KR101225161B1 - 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출및 회수하는 방법 - Google Patents

세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출및 회수하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경에 공격적이지 않은 적어도 하나의 비-할로겐화 용매로 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하는 단계; 세포 바이오매스를 가열하여 PHA가 용해된 PHA 용매 및 불용성 잔류물을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계; PHA가 풍부한 용매를 회수하는 단계; 증기 흐름으로 PHA-풍부 용매를 주입하여 용매를 증발시키면서 수중에서 PHA를 신속하게 완전 침전시키는 단계; 현탁액으로부터 정제된 PHA 입자를 분리하는 단계 및 이들 입자를 건조하는 단계를 포함하여 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는 방법을 제공한다.

Description

세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출 및 회수하는 방법{PROCESS FOR EXTRACTING AND RECOVERING POLYHYDROXYALKANOATES (PHAs) FROM CELLULAR BIOMASS}
본 발명은 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 PHA 용매를 이용하여 박테리아 세포 바이오매스(cellular biomass)로부터 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는 방법에 관한 것으로서, 본 방법에 의해 고순도 및 고분자량의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)가 수득가능하다.
재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 사용하고 환경에 공격적이지 않은 방법을 통해 생분해성 및 생체적합성 재료를 생산하기 위한 필요성에 대해서는 현재 전세계 산업분야에 알려져 있다.
현대 사회에서, 플라스틱 재료의 대량 사용은 갈수록 심각한 각종 환경문제를 야기하고 있다. 이러한 문제점들에 비추어, 생분해성 플라스틱 수지, 주로 재생가능한 공급원을 사용하는 청정기술(clean technology)에 의해 생산된 것들의 개발이 전세계적으로 주목받고 있다. 동일한 출원인의 브라질 특허출원 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)의 도입부에 기술된 바와 같이, 시장에서 가장 성공가능성이 있는 이들 생분해성 생체고분자의 적용예로는 일회용 재료, 예를 들 면 포장재, 화장품 및 독성 농약의 용기, 및 의약품과 같은 제품이다. 170 가지 이상의 대표종이 문헌에 개시되어 있는데, PHA에 대한 상업적 관심은 생분해성뿐만 아니라 이들의 열적-기계적 성질 및 생산 비용에도 직접 관련되어 있다. 따라서, 일부 PHA만이 공업적 적용이 가능하며, 가장 대표적인 것은 PHB (폴리-3-하이드록시부티레이트), PHB-V (폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB (폴리(4-하이드록시부티레이트)), P3HB-4HB (폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트)) 및 일부 PHAmcl(중쇄 폴리하이드록시알카노에이트)이며, 마지막 부류중 가장 전형적인 대표종은 PHHx (폴리하이드록시헥사노에이트)이다.
PHA의 화학 구조는 하기 단위의 반복에 의해 형성된 고분자 사슬로서 설명될 수 있다:
Figure 112007071164741-pct00001
상기 식에서, R은 다양한 길이의 알킬 또는 알케닐 그룹이고, m 및 n은 정수이며, 상기 언급한 중합체에서 R 및 m은 하기 값일 것으로 추정된다:
PHB: R=CH3, m=1
PHB-V: R=CH3 또는 CH3-CH2, m=1
P4HB: R=H, m=2
P3HB-4HB: R=H 또는 CH3, m=1 또는 2
PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1
지난 20 년 동안의 자연 과학, 특히 생명공학에서의 위대한 발전을 통해, 가장 다양한 천연 또는 유전자 변형 유기체를 PHA의 상업적 생산에 사용할 수 있게 되었다. 본 발명과 특히 관련이 있는 것은 상당한 양의 상기 고분자를 그의 내부에서 생산하고 축적할 수 있는 일정 박테리아 균주를 사용하는 것이다. 높은 세포 밀도, 높은 세포 내 고분자 함량 및 공업적 방법에 적합한 수율에 달성하게 하는 특정 조건하에서 배양된 상기 박테리아 균주는 다양한 재생가능 원료, 예컨대 사탕수수, 당밀 또는 가수분해된 셀룰로오스 추출물을 이용할 수 있다.
