que se alcanzó un pH de 2.8-3.5, y leche de Lima hasta que se alcanzó un pH de 7.0-8.0. La suspensión de biomasa formulada entonces recibe la adición de 10-20 ppm de un polielectrolito aniónico, siendo lentamente agitado y después mantenido bajo reposo para la decantación. Entonces ser removido el sobrenadante, dejando una lechada de biomasa con aproximadamente 10-12% de material seco. La lechada obtenida entonces se alimenta en un decantador centrífugo a una velocidad de flujo de aproximadamente 1200 kg/hora y después además recibe la adición de polielectrolito, en una cantidad suficiente para flocular, y agua en una proporción de aproximadamente 20% (peso/peso) de la velocidad de flujo de lechada de alimentación. El material aclarado entonces se remueve, generando alrededor de 2400 kg de lechada con aproximadamente 20-25% de sólidos de los cuales 70-75% corresponden a PHB.
EJEMPLO 1.3.1 Extracción y recuperación de PHB utilizando alcohol isoamílico como solvente en un extracción de una etapa
La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrada a 25% del material seco y conteniendo alrededor de60-75% de PHB con un peso molecular de 1.000.000 Da se alimentó en un reactor agitado mecánicamente, mantenido alrededor de 105°C o una velocidad de flujo de 350-450kg/hora, en el cual recibe la. adición de 7290 kg/hora de alcohol isoamílico calentado a aproximadamente 105°C y vapor de alcohol isoamílico a 135°C, en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenido en la lechada, generando una corriente de aproximadamente 1250kg/hora de vapor compuesto de aproximadamente 15% de agua y 85% de alcohol isoamílico, y otra corriente denominada extracto de abrasivo de aproximadamente 8000kg/hora de una suspensión conteniendo PHB (peso molecular de aproximadamente 900,000 Da) y agua disuelta en el alcohol isoamílico, y residuos insolubles de biomasa extraída. El extracto activo entonces se alimenta en hidrociclón, en donde el flujo se separa en dos corrientes: una corriente de aproximadamente 75% de la velocidad de flujo de alimentación en la porción superior y conteniendo alrededor 65% de los sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la porción inferior de aproximadamente 25% del flujo de alimentación y conteniendo 75% de los sólidos insolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior del hidrociclón, pobre en sólidos insolubles, entonces se alimenta a una unidad de micro-filtración de membrana una velocidad de flujo de 6000kg/oradora, generando una corriente de aproximadamente 1500kg/oradora (1/4) concentrada en sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y una corriente de penetración de 4500kg/oradora (3/4) libre de sólidos informes residuales del además extraída y enriquecida con PHB con un peso molecular en escala de 800,000-880,000 Da. El tiempo de retención en el procedimiento es de aproximadamente 3-10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a un paso de filtración por ejemplo en un filtro de placa, o una velocidad de flujo de 2000kg/oradora, generando una corriente de aproximadamente 1800kg/oradora, que es una solución PHB libre de sólidos insolubles en suspensión enriquecida con PHB con un peso molecular entre 580,000 y 780,000 Da, y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 200kg/oradora. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor en 90% (peso/peso) son relación al PHB alimentados de la biomasa, es decir, 50-80kg de PHB/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en la membrana en el procedimiento de extracción de filtro rápidamente se enfrían a una temperatura igual a son menor de aproximadamente 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente. El PHB precipitado en alcohol isoamílico que viene de la micro-filtración de membrana tiene un peso molecular en escala de 800,000 y 870,000 Da y de la filtración convencional en escala entre 580,000 y 780,000 Da. Opcionalmente, la corriente del extracto abrasivo de aproximadamente 8000kg/oradora de una suspensión conteniendo PHB (peso molecular de aproximadamente 900,000 Da) y agua disuelta en el alcohol isoamílico y los residuos insolubles de la biomasa extraída directamente se envían al paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, en donde las dos corrientes se obtienen: una corriente de filtrado de aproximadamente 7800kg/oradora que es una solución PHB libre de sólidos insolubles en suspensión enriquecida con PHB con un peso molecular entre 580,000 y 780,000 Da; y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la bíomasa extraída de aproximadamente 200kg/oradora. El filtrado obtenido en eí procedimiento entonces rápidamente se enfría a una temperatura igual o inferior de aproximadamente 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente. El PHB precipitado en alcohol isoamílico en un peso molecular en escala de 80,000-780,000 Da. El PHB recuperado del procedimiento es más alto del 95% (peso/peso) con relación al PHB alimentado de la biomasa, es decir, 50-80 kg de PHB/hora, dependiendo del flujo y la pureza de la biomasa.