미국특허 제 3107172 호에 개시된 바와 같이, (PHA 가용화제를 사용하지 않고) 자연 상태의 박테리아 세포를 성형가능 재료로서 적용하기 위한 시도가 있었으나, 대부분의 경우 PHA의 상업적 적용예는 목적하는 플라스틱 성질을 얻기에 충분히 높은 순도를 요한다. 생체고분자, 특히 PHA를 제조하는데 적합한 수준의 순도에 도달하기 위해서는, 통상 잔류 바이오매스로부터 PHA를 추출 및 회수하는데 용매의 사용이 불가피한 단계가 필요하다.
유럽 특허공개 제 01455233 A2 호에는 효소 및/또는 계면활성제를 사용하여 비-PHA 세포 물질을 가용화함으로써 PHA를 함유하는 세포의 수성 현탁액의 소화를 수행하는 몇몇 가능성이 개시되어 있는데, 용매가 사용되는 경우에 발생할 것 같지 않지만 이 방법에서 효소들은 매우 비싸고 회수될 수 없다는 사실이 고려되어 있 다. 또한, 세포 물질을 고농도로 희석시킬 필요가 있는데 이로 인해 공정중에 다량의 폐수가 발생한다.
통상 제시되는 추출 방법은 기본적으로 생체고분자를 함유하는 건조 또는 습한 세포 바이오매스를 상기 고분자를 가용화시키는 용매와 격렬하게 접촉하도록 노출시킨 다음 세포 잔류물(데브리스)을 분리하는 단계로 이루어진다. 이어, 상기 생체고분자를 함유하는 용액에 불용화제를 첨가하여 용매 중에 생체고분자를 침전시킨다(참조예, 1991년 7월 16일에 출원되고 1993년 2월 24일에 공개된 브라질 특허 제 PI 9103116-8 호).
유기 용매를 통한 추출 방법에서, 사용되는 용매는 부분적으로 할로겐화된 탄화수소, 예컨대 클로로포름(미국 특허 제 3275610 호), 메틸렌-에탄올 클로라이드(미국 특허 제 3044942 호), 비점 65 내지 170℃의 클로로에탄 및 클로로프로판, 1,2-디클로로에탄 및 1,2,3-트리클로로프로판(유럽 특허 제 0014490 B1 호 및 유럽 특허 제 2446859 호)이다.
디클로로메탄, 디클로로에탄 및 디클로로프로판과 같은 다른 할로겐화 화합물은 미국 특허 제 4,562,245 호(1985), 제 4,310,684 호(1982), 제 4,705,604 호(1987), 및 유럽 특허 제 036,699 호(1981) 및 독일 특허 제 239,609 호(1986)에 인용되어 있다.
할로겐화 용매를 이용하여 바이오매스로부터 생체고분자를 추출 및 정제하는 방법은 환경 및 인체 건강에 매우 공격적이기 때문에 지금은 완전히 금지되고 있다. 따라서, 세포 바이오매스로부터 생체고분자의 잠재적 추출제(potential extractor)로서 사용될 수 있는 용매는 우선 환경에 대해 공격적이지 않아야 한다는 조건을 만족시켜야 한다.
이러한 관점에서, 브라질 특허 제 PI 9302312-0 호(1993년에 출원되고 2002년 4월 30일에 허여됨)는 용매로서 3 개의 탄소를 가진 장쇄 알콜 또는 이로부터 유도된 아세테이트를 이용하여 박테리아 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하는 방법을 제시하고 있다. 본 특허는 이소아밀 알콜 (3-메틸-1-부탄올), 아밀 아세테이트 (또는 아밀-아세트산 에스테르), 및 알콜 발효의 부산물로서 수득되는 고급 알코올의 혼합물이자 이소아밀 알콜을 주성분으로 하는 퓨젤유(fusel oil)를 취하였다. 본 특허는 또한 불용화제 또는 역용매(counter-solvent) 및/또는 한계적 비용매(marginal non-solvent)를 이용할 필요없이 단일 용매를 추출제(extractor) 및 정제제(purifier)로서 사용하는 것을 특징으로 한다. PHA 용액의 용질(생체고분자)의 침전은 용액의 냉각을 통해 수행된다.
미국 특허 제 6,043,063 호(1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 3월 28일에 허여됨), 미국 특허 제 6,087,471 호(1998년 4월 14일에 출원되고 2000년 6월 11일에 허여됨), 및 국제 특허출원공개 WO-98/46783 호(1997년 4월 15일에 출원됨)에는 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하기 위한 용매로서 사용가능한 비-할로겐화 용매의 방대한 목록이 개시되어 있으나, 이들 중 다수는 고가일 뿐 아니라 까다로운 공업적 취급성, 독성과 같은 특징을 가지고 있다. 상기 방대한 목록에는 브라질 특허 제 PI 9302312-0 호에 언급된 용매도 포함되는데, 생체고분자와의 비적합성 또는 독성, 폭발성 및 고비용으로 인해 박테리아 또는 식물성 바이오매스로부터 생체고분자를 추출하기 위해서는 적은 수의 용매만이 공업적으로 사용가능하다.
생체고분자는 열에 민감하므로, 즉 일정치 이상의 온도에 처하면 비가역적으로 분해되고 분자량이 감소하여 상기 고분자에 열가소성 특성을 부여하는 성질에 결정적으로 영향을 미치게 되므로, 공업적으로 사용가능한 용매의 목록은 보다 더 제한됨을 반드시 염두에 두어야 한다. 생체고분자의 분자량을 크게 변화시키지 않으면서도 생체고분자를 추출가능케 하는 적합한 방법과 결합될 경우, 생체고분자의 추출을 촉진하기 위해 선택된 용매의 공업적 이용가능성은 더욱 증가할 것이다. 다양한 적용예에서 10,000 내지 50,000의 저분자량을 가진 PHA가 사용되지만, 더 큰 범위의 상업적 적용예에서 바람직한 분자량은 500,000 Da 이상이다.
가능한 한 최초 분자량, 즉 PHA가 세포 내에 존재할 경우의 분자량에 가까운 분자량을 가진 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 제조하기 위해서는, 생체고분자를 가용화시키기 위해 PHA 용매를 70℃ 이상으로 가열시켜야 하는 경우를 고려하는 것이 중요하며; 동일 출원인의 상기 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)에 언급된 이전 특허 출원에 논의된 바와 같이, 공정동안 생체고분자가 상기 온도에 노출되는 시간이 길수록 생체고분자가 더 많이 분해되어 그의 열가소성 성질을 회복할 수 없게 악화시킬 수 있다. 예를 들어, 최초로 1,000,000Da의 분자량를 가진 폴리하이드록시부티레이트를 110℃ 이소아밀 알콜에서 추출시키면 노출시간이 5분인 경우 951,230 Da; 노출시간이 15분인 경우 853,692 Da; 노출시간이 30분인 경우 707,410 Da; 노출시간이 60분인 경우 414,771 Da; 및 노출시간이 90분인 경우 122,230 Da이 수득되었을 것이다.
우수한 기계적 성질을 가진 순수한 생성물을 수득하기 위해서는 추출 이외에 용매의 증발 및 건조와 같은 다른 조작이 필요하다는 점과 이들 조작으로 인해 생체고분자가 물질과 관련한 중대한 상태에 다수 노출되는 점을 고려할 경우, 이러한 형태의 물질을 처리하는데 있어서의 고유 난점을 생각하는 것은 어렵지 않다. 용매 이외에, 생성물을 열적으로 분해하지 않는 적절한 방법을 가지는 것이 바람직하다.
생체고분자의 열 감수성을 고려하고 고분자량 물질을 제조하기 위해서는, 추출 및 회수하는 공정동안 생체고분자의 열분해 수준을 규정하게 되는 고온에 생체고분자가 노출되는 시간이 예를 들어 미국특허 제 6,043,063 호에 언급된 용매의 공업적 이용가능성과 직접적으로 관련이 있음을 고려해야한다. 인용된 특허의 경우, 수득되는 물질의 성질, 특히 생성물의 분자량과 관련된 성질에 대해서는 언급되어 있지 않다.
이러한 형태의 PHA 추출의 공업적인 실행가능성과 관련하여 다른 관련이 있는 사실은, PHA 추출이 강한 에너지 소비의 공정이므로 생성물의 생존능이 또한 값이 싼 재생가능 에너지 공급원의 이용가능성과 직접적으로 관련이 있다는 것이다. 위에 제시된 사실을 고려할 경우, PHA를 제조하는 공업적 방법은 단순하고 효율적인 생산 프로토콜을 가지며 원료가 폴리머로 전환시 높은 효율을 나타내는 유기체의 스트레인; 저비용 및 고수율의 원료; 높은 수율 및 효율을 가지며 환경에 공격적이지 않은 방법을 통해 고순도의 생성물을 수득하고 생체고분자의 고유 특징을 최대로 보존하게 하는 폴리머의 추출 및 정제하는 방법을 고려하여야 한다는 것으 로 결론짓는 것이 가능하다.