EJEMPLO 1.3.2 Extracción y recuperación de PHB utilizando alcohol isoamílico como solvente en un extracción de tres etapas
' En un arreglo de tres reactores en serie, la biomasa de
Alcaligenes eutrophus concentrada hasta 25% de material seco y conteniendo aproximadamente 60-75% de PHB con un peso molecular de alrededor de 1 ,000,000 Da, se alimentó al primer reactor mecánicamente agitado, mantenido a aproximadamente 105°C y a una velocidad de flujo de 350- 450kg/oradora. En el tercer reactor, se alimentó el ¡soamílico a una velocidad de flujo de 7290kg/oradora calentado a aproximadamente 105°C. El vapor del alcohol isoamílico a 135°C se alimentó en las tres etapas extracción en una cantidad suficiente para garantizar la evaporación del exceso de una corriente agua contenida en el lechada. El procedimiento conduce la generación de una corriente total de vapor de agua y alcohol isoamílico de aproximadamente 1250kg/oradora, conteniendo respectivamente 15% de agua y 85% de alcohol isoamílico, y otra corriente, que fluye desde la primera etapa de extracción denominada extracto abrasivo, de aproximadamente 8000kg/oradora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en el alcohol isoamílico y residuos insolubles de la biomasa extraída. El extracto abrasivo que viene de la primera etapa entonces es continuamente alimentada en el hidrociclón 1 , en donde el flujo se separa en dos corrientes: una corriente superior, que comprende alrededor 75% del flujo alimentado y conteniendo aproximadamente 40%-45% de sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y una corriente inferior (en la porción inferior) de aproximadamente 25% del flujo de alimentación y conteniendo alrededor de 55%-60% de los sólidos insolubles originalmente contenidos ahí y los cuales se conducen a la siguiente etapa (2). La corriente superior del hidrociclón 1 pobre en sólidos insolubles entonces se alimenta a una unidad de micro-filtración de membrana a una velocidad de flujo de 6000kg/oradora, generando una corriente de aproximadamente 2000kg/oradora (1/3) concentrada en sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, la corriente de penetración de 4000kg/oradora (2/3) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. La corriente inferior del hidrociclón 1 se conduce a la segunda etapa de extracción en donde recibe la corriente superior del hidrociclón tres y la corriente concentrada en sólidos insolubles generados en la micro-filtración de membrana. La corriente inferior del hidrociclón tres conteniendo alrededor de 55-65% de los sólidos insolubles de la biomasa extraída entonces se envía a un paso de filtración, por ejemplo, en filtros de placa a una velocidad de flujo de 2000kg/oradora, generando una corriente de aproximadamente
1800kg/oradora que es una solución PHB libre de sólidos insolubles en suspensión, y una harina conteniendo los sólidos insolubles de las lomas extraída de aproximadamente 200kg/hora. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor de 98% (peso/peso) en relación al PHB alimentado de la biomasa, es decir, 51-82kg de PHB/hora. Ambos filtrados obtenidos en la membrana y en el procedimiento de extracción de filtro rápidamente se enfrían a una temperatura que es igual a o menor que aproximadamente 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente, alcohol isoamílico. Opcionalmente, la corriente superior del hidrociclón 1 de aproximadamente 6000 kg/oradora pobre en sólidos insolubles entonces directamente se envía al paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, en donde se obtienen: una corriente de filtrado de aproximadamente 5800 kg/oradora, la cual es una solución PHB libre de sólidos insolubles en una suspensión enriquecida con PHB con un peso molecular en escala de 650,000-780,000 Da; y una harina conteniendo los sólidos ¡nsolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 200 kg/oradora. El filtrado obtenido en el procedimiento entonces se enfria rápidamente a una temperatura igual a o menor que aproximadamente 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente. El precipitado PHB en alcohol isoamílico tiene un peso molecular en escala de 650,000-780,000 D. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor de 95% (peso/peso) en relación con el PHB alimentado de la biomasa, es decir, 50-80 kg de PHB/hora, dependiendo del flujo y la pureza de la biomasa.
EJEMPLO 1.3.3 Extracción y recuperación de PHB utilizando acetato de isoamilo como solvente
Prueba de la solubilidad de PHB en acetato de isoamilo: Se agregaron a un matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml, 31 gramos de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus, conteniendo 28.11% de material seco y 16.09% de PHB con un peso molecular de aproximadamente un 1 ,000,000 Da, y 250 g de acetato de isoamilo. Sea suspensión después se sometió, con agitación, a la evaporación del solvente, utilizando una manta de calentamiento acoplada al matraz destilación. El vapor binario de esta forma generado se condujo a un condensador de tubo recto (tipo Liebeg) para la condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en un procedimiento evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura se leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de la extracción que alcanzó después de que transcurrió un tiempo evaporación de aproximadamente 14 minutos, la temperatura de ebullición de la mezcla pasó de 104°C (temperatura inicial) a aproximadamente 123°C (temperatura de extracción), en este período sino generados alrededor de 34 ml de comenzado consistiendo de aproximadamente 70% (v/v) de acetato de isoamilo y el volumen restante siendo el agua y viene de la biomasa concentrada. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación durante aproximadamente diez minutos a la temperatura de 123°C (temperatura de extracción) y después aún caliente se filtro en un papel filtro para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el solvente filtrado. El PHB después enfrío para la precipitación de PHB, se concentró a través de filtración, se sometió evaporación del solvente y después a secado. El PHB obtenido presentó un peso molecular de aproximadamente 495,000 Da. La cantidad de biomasa concentrada utilizada en las pruebas fue de aproximadamente 2.0-3.5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar concentración de la saturación de PHB en el solvente en la temperatura de extracción empleada. Esta forma, la concentración de la saturación del soluto (PHB) en el solvente (acetato de isoamilo)) para la temperatura de extracción empleada se pudo determinar.
Prueba de extracción PHB en acetato de isoamilo: Se agregaron a un matraz destilación de fondo redondo de 500 ml 10 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11% de material seco y 16.09% de PHB con un peso molecular de aproximadamente 1 ,000,000 Da y 200g de acetato de isoamilo. La suspensión después se sometió a evaporación del solvente y agua, utilizando una manta de calentamiento acoplada al matraz destilación, el vapor binario de esta forma generado se condujo a un condensador de tubo recto (tipo Liebeg) para la condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en un procedimiento evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura se leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación durante aproximadamente diez minutos a la temperatura de 123°C (temperatura de extracción). El material de esta forma obtenido después se sometió a un procedimiento de decantación por calor y el residuo sólido insoluble resultante de la extracción que podría separar de PHB solubilizado en el solvente. La solución conteniendo PHB disuelto se enfrío para la precipitación de PHB y la masa PHB extraída en esta etapa se midió. El residuo sólido obtenido en la primera etapa recibió una nueva adición de 200 g de acetato isoamilo y se volvió a someter al extracción por diez minutos. Los otros procedimientos se repitieron hasta totalizar tres etapas extracción. Se extrajeron alrededor de 41 % de PHB originalmente contenido en la biomasa celular en la primera etapa, 13% la segunda etapa y 8% la tercera etapa. El PHB obtenido de esta forma permaneció en escala de 730,000 Da-750,000 Da.