이러한 경제적인 측면 이외에, 그것은 더욱 환경친화적인 생성물이므로 그의 전체 공정은 친화적(compatible)이어야 한다. 즉, 임의의 생산 단계에 환경적으로 유해한 제품을 사용하지 말아야 한다. 또한, 생산 공정을 가동하는데 사용되는 에너지 공급원은 재생가능 공급원이어야 한다. 예를 들어 재생불가능한 에너지 공급원만을 사용하여 환경을 덜 파괴하는 플라스틱을 생산한다는 것은 이치에 맞지 않을 것이다.
알콜 발효의 부산물로서 수득되는 천연 용매 및 설탕과 당밀과 같은 값이 싼 원료의 입수가능성과 함께 재생가능하고 값이 싼 에너지는 설탕 및 알콜 산업을 바이오플라스틱 생산의 이상적인 거점이 되게 한다.
저가의 원료로부터 고순도 및 고분자량을 가진 PHA를 효율적을 수득할 목적으로, 동일 출원인의 이전 특허출원 제 PI04005622-1 호(PCT/BR04/000237)에는 비-할로겐화 용매를 사용함으로써 환경에 공격적이지 않는 특징을 나타내며 발효에 의해 수득된 박테리아 세포 바이오매스로부터 PHA를 회수하는 방법이 제시되어 있다.
본 방법을 수행하기 위한 용매의 적합성을 고려하면, 용매 및 PHA가 용해된 현탁액을 생성하기 위해, 후자는 건조 세포물질의 함량이 약 18 중량% 이상인 수성 현탁액 중의 세포 바이오매스 슬러리를 원료 물질로서 사용하는데, 여기서 슬러리는 용매로 되고 반응기 내에서 교반 및 가열된 다음, 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터 여전히 뜨거운 상태로 분리된다. 이어, PHA와 용매의 용액을 PHA를 침전시키는 온도로 냉각시킨 다음 미세-여과하여 약 5% 이상의 PHA 농도를 가진 PHA 페이스트를 수득하고, 이 페이스트를 가열하고 수증기의 주입에 의해 다시 교반하여 용매를 제거하고 PHA 과립의 수성 현탁액을 형성한 다음 최종적으로 분리 처리한다.
상술한 이전 방법에서 제시돤 용매를 사용하면, 용매 중 용해된 PHA의 농도는 5% 이하여서, 현탁액중의 PHA 농도를 경제적 실행가능성의 측면에서 공정을 지속가능하게 하는 최소치에 도달하도록 하기 위해서는 미세-여과 공정을 필요로 한다. 생체고분자의 분자량을 보존하기 위해서, 용액은 미세-여과 이전에 신속하게 냉각된다.
따라서, 최초로 가열된 큰 부피의 희석 현탁액이 용매 증발 이전에 냉각된 다음 재-가열되기 때문에, 이전 방법은 비교적 많은 양의 에너지를 요한다. 또한, 상기 방법은 신속한 냉각 및 미세-여과 단계를 수행하는데 필요한 고가의 장비가 제공된 설비를 필요로 한다.
언급된 용매에 대한 PHA의 낮은 용해도를 고려하면, 본 방법에 필요한 순환 용매의 부피가 크기 때문에 용매 증발을 위해서는 펌프 장비 및 더 큰 장비가 요구되며, 이를 작동하기 위해서는 더 큰 전기적 및 열적 에너지가 요구된다.
EP 0479043A1은 미생물에 의해 세포 내에서 합성된 폴리하이드록시알카노에이트를 수득하는 방법을 개시하는데, 이 방법은 발효 용액 또는 발효 용액 중에 함유되는 물의 적어도 일부를 세포 현탁액으로부터 제거하는 단계, 세포 재료에 물을 첨거하거나 첨가하지 않고, 물과 혼합하지 않으며 100℃ 미만의 끓는 점을 가지는 폴리하이드록시알카노에이트용 유기 용매로 처리하는 단계, 형성되는 추출 혼합물을 실온으로부터 유기 용매의 끓는 점까지의 온도에서 교반하고 원심 분리하거나 원심 분리하지 않고 침강시켜 수성상 및 유기상을 형성하고, 폴리하이드록시알카노에이트를 용해시킨 형태로 함유하는 유기상을, 세포 잔기를 용해되지 않은 형태로 함유하는 수성상으로부터 분리하는 단계를 포함하고, 유기상을 유기 용매의 끓는 점보다도 높은 온도에서 뜨거운 물에 주입하여 유기 용매를 증발시키고 폴리하이드록시알카노에이트를 물속에서 침전시켜 후자가 통상적인 방법으로 수득하는 것을 특징으로 한다. 적절한 용매들로서는, 메틸렌 클로라이드, 클로로폼, 및 트리클로 에틸렌과 같은 할로겐화 탄화수소가 개시되어 있다.
2001년 10월의 Nonato R.V. 등에 의한 제목이 "Integrated production of biodegradable plastic, sugar and ethanol"인 APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY의 vol. 57, no. 1-2의 페이지 1 내지 5에는, 폴리 3-하이드록시부틸산(PHB)과 관련된 공중합체들이 사탕수수 밀(mill)에 통합될 때 유리하게 생산될 수 있다는 것을 기재하고 있다. 생산 공정에 필수적인 에너지는 바이오매스에 의해 제공되고, 환경으로의 이산화탄소의 방출은 사탕수수 작물에 의한 광합성 작용으로 동화되고, 쓰레기(waste)는 수수밭으로 재활용되며, 중합체는 저비용의 탄소원 및 에너지의 이용 가능성을 고려하여 낮은 비용으로 생산될 수 있다.
발명의 요약
상기로부터, 본 발명의 일반적인 목적은 환경에 공격적이지 않은 비-할로겐화 용매를 사용하여 발효를 통해 수득된 박테리아 세포 바이오매스로부터 PHA를 회수하는 방법을 제공함으로써, 비교적 간단한 설비 및 저에너지 소비에 의해 재생가능한 원료 및 에너지를 사용하여 고순도 및 고분자량의 생성물을 생산하는 것이다.
본 발명에 따르면, 본 방법은 이하의 단계를 포함한다:
i) 세포 바이오매스를 PHA 용매의 주입, 격렬한 교반 및 반응기 내부에서 신속한 가열의 동시 조작으로 처리하여, 바이오매스 세포 벽의 파괴와 세포 바이오매스에 함유된 PHA의 용해를 유발하고, 현탁액의 중량에 대하여 적어도 2%, 바람직하게는 5% 이상의 농도로 용해된 PHA에 의해 농후해진 PHA 용매 및 세포 바이오매스의 불용성 잔류물(데브리스)을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계;
ⅱ) 반응기 내에 형성된 상기 현탁액을 분리 단계로 처리하여 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터 용해된 PHA에 의해 농후해진 용매를 회수하는 단계;
ⅲ) PHA가 농후한 PHA 용매의 용액을 교반 조작, 및 증발을 통한 실질적으로 모든 PHA 용매의 제거 및 PHA 침전을 유발하기에 충분하고 적당한 온도에서 물 및/또는 스팀으로 세척 조작으로 처리하여, 물 및 잔존하는 용매에 침전된 PHA를 포함하는 현탁액을 형성하는 단계;
ⅳ) 잔존하는 용매가 소모될 때까지 상기 PHA 현탁액에 스팀을 주입함으로써 상기 침전된 PHA의 현탁액으로부터 잔존 용매를 증발 처리하여 수성 현탁액중 정제된 PHA의 입자를 수득하는 단계;
ⅴ) PHA 용매가 소모된 수성 매질중의 현탁액을 약 45℃ 이하로 냉각하여 상기 현탁액으로부터 PHA 입자를 분리하는 단계; 및
ⅵ) 분리한 PHA 입자를 건조 단계로 처리하는 단계.