Ejemplo de extrapolación a escala industrial La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrada a 28.11% de material seco, y conteniendo 16.09% de PHB con un peso molecular de aproximadamente 1 ,000, 000 Da se alimentó en un reactor mecánicamente agitado mantenido aproximadamente 123°C a una velocidad de flujo de 500kg/oradora, en donde reside la adición de 9,521 kg/oradora de acetato de isoamilo calentado a aproximadamente 123°C, en la forma de líquido y de vapor, en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenida en la lechada, generando una de aproximadamente 833kg/oradora de vapor compuesto de aproximadamente 30% (v/v) de agua y 70% (v/v) de acetato de isoamilo, y otra corriente denominada extracto abrasivo de aproximadamente 8,969 kg/oradora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en el acetato de isoamilo y residuos insolubles de biomasa extraída. El extracto abrasivo continuamente se alimenta en hidrociclón, en donde el flujo se separan dos corrientes: una corriente de aproximadamente 75% del flujo de alimentación en la parte superior y conteniendo aproximadamente 35% de sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la parte inferior de aproximadamente 25% del flujo de alimentación y conteniendo aproximadamente 65% de sólidos insolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior del hidrociclón, pobre en sólidos ¡nsolubles, entonces se alimenta en una unidad de micro-filtración de membrana a una velocidad del flujo de 6,891 kg/oradora, generando una corriente de aproximadamente 1,149kg/oradora (1/6) concentrada en sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y una corriente de penetración de 5,743kg/oradora (5/6) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. El tiempo de retención en el procedimiento es de aproximadamente 10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a un paso de filtración, por ejemplo filtros de placa, a una velocidad de flujo de 3,446 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente3,294kg/hora que es una solución PHB libre de libre de sólidos insolubles en suspensión y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 151.5kg/hora. La recuperación de PHB del procedimiento es más alta de 95% (peso/peso) con relación al PHB alimentado de la biomasa, es decir, 70-80kg de PHB/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en el procedimiento de extracción de membrana y filtro rápidamente se enfrían a una temperatura igual a o por debajo de alrededor de 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente.
EJEMPL0 1.3.4 Extracción y recuperación de PHB utilizando acetato de butilo como solvente
Prueba de solubilidad de PHB en acetato de butilo: 31 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11% de material seco y 16.09% PHB con un peso molecular de1 ,000, 000 Da y 250 g de acetato de butilo se agregaron a matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml. La suspensión después se sometió, bajo agitación vigorosa, a evaporación del solvente y agua mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, el vapor binario de esta forma generado siendo enviado a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura de leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracción se alcanzó después de que un tiempo de que había transcurrido un tiempo de evaporación de aproximadamente 28 minutos, la temperatura de ebullición de la mezcla que paso de aproximadamente 91.5°C (temperatura inicial)a aproximadamente 121.5°C (temperatura de extracción), en este período siendo generados alrededor de 131 ml de aproximadamente 83% (v/v) de acetato de isoamilo y siendo el volumen restante de agua que viene de la biomasa concentrada. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación durante alrededor de 10 minutos a la temperatura de 121.5°C (temperatura de extracción), después siendo filtrado, aún caliente, en papel filtro, para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el solvente filtrado. El material filtrado caliente, conteniendo alrededor de 0.98% (p/p) de PHB solubilizado, después se enfrió para la precipitación de PHB, se concentró a través de filtración , se sometió a la evaporación del solvente y después a secado.
El PHB obtenido presentó un peso molecular de aproximadamente 502.000 Da. La cantidad de la biomasa concentrada empleada en las pruebas fue de alrededor de 2.0- 3.5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentración de la saturación de PHB en el solvente, a la temperatura de extracción empleada. De esta forma, la concentración de saturación del soluto (PHB) en el solvente (acetato de isoamilo) para la temperatura de extracción empleada se pudo determinar.
Prueba de extracción PHB en acetato de butilo: 10 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11 % de material seco y 16.09% PHB con un peso molecular de 1 ,000,000 Da y 200 g de acetato de butilo se agregaron a un matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml. La suspensión después se sometió a evaporación del solvente y agua, mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, el vapor binario de esta forma generado siendo conducido a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura de leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación durante alrededor de 10 minutos a la temperatura de 121.5°C (temperatura de extracción). El material de esta forma obtenido después se sometió a un procedimiento de decantación por calor y el residuo sólido insoluble resultante de la extracción se separó del PHB solubilizado en el solvente. La solución conteniendo PHB disuelto se enfrió para la precipitación de PHB y se midió. El residuo sólido obtenido en esta primera etapa recibió una nueva adición de 200 g de acetato de butilo y se volvió a someter a extracción durante 10 minutos. Los otros procedimientos se repitieron hasta totalizar tres etapas de extracción. Se extrajeron alrededor de 62.5% del PHB originalmente contenido en la biomasa celular en la primera etapa, 18.5% en la segunda etapa y 7. 0% en la tercera etapa. El peso molecular del PHB obtenido permaneció en la escala de 740,000 Da-780,000 Da.
Ejemplo de extrapolación a escala industrial La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrada a 28.11 % de material seco y conteniendo alrededor de 16.09% de PHB con un peso molecular de aproximadamente1 ,000, 000 Da se alimentó en un reactor mecánicamente agitado mantenido a aproximadamente 121.5°C a una velocidad de flujo de 500 hg/hora, en donde recibe la adición de9,577kg/hora de acetato de butilo calentado a aproximadamente 121.5°C, en la forma líquida y de vapor, en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenida en la lechada, de aproximadamente 1732kg/hora de vapor consistiendo de aproximadamente17% agua y 83% acetato de butilo, y otra corriente, de aproximadamente 8,175kg/hora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en el acetato de butilo y residuos insolubles de la biomasá extraída. El extracto abrasivo después se alimenta continuamente en un hidrociclón, en donde el flujo se separa en dos corrientes: una corriente de aproximadamente75% del flujo de alimentación en la parte superior y conteniendo alrededor de 35% de sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la parte inferior de aproximadamente 25% del flujo de alimentación y conteniendo aproximadamente 65% de los sólidos insolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior del hidrociclón, pobre en sólidos insolubles, después se alimenta en la unidad de micro-filtración de membrana, a una velocidad de flujo de 6,258 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 1.043 kg/hora (1/6) concentrada en los sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y 5,215 kg/hora (5/6) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. El tiempo de retención en el procedimiento es de aproximadamente 10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a uti paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, a una velocidad de flujo de 3,129 kg/hora generando una corriente de aproximadamente 2,978 kg/hora, que es una solución de PHA libre de sólidos ¡nsolubles en suspensión, y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 151.5 kg/hora. La recuperación de PHBV del procedimiento es mayor de 95% (peso/peso) con relación al PHBV alimentado de la biomasa, es decir, 70-80 kg de PHBV/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en el procedimiento de extracción de membrana y filtro rápidamente se enfrían a una temperatura que es igual a o inferior a aproximadamente 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHBV en el solvente.
EJEMPLO 1.3.5 Extracción y recuperación de PHB utilizando propionato de propilo como solvente
Prueba de solubilidad de PHB en propionato de propilo: A un matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml, se agregaron 31 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus, conteniendo 28.11% de material seco y 16.09% PHB y con un peso molecular de 1 ,000,000 Da y 250 g de propionato de propilo. La suspensión después se sometió, bajo agitación vigorosa, a evaporación del solvente y agua, mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, el vapor binario de esta forma generado siendo conducido a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación vigorosa hasta alcanzar la temperatura de extracción. La temperatura de leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracción se alcanzó después de que haya transcurrido el tiempo de evaporación de aproximadamente15 minutos, la temperatura de ebullición de la mezcla que pasa de alrededor de 92°C (temperatura inicial) a aproximadamente 113°C (temperatura de extracción), en este período siendo generados alrededor de 100 ml de condensado, consistiendo de aproximadamente 80% (v/v) de propionato de propilo y siendo el volumen restante de agua que viene de la biomasa concentrada. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación vigorosa durante alrededor de 10 minutos, a la temperatura de 113°C (temperatura de extracción), siendo subsecuentemente filtrado, aún caliente, en papel filtro, para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el solvente filtrado. El material de filtrado caliente conteniendo alrededor de 1.24% (p/p) de PHB solubilizado después se enfrió para la precipitación de PHB, se concentró a través de filtración, se sometió a la evaporación del solvente y después a secado. El PHB obtenido presentó un peso molecular de aproximadamente 430,000 DA. La cantidad de biomasa concentrada utilizada en las pruebas fue de aproximadamente 2.0-3.5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentración de saturación de PHB en el solvente, a la temperatura de extracción empleada. De esta forma, la concentración de saturación del soluto (PHB) en el solvente (propionato de propilo) para la temperatura de extracción empleada se podría determinar.
Prueba de extracción de PHB en propionato de propilo: A un matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml, se agregaron 10 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11% de material seco y 16.09% PHB con un peso molecular de 1 ,000, 000 Da y 200 g de propionato de propilo. La suspensión después se sometió a evaporación del solvente y agua, mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, el vapor binario de esta forma generado siendo conducido a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura se leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación durante alrededor de 10 minutos, a la temperatura de 113°C (temperatura de extracción). El material así obtenido después se sometió a un procedimiento de decantación por calor y el residuo sólido insoluble resultante de la extracción se separó del PHB solubilizado en el solvente. La solución conteniendo el PHB disuelto se enfrió para la precipitación de PHB y la masa PHB extraída en esta etapa se midió. El residuo sólido obtenido en la primera etapa recibió una nueva adición de 200 g de propionato de propilo y se volvió a someter a extracción durante 10 minutos. Los otros procedimientos se repitieron hasta totalizar tres etapas de extracción. Se extrajeron alrededor de 62.0% del PHB originalmente contenido en la biomasa celular en la primera etapa, 18.5% en la segunda etapa y 6.0% en la tercera etapa. El peso molecular del PHB obtenido fue de aproximadamente 730,000 Da.