발효 세포 바이오매스로부터 PHA를 추출하기 위해서, 본 명세서에 제시된 방법은 하기 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 용매를 사용한다: 그룹 1: 메틸 포르미에이트, 에틸 포르미에이트, 프로필 포르미에이트, 부틸 포르미에이트, 이소아밀 포르미에이트, 펜틸 포르미에이트 및 카프로일 포르미에이트 (또는 헥실 포르미에이트); 그룹 2: 이소프로필 프로피오네이트, 이소아밀 프로피오네이트, 카프로일 프로피오네이트 (또는 헥실 프로피오네이트); 그룹 3: 메틸 부티레이트, 프로필 부티레이트, 이소프로필 부티레이트, 이소아밀 부티레이트, 펜틸 부티레이트 (아밀 부티레이트), 카프로일 부티레이트 (또는 헥실 부티레이트); 그룹 4: 메틸 이소부티레이트, 에틸 이소부티레이트, 부틸 이소부티레이트, 프로필 이소부티레이트, 이소프로필 이소부티레이트, 이소아밀 이소부티레이트, 펜틸 이소부티레이트 (아밀 이소부티레이트), 카프로일 이소부티레이트; 그룹 5: 프로필 발레레이트, 이소프로필 발레레이트, 부틸 발레레이트, 이소부틸 발레레이트, 이소아밀 발레레이트 (3-메틸-1-부틸의 발레레이트), 펜틸 발레레이트 (아밀 발레레이트) 및 카프로일 발레레이트 (또는 헥실); 및 그룹 6: 메틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (메틸-3-메틸 부타노에이트), 에틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (에틸 3-메틸부타노에이트), 프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소프로필 3-메틸 부타노에이트), 이소프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸-1-이소프로필 부타노에이트), 부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸부틸 3-메틸 부타노에이트), 펜틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (아밀) (펜틸-3 메틸 부타노에이트) 및 카프로일 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (헥실 3-메틸 부타노에이트).
기술된 방법은 비교적 간단하며, 사탕수수로부터의 알콜 및 설탕의 생산과 연관이 있으므로 환경 및 인체 건강에 친화적인 재생가능 에너지 및 원료의 공급원을 이용하고, 대량의 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는 경제적 대안법을 정의한다.
본 발명의 단 하나의 도면인 첨부된 도 1에 도시된 플로우챠트를 예로 들어 이하에 기술된 본 발명의 단계가 설명된다.
본 발명의 명세서에 사용된 용어의 정의 목록은 다음과 같다:
- "알케닐"은 C1 내지 Cn 길이의 불포화 탄소사슬을 의미하는데, 여기서 n 은 2 내지 약 20이며, 탄소사슬은 직쇄, 분기쇄 또는 사이클릭일 수 있고, 불포화는 단순불포화(monounsaturated), 즉 탄소사슬에 이중 또는 삼중 결합이 하나인 것; 또는 다중불포화(polyunsaturated), 즉 탄소사슬에 두 개 이상의 이중 결합 또는 두 개 이상의 삼중 결합, 또는 하나 이상의 이중 결합과 하나 이상의 삼중 결합이 있는 것일 수 있다.
- "알킬"은 C1 내지 Cn 길이의 포화 탄소사슬을 의미하는데, 여기서 n 은 2 내지 약 20이며, 탄소사슬은 직쇄, 분기쇄 또는 사이클릭일 수 있다.
- "세포 바이오매스"는 PHA 생산자 또는 고급 PHA 생산자가 되게끔 PHA를 천연적으로 또는 유전자 변형에 의해 생산할 수 있는, 임의의 유기체 또는 식물로부터 유래하는 바이오매스를 의미한다.
- "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(to comprise)"은 최종 결과에 영향을 미치지 않는 기타 공정 또는 기타 단계, 또는 기타 화합물, 또는 기타 성분이 첨가되거나 존재할 수 있음을 의미한다. 상기 용어는 또한 용어: "∼으로 구성된 (constituted of)", "∼에 의해 구성된(constituted by)", "본질적으로 ∼으로 구성된(constituted essentially of)" 및 "본질적으로 ∼에 의해 구성된(constituted essentially by)"으로 대체되거나 이들을 대체할 수도 있다.
- "Da"는 고분자의 분자량을 측정하는 단위인 달톤 (Dalton)을 의미한다.
- "바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 추출하기" 또는 "바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트의 추출"은 단일 종류의 PHA를 생산하는 바이오매스에 의해 생산된 일정 PHA를 추출함 또는 그의 추출을 의미하며, 부가적으로는, PHA 생산 세포 바이오매스가 한 종류 이상의 PHA를 생산하는 경우에 바이오매스에 의해 생산된 한 종류 이상의 PHA를 추출함 또는 그의 추출을 또한 의미한다.
- "조 추출물(coarse extract)"은, 세포 매스로부터 추출된 물 및 불순물을 용해시켜 함유하는 PHA 세포 매스로부터 추출된 PHA가 농후한 PHA 용매, 및 PHA가 추출된 세포 바이오매스의 잔류물인 불용성 고체 성분에 의해 구성된 현탁액을 의미한다.