Ejemplo de extrapolación a escala industrial La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrados a 28.11% de material seco y conteniendo alrededor de 16.09% de PHB con un peso molecular de aproximadamente 1 ,000,000 Da se alimentó en un reactor mecánicamente agitado mantenido a alrededor de 113°C a una velocidad de flujo de 500 kg/hora, en donde recibe la adición de 7,406 kg/hora de acetato de butilo calentado a aproximadamente 113°C, en la forma líquida y de vapor, en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenida en la lechada, generando una corriente de aproximadamente 1,156 kg/hora de vapor compuesto de aproximadamente 20% de agua y 80% (v/v) de propionato de propilo, y otra corriente, denominada extracto abrasivo, de aproximadamente 7,406 kg/hora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en acetato de butilo y los residuos insolubles de la biomasa extraída. El extracto abrasivo después se alimenta continuamente en un hidrociclón, en donde el flujo se separa en dos corrientes: una corriente de alrededor de75% del flujo de alimentación en la parte superior y conteniendo alrededor de 35% de sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la parte inferior de alrededor de 25% del flujo de alimentación y conteniendo alrededor de 65% de los sólidos insolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior del hidrociclón, pobre en sólidos insolubles, después se alimenta en la unidad de micro-filtración de membrana a una velocidad de flujo de 5,063 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 844kg/hora (1/6) concentrada en los sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y una corriente de penetración de 4,219 kg/hora (5/6) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa i extraída. El tiempo de retención en el procedimiento es de aproximadamente 10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a un paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, a una velocidad de flujo de 2,531 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 2,380 kg/hora, que es una solución de PHB libre de sólidos insoiubles en suspensión y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 151.5 kg/hora. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor de 95% (peso/peso) con relación al PHBV alimentado de la biomasa, es decir 70-80 kg de PHBV/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en el procedimiento de extracción de membrana y filtro rápidamente se enfrían a una temperatura que es igual a o por debajo de alrededor de 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHBV en el solvente. La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrada a 25% de material seco y conteniendo alrededor de 60%-75% de PHB con un peso molecular de aproximadamente 1 ,000,000 Da se alimentó en un reactor mecánicamente agitado, mantenido a aproximadamente 95-105°C a una velocidad de flujo de 500 kg/hora, en donde recibe la adición de 8000 kg/hora de propionato de propilo calentado a aproximadamente 130°C y vapor de propionato de propilo a 130°C, en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenida en la lechada, generando una corriente de aproximadamente 1 ,230 kg/hora del vapor compuesto de aproximadamente 24% de agua y 76% de propionato de propilo, y otra corriente denominada extracto abrasivo de aproximadamente 8268 kg/hora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en el propionato de propílo y residuos insolubles de biomasa extraída. El extracto abrasivo después se alimenta continuamente en un hidrociclón, en donde el flujo se separa en dos corrientes: un corriente de aproximadamente 75% del flujo de alimentación en la parte superior y conteniendo alrededor de 35% de sólidos ¡nsolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la parte inferior de aproximadamente 25% del flujo de alimentación y conteniendo alrededor de 65% de los sólidos ¡nsolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior dei hidrociclón, pobre en sólidos insolubles, después se alimente en una unidad de micro-filtración de membrana a una velocidad de flujo de 6,201 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 1 ,034 kg/hora (1/6) concentrada en los sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y una corriente de penetración de 5,167 kg/hora (5/6) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. El tiempo de retención en el procedimiento es alrededor de 3-10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a un paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, a una velocidad de flujo de 3,100 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 2,850 kg/hora, la cual es una solución de PHB libre de sólidos insolubles en suspensión y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 250 kg/hora. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor del 95% (peso/peso) con relación al PHB alimentado de la biomasa, es decir, 70-90 kg de PHB/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en el procedimiento de extracción de membrana y filtro rápidamente se enfrían a una temperatura que es igual a o por debajo de alrededor de 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHB en el solvente.
EJEMPLO 1.3.6 Extracción y recuperación de PHB utilizando 1 -hexano como solvente en una extracción de una etapa
Prueba de soluibilidad de PHB en hexanol: Se agregaron a un matraz de destilación de fondo redondo de 500 ml, 31 g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11 % de material seco y 16.09% PHB con un peso molecular de 1 ,000, 000 Da y 250 g de hexanol. La suspensión después se sometió, bajo agitación, a evaporación del solvente y agua, mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, el vapor binario de esta forma generado siendo conducido a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación vigorosa hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura de leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La temperatura de extracción se alcanzó después de que transcurrió un tiempo de evaporación de aproximadamente 15 minutos, la temperatura de ebullición de la mezcla pasó de alrededor de 104°C (temperatura inicial) a aproximadamente 133°C (temperatura de extracción), en este período siendo generados alrededor de 34 ml de condensado consistiendo de de aproximadamente 44% (v/v) de hexanol, siendo el volumen restante de agua que viene de la biomasa concentrada. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado bajo agitación vigorosa durante alrededor de 10 minutos a la temperatura de 133°C (temperatura de extracción), siendo subsecuentemente filtrada, aún caliente, en papel filtro, para separar la parte insoluble de la parte disuelta en el solvente filtrado. El material filtrado caliente conteniendo alrededor de 0.83% (p/p) de PHB solubilizado después se enfrió para la precipitación de PHB, se concentró a través de filtración, se sometió a la evaporación del solvente y subsecuentemente a secado. El PHB obtenido presentó un peso molecular de aproximadamente 430,000 DA. La cantidad de la biomasa concentrada utilizada en las pruebas fue de alrededor de 2.0-3.5 veces mayor que la cantidad necesaria para alcanzar la concentración de la saturación PHB solvente, a temperatura de extracción empleada. De esta forma la concentración de la saturación del soluto (PHB) en el solvente (hexanol) para la temperatura de extracción empleada se podría determinar.
Prueba de extracción de PHB en hexano!: Se agregaron a un matraz de destilación de fondo redondo de
500 ml, 10g de biomasa concentrada de Alcaligenes eutrophus conteniendo 28.11 % de material seco y 16.09% de PHB con un peso molecular de 1 ,000,000 Da y 200 g de hexanol. La suspensión después se sometió a evaporación del solvente y agua, mediante el uso de una manta de calentamiento acoplada al matraz de destilación, e! vapor binario de esta forma generado siendo conducido a un condensador de tubo recto (tipo Liebig) para condensación y el condensado resultante se recolectó en un recipiente Erlenmeyer. La suspensión se mantuvo en el procedimiento de evaporación bajo agitación hasta que alcanzó la temperatura de extracción. La temperatura de leyó en un termómetro de mercurio fijado a una de las boquillas del matraz y se mantuvo en contacto con la fase de vapor dentro del matraz. La suspensión después se mantuvo en un régimen de reflujo condensado y bajo agitación durante alrededor de 10 minutos a la temperatura de 133°C (temperatura de extracción). El material así obtenido después se sometió a un procedimiento de decantación por calor y el residuo sólido insoluble resultante de la extracción se separó del PHB solubilizado en el solvente. La solución conteniendo PHB disuelto se enfrió para la precipitación de PHB y la biomasa de PHB extraída en esta etapa se midió. El residuo sólido obtenido en la primera etapa recibió una nueva adición de 200 g de hexanol y se volvió a someter a extracción durante 10 minutos. Los otros procedimientos se repitieron hasta totalizar tres etapas de extracción. Se extrajeron alrededor de 64.5% de PHB originalmente contenido en la biomasa celular en la primera etapa, 19. 0% en la segunda etapa y 8. 0% en la tercera etapa. El peso molecular del PHB así obtenido estuvo dentro de la escala de 530,000 Da a 680,000 Da.
Ejemplo de extrapolación a escala industrial La biomasa de Alcaligenes eutrophus concentrada a 28.11% de material seco y conteniendo alrededor de 16.09% de PHB y peso molecular de aproximadamente 1 ,000,000 Da se alimentó en un reactor mecánicamente agitado, mantenido a alrededor de 133°C a una velocidad de flujo de 500 kg/hora, en donde recibe la adición de 10,019 kg/hora de hexanol calentado a aproximadamente 133°C, en la forma líquida y de vapor y en una cantidad suficiente para evaporar el exceso de agua contenida en la lechada, generando una corriente de aproximadamente 542.6 kg/hora de vapor compuesto de aproximadamente 20% de agua y 60% (p/p) de hexanol, y otra corriente, denominada extracto abrasivo, de aproximadamente 9,997 kg/hora de una suspensión conteniendo PHB y agua disuelta en hexanol y residuos insolubles de la biomasa extraída. El extracto abrasivo después se alimenta continuamente en un hidrociclón, en donde el flujo se separa en dos corrientes: una corriente de aproximadamente 75% del flujo de alimentación en la parte superior y conteniendo alrededor de 35% de sólidos insolubles originalmente contenidos en el extracto abrasivo de alimentación; y otra corriente en la parte inferior de alrededor de 25% del flujo de alimentación y conteniendo alrededor de 65% de los sólidos insolubles originalmente contenidos ahí. La corriente superior del hidrociclón, pobre en sólidos insolubles, después se alimenta en una unidad de micro-filtración de membrana a una velocidad de flujo de 7,482 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 1 ,247 kg/hora (1/6) concentrada en los sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída, y una corriente de penetración de 6,235 kg/hora (5/6) libre de sólidos insolubles residuales de la biomasa extraída. El tiempo de retención en el procedimiento es de aproximadamente 10 minutos. La corriente rica en sólidos insolubles del hidrociclón (fase inferior) y de la membrana después se mezclan y se envían a un paso de filtración, por ejemplo en filtros de placa, a una velocidad de flujo de 3,741 kg/hora, generando una corriente de aproximadamente 3,90 kg/hora, la cual es solución de PHB libre de sólidos insolubles en suspensión, y una harina conteniendo los sólidos insolubles de la biomasa extraída de aproximadamente 151.5 kg/hora. La recuperación de PHB del procedimiento es mayor de 95% (peso/peso) con relación al PHBV alimentado de la biomasa, es decir, 70-80 kg de PHBV/hora, dependiendo del flujo y pureza de la biomasa. Ambos filtrados obtenidos en el procedimiento de extracción de membrana y filtro rápidamente se enfrían a una temperatura que es igual a o por debajo de alrededor de 45°C, con el fin de garantizar la precipitación de PHBV en el solvente.
EJEMPLO 1.5 Evaporación v lavado del solvente parcial de suspensión PHB en alcohol isoamílico para obtener aglomerados de granulos de alta porosidad, que son frágiles y fácilmente sometidos a esfuerzo cortante
La suspensión de PHB en una solución de alcohol isoamílico y agua conteniendo 4-10% de PHB se alimentó en un evaporador al vacío a una velocidad de flujo de 1,000 kg/hora, junto con una corriente de agua conteniendo alcohol isoamílico disuelto a una velocidad de flujo de 500-1000 kg/hora y recuperado del procedimiento de extracción y purificación. La mezcla después se somete continuamente a evaporación a través de inyección directa de vapor con el fin de, simultáneamente con la remoción del solvente a través de evaporación, obtener una suspensión conteniendo el solvente, agua y aglomerados de granulos de PHB, que continuamente se someten a esfuerzo cortante a través de un dispositivo mecánico instalado en la bomba de circulación del sistema. El material resultante de este procedimiento es una suspensión de partículas de PHB, finamente divididas en agua y alcohol isoamílico disueltas ahí, que continuamente se remueven del sistema con una concentración de partículas de PHB en suspensión de 4- 20% (peso/peso) y enviadas a la siguiente etapa de la extracción del solvente.
EJEMPLO 1.6 Extracción de alcohol isoamílico (solvente) de la suspensión de partículas de PHB finamente dividido con lavado y pulverización simultánea del producto
Una suspensión de partículas de PHB finamente divididas, obtenidas como se ejemplifican en el ejemplo 1.5, conteniendo de 2 a 20% de sólidos, se alimentó en un reactor agitado de extracción de solvente (disolución) a una velocidad de flujo de 1000 kg/hora, en donde se admite el vapor a través de contacto directo, así como agua, hasta que se remueve el alcohol isoamílico disuelto en agua, conjuntamente con algo de agua, que formará la fase del vapor efluente del sistema. Simultáneamente con la evaporación del alcohol isoamíiico residual y continuamente, la suspensión de las partículas de PHB en agua se someten a un procedimiento de esfuerzo cortante adicional a través de un dispositivo similar a aquel descrito en el Ejemplo 1.5. Una vez la finalización del procedimiento de extracción del solvente, se obtiene una suspensión en PHB en agua, finamente dividida, substancialmente pura y libre de solvente, en una concentración de 5-20% de sólidos en suspensión. La suspensión después se enfría y se conduce a un paso de filtración, en el cual se obtiene una harina de PHB de alrededor de 50-80% de humedad que subsecuentemente se seca.