- "실질적으로 대기압"은 대기압에 매우 근접한 압력, 즉 대기압과 동일하거나, 대기압보다 약간 높거나 낮은 압력을 의미한다.
- "추출 반응기"는 PHA 생산 세포 바이오매스로부터의 PHA 추출 조작이 실행되는 장비를 의미한다.
- 스트림(용액 또는 현탁액)을 "급속하게 냉각"시키는 것은 상기 스트림(용액 또는 현탁액)을 팽창에 의해, 또 다른 냉각 스트림과의 열교환을 통해, 및/또는 열교환기에 의한 냉각에 의해 수 초 안에 냉각시키는 것을 의미한다.
- "용매"는, 용질이라 불리는 다른 물질을 용해시켜서, 분자 크기 또는 이온 크기 측면에서 용질이 용매 중에 균일하게 분산된, 용액이라 불리는 혼합물을 형성할 수 있는 물질을 의미한다.
- "PHA 용매"는 폴리하이드록시알카노에이트를 용해시킬 수 있는 물질을 의미한다.
- "농후한(enriched) PHA 용매" 또는 "농후한 PHA 용매 용액"은 PHA 생산 세포 바이오매스로부터 추출한 PHA를 함유하는 PHA 용매 용액을 의미한다.
- "거의 없는" 또는 "실질적으로 없는"은 "매우 소량으로 있는", 또는 "미량으로 존재하는", 또는 "무의미한 양으로 있는", 또는 "거의 감지 불가능한 양으로 있는"을 의미한다.
비교적 다수의 문헌에서 유기체 또는 식물성 바이오매스 원으로부터 비-할로겐화 용매에 의한 PHA 추출에 대해 기재하고 있다. 그러나 상기한 교시를 상업적 규모로 적용하고자 하는 경우에는, 대부분 상업용 제품을 만들어내는데 중요한 특징인 세포 내 생체고분자의 본래 특성이 보존된 생성물을 수득하는 데 많은 어려움이 있다. 상기 문헌의 대부분에서는, 고온에서의 생성물의 열 민감성에 별로 주목하지 않는 것을 볼 수 있다. PHA 추출에서 사용될 후보로서 고려된 대부분의 비-할로겐화 용매는 상기 용질에 대해 낮은 용해도를 나타내고, PHA 추출 및 회수를 위해 보통 70℃ 이상의 고온을 필요로 한다. 상업적 규모에서 PHA 추출을 그런 용매로 처리하고자 하는 경우에는, PHA 회수에 필요한 시간이 보통 너무 길고, PHA를 비가역적인 방식으로 열적으로 열화시킨다. 이로써 수득된 생성물은 고온에 노출된 시간에 따라 매우 한정적인 수의 산업적 용도로 제한되거나 다른 종류의 용도로 제한된다.
본 발명은 공업적 규모의 방법으로서, 공정 단계가 a) 비-할로겐화 용매를 사용하며 세포 바이오매스로부터 추출된 대부분의 PHA가 고온에 노출되는 시간을 최소화하여 PHA의 분해를 최소화시킴으로써 PHA의 본래 특성, 특히 분자량을 최대한 보존하는 것; b) 생성된 PHA를 탈색 및 정제하는 특정의 추가 단계를 방법에 도입할 필요없이, 보통 99% 이상의 고순도이고 생체고분자의 고유 색상을 보존하며 잔류 용매가 거의 존재하지 않는 생성물을 수득하는 것; c) 바이오매스로부터 보통 90%를 초과하는 높은 수준의 PHA를 회수하는 것; d) 통합적인 방식으로, 설탕 및 알코올 산업에서 유래하는 재생가능한 원료 및 에너지 공급원을 사용하여 설탕 및 알코올을 생산하는 산업체의 이윤을 증가시키는 것을 가능하게 하는 방식으로 조합된 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 천연 또는 유전자 변형 유기체 또는 식물에 의해 생산된 PHA, 또는 합성적으로 생성된 PHA에 적용될 수 있다. 폴리하이드록시알카노에이트 또는 PHA는 하기 단위의 반복에 의해 구성된 중합체이다:
Figure 112007071164741-pct00002
상기 식에서, R은 다양한 길이의 알킬 또는 알케닐 그룹이고, m 및 n은 정수이며, 상기 언급한 중합체에서 R 및 m은 하기 값일 것으로 추정된다:
PHB: R=CH3, m=1
PHB-V: R=CH3 또는 CH3-CH2-, m=1
P4HB: R=H, m=2
P3HB-4HB: R=H 또는 CH3, m=1 또는 2
PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=1.