Claims (44)
1.- Un procedimiento para recuperar polihidroxialcanoatos
(PHAs) de biomasa celular de bacteria, dicha biomasa siendo obtenida a través de fermentación y en la forma de una lechada de biomasa celular en suspensión acuosa y con un contenido celular seco no inferior a aproximadamente 18% en peso, dicho procedimiento estando caracterizado porque comprende los pasos de: i) someter la lechada de biomasa celular concentrada a operaciones concomitantes de inyección de solvente PHA, de agitación vigorosa y el rápido calentamiento en el interior de un reactor, con el fin de provocar la ruptura de las paredes de la biomasa celular y la disolución del PHA contenido en lo anterior, y para formar una suspensión que comprende el solvente PHA enriquecido con el PHA disuelto, agua restante de la lechada de biomasa celular y residuos insolubles de la biomasa celular concentrada; ii) someter la suspensión formada en el reactor a un paso de separación, para recuperar el solvente, enriquecido con el PHA disuelto, de los residuos ¡nsolubles de la biomasa celular restante; ¡ü) rápidamente enfriar la solución del solvente de PHA enriquecida con PHA a una temperatura que es suficiente para substancialmente precipitar todo el PHA disuelto; iv) micro-filtrar en frío la suspensión de PHA precipitada en el solvente PHA conteniendo agua e impurezas disueltas ahí, con el fin de separar una pasta concentrada de PHA; v) someter la pasta concentrada con PHA para simultáneamente realizar las operaciones de lavado con agua, calentamiento y agitación, con el fin de promover la evaporación de una cierta cantidad de solvente que es adecuado para obtener una suspensión conteniendo granulos de PHA de alta porosidad y que son frágiles y fácilmente sujetos de esfuerzo cortante, el solvente restante y agua; vi) someter los granulos de PHA lavado y calentado a agitación y esfuerzo cortante, para rápidamente romperlos, mientras se procesa la extracción del solvente residual a través de la inyección de vapor de agua en la suspensión que contiene el solvente y agua restantes, con el fin de obtener partículas de PHA purificadas en la suspensión; y vii) separar las partículas de PHA separadas de la suspensión. 2.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el solvente PHA utilizado se selecciona del grupo de solventes que consiste de: acetato de butilo, isoacetato de butilo, acetato de amilo, acetato de isoamilo, acetato de isobutilo, 1 -butanol, 1-pentanol (alcohol metílico), 2-met¡l-1 -butanol, 3-metil-1 -butanol (alcohol isoamílico), 3-pentanol, 1 -hexanol, ciclohexanol, propíonato de propilo, propionato de butilo, propionato de isobutilo, butirato de etilo, isobutirato de isobutilo, y mezclas de los mismos.
3.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el solvente utilizado es el alcohol isoamílico o mezclas isoméricas de alcohol isoamílico.
4.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el alcohol isoamílico se obtiene a través del fraccionamiento de aceite de acre como un subproducto de la fermentación de etanol, el aceite de acre está primordialmente compuesto de alcohol isoamílico e isómeros del mismo, aparte de impurezas, tales como: etanol, n- propanol, isobutanol, n-butanol, y agua.
5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el PHA se selecciona del grupo que consiste de poli-3-hidroxibutirato (PHB), poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) PHBV, y mezclas de estos polímeros y copolímeros.
6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el PHA se produce a través de fermentación bacteriana, utilizando microorganismo que son capaces de biosintetizar PHA a través del uso, como materia prima, azúcares extraídos de caña de azúcar y que la fuente energética principal utilizada para generar la energía térmica y la energía eléctrica requerida a través del procedimiento es el bagazo de caña de azúcar.
7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el PHA se selecciona del grupo que consiste de poli-3-hidroxibutirato (PHB), poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) PHBV, y mezclas de estos polímeros y copolímeros.
8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la biomasa celular bacteriana obtenida a través de fermentación y que se va a procesar está previamente térmicamente inactivada.
9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el paso de inyectar solvente en la lechada de biomasa celular concentrada comprende las operaciones de inyectar solvente de PHA líquido y solvente de PHA en la forma de vapor, con el fin de provocar el calentamiento de la biomasa celular a una temperatura de entre alrededor de 90° y la temperatura de ebullición del solvente a una presión atmosférica sustancialmente y para formar: una fase líquida que comprenden solvente PHA enriquecido con PHA y el agua restante de la lechada del biomasa celular; una fase sólida definida por los residuos insolubles de la biomasa celular residual; una fase de vapor conteniendo los vapor de agua y los solventes de pH.
10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende el paso adicional de extraer la fase de vapor del interior del reactor.
11.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la pasta de PHA se lava con una corriente de agua que viene de la condensación de la fase de vapor extraída del reactor durante el paso de la ruptura celular y la disolución de PHA.
12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la lechada de biomasa celular concentrada se obtiene a través del sometimiento de la biomasa celular en suspensión en medio de cultivo fermentado para las operaciones de floculación y concentración de la biomasa celular.
13.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la biomasa celular en suspensión en el medio de cultivo fermentado que se va a suministrar al procedimiento además se diluye en agua, con el fin de presentar un material fermentado: proporción de masa de agua hasta a aproximadamente 3, 0:1 , 0.
14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la operación de floculación comprende un paso de coagular la masa celular efectuada a través de acidificación de la biomasa celular diluida a un pH de alrededor de 1.5 a aproximadamente 5.5 y a través de la adición de un agente de alcalización, hasta alcanzar un pH de 7 a aproximadamente 12, la operación de floculación de la biomasa celular contiene el PHA acumulado que se lleva a cabo a través de la adición de un agente de floculación.
15.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la acidificación de la biomasa celular diluida se obtiene a través de la adición de un ácido definido a través de por lo menos uno de los ácidos sulfúrico y fosfórico.
16.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el agente de alcalización comprende hidróxido de calcio.
17.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la acidificación se lleva a cabo con el fin de obtener un pH de alrededor de 2.0 a aproximadamente 3.0, la adición del agente de alcalización se hace para ajustar el pH de la suspensión de la biomasa celular diluida a una escala de alrededor de 7 y alrededor de 12.
18.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la operación de floculación comprende un paso de coagular la biomasa celular a través de la adición de un agente de alcalización hasta que alcanza un pH de alrededor de 7 a aproximadamente 12, la floculación de la biomasa celular contiene PHA acumulado que se logra a través de la adición de un agente de floculación.
19.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el agente de alcalización comprende hidróxido de calcio.
20.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la operación de floculación comprende un paso de coagular la biomasa celular a través de la acidificación de la biomasa celular a un pH de alrededor de 1.5 a aproximadamente 5.5 y a través de la adición de un agente de alcalización hasta que alcanza un pH de alrededor de 7 a aproximadamente 12, la floculación de la biomasa celular contiene PHA acumulado que se logra a través de la adición de un agente de floculación.
21.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la acidificación de la biomasa celular diluida se obtiene a través de la adición de un ácido definido por al menos uno de los ácidos sulfúrico y fosfórico.
22.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado en que el agente de alcalización comprende hidróxido de calcio.
23.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la acidificación se lleva a cabo con el fin de obtener un pH de alrededor de 2.0 a aproximadamente 3.0, la adición del agente de alcalización se hace para ajustar el ph de la suspensión de la biomasa celular diluida a una escala de entre alrededor de 7 y alrededor de 12.
24.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la operación de floculación comprende un paso de coagular la biomasa celular a través de la adición de un agente de alcalización hasta que alcanza un pH de alrededor de 7 a aproximadamente 12, la floculación de la biomasa celular contiene PHA acumulado que se logra a través de la adición de un agente de floculación.
25.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el agente de alcalización comprende hidróxido de calcio.
26.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la concentración de las células de biomasa floculadas se logra a través de una de las operaciones de decantación y centrifugación.
27.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la lechada de biomasa celular en el medio de cultivo se somete al lavado con agua y a una concentración en la escala de 18%-45%, preferiblemente de 25%-45% en peso de la biomasa celular seca.
28.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de lavado y concentración de la lechada de biomasa celular se logra a través del sometimiento simultáneo de lo anterior a un flujo de agua y a los efectos de la fuerza centrífuga.
29.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el solvente PHA líquido que se inyecta en la lechada de biomasa celular se calienta.
30.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el paso de separar el solvente PHA enriquecido con PHA disuelto ahí forma los residuos insolubles de la biomasa restante que está contenida en la suspensión formada en el reactor que comprende al menos una de las operaciones de micro-filtración de membrana y de filtración en filtro pre-recubiertos.
31.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el paso de separar el solvente PHA enriquecido con PHA disuelto ahí de los residuos insolubles de la biomasa restante está contenida en la suspensión formada dentro de reactor comprende un paso de someter dicha suspensión a una separación mediante el efecto de la fuerza centrífuga de baja intensidad. •
32.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque la fuerza centrífuga de baja intensidad, que se utiliza en el paso de separación, de la solución de PHA enriquecida con PHA disuelto ahí, los residuos insolubles de la biomasa restante están contenidos en la suspensión formada dentro de reactor, se obtiene a través de hidrociclones, que producen una suspensión con baja concentración de dichos residuos y otras suspensión concentrada con dichos residuos.
33.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la suspensión de baja concentración de residuos insolubles de biomasa que salen de los hidrociclones rápidamente se someten a un paso de separación adicional para completamente remover los residuos antes de someterse al paso de enfriamiento.
34.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de separación adicional se efectúa a través de la micro-filtración de membrana, con el fin de producir una solución de PHA disuelto en el solvente PHA, libre de residuos insolubles, y una suspensión concentrada en los residuos insolubles de biomasa y que contienen una fracción del PHA disuelto en el solvente PHA, agua, cenizas, y compuestos de color disueltos en el solvente PHA.
35.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la suspensión concentrada en residuos insolubles de biomasa celular se someten a un paso de filtración, con el fin de producir una harina que contiene los residuos ¡nsolubles de biomasa y una solución filtrada del PHA disuelta en el solvente, libre de residuos insolubles y que puede rápidamente someterse al paso de enfriamiento.
36.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la solución de PHA disuelta en el solvente PHA y libre de residuos insolubles representa alrededor de 60-90% en peso de la suspensión en micro-filtración, la suspensión concentrada en residuos de biomasa celular se representan alrededor de 10-50% en peso de dicha suspensión en micro-filtración.
37.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la suspensión concentrada con residuos insolubles de biomasa que salen de los hidrociclones se someten a un paso de filtración para separar los residuos insolubles de biomasa antes de someterse al paso de enfriamiento.
38.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el paso de micro-filtración en frío de la suspensión de PHA precipitado en el solvente PHA se lleva a cabo con el fin de producir una pasta de PHA con una concentración de PHA de alrededor de 3.5% a 8. 0% p/p.
39.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso final de secar las partículas de PHA separadas del medio acuoso del cual se redujo el solvente.
40.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los vapores del agua y del solvente PHA, que se generan en las varias etapas del procedimiento, se condensan y se separan en dos fases líquidas: una fase líquida rica en solvente que regresa al procedimiento en extracción de PHA y el paso de recuperación; y otra fase líquida pobre en solvente, que se recircula en el procedimiento para permitir la recuperación del solvente PHA contenido ahí.
41.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los pasos de calentamiento de la biomasa celular fragmentada, de la ruptura de las paredes de células de dicha biomasa celular, y la disolución del PHA contenido en lo anterior se lleva a cabo en un tiempo total que es suficientemente corto para permitir la tensión de un PHA con un peso molecular mínimo de aproximadamente 850.000 Da, de una biomasa que contiene PHA con un peso molecular mínimo de aproximadamente 1 ,000,000 Da.
42.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque los pasos de separación y enfriamiento se efectúan en un tiempo que es suficientemente corto para permitir la obtención de un PHA con un peso molecular mínimo de aproximadamente 750.000 Da.
43.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los granulos de PHA obtenidos en el paso (vi), después del secado, tienen un tamaño de particular promedio en escala de 40 a 400 µm y preferiblemente en escala de 100 a 200 µm.
44.- Un PHB caracterizado porque se produce de conformidad a de las reivindicaciones previas.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PIPI0306230-9 | 2003-11-28 | ||
| PIPI0405622-1 | 2004-11-19 |
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