본 발명은 유기체의 바이오매스로부터 회수된 PHA, 바람직하게는 PHB (폴리-3-하이드록시부티레이트), PHB-V (폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레레이트)), P4HB (폴리-4-하이드록시부티레이트), P3HB4HB (폴리(3-하이드록시부티레이트-코-4-하이드록시부티레이트) 및 일부 PHAmcl (중쇄의 폴리하이드록시알카노에이트)에 적용되며, 마지막 부류중 가장 전형적인 대표종은 PHHx (폴리하이드록시헥사노에이트)이다.
비-할로겐화 용매를 사용하고 생체고분자를 열분해 조건에 단시간 노출시켜 PHA를 추출하는 방법
본 발명은 발효를 통해 수득된 박테리아 세포 바이오매스의 발효 물질을 사용하며, 추출 단계에서, 바람직하게는 가열된 액체 형태 및 증기 형태의 PHA 용매의 주입, 격렬한 교반, 및 실질적으로 대기압에서 약 90℃ 내지 용매의 비점의 온도로 세포 바이오매스를 가열하고 바이오매스에 함유된 PHA의 용해를 신속하게 유발하기 위해 반응기에서의 신속한 가열을 동시 조작으로 처리하여 현탁액의 중량에 대하여 적어도 2%, 종종 5% 이상의 농도로, 용해된 PHA에 의해 농후해진 PHA 용매 및 세포 바이오매스의 불용성 잔류물을 포함하는 현탁액을 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 형태로, 박테리아 세포 바이오매스는 건조 형태로 추출 조작에 도입되며, 추출 단계에서 수득된 조 추출물은 PHA가 농후한 PHA 용매를 포함하는 액체상 및 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물(데브리스)로 정의되는 고체상으로 구성된다.
본 발명을 수행하는 다른 방법으로, PHA가 농후한 PHA 용매와 세포 바이오매스중의 잔존하는 물을 포함하는 액체상; 잔류하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로 정의되는 고체상; 및 물 및 PHA 용매의 증기를 함유하는 증기상으로 구성된 조 추출물을 수득하기 위해, 박테리아 세포 바이오매스는 수성 현탁액 형태, 바람직하게는 10% 이상의 건조물질(중량/중량)이 농축된 슬러리라 불리는 형태로 추출 단계에 처리된다. 여러 공정 단계에서 발생하는 물 및 PHA 용매의 증기는 농축된 다음 두 개의 액체 상(PHA 추출 및 상 회수 공정으로 되돌아가는 용매-풍부 상; 및 그안에 함유된 PHA 용매를 회수하게 하는 공정으로 재순환되는 용매-부족 상)으로 분리된다.
세포 바이오매스를 가열하는 것과 마찬가지로, 본 과정은 또한 PHA 용매와 물로 구성된 이원 혼합물인 슬러리와 함께 공급되는 과량의 물을 증기 형태로 제거하는 효과를 유발한다. 이어, 실질적으로 바이오매스와 함께 반응기에 도입된 대부분의 물을 함유하는 증기상을 반응기로부터 추출하고 후속적으로 응축함으로써, 추출된 세포 바이오매스의 불용성 잔류물 이외에 PHA가 농후한 PHA 용매의 용액 및 상기 용매에 용해된 소량의 물로 구성된 현탁액을 수득할 수 있다.
PHA를 추출 및 회수하는 방법에서, 하기 그룹중에서 선택된 적어도 하나의 용매가 사용된다:
- 메틸 포르미에이트, 에틸 포르미에이트, 프로필 포르미에이트, 부틸 포르미에이트, 이소아밀 포르미에이트, 펜틸 포르미에이트 (아밀 포르미에이트) 및 카프로일 포르미에이트 (또는 헥실 포르미에이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 프로필 포르미에이트, 부틸 포르미에이트, 이소아밀 포르미에이트, 펜틸 포르미에이트, 더욱더 바람직하게는 이소아밀 포르미에이트로 구성된 용매의 그룹 1.
- 에틸 프로피오네이트, 이소프로필 프로피오네이트, 이소아밀 프로피오네이트, 카프로일 프로피오네이트 (또는 헥실 프로피오네이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 이소프로필 프로피오네이트, 이소아밀 프로피오네이트, 더욱더 바람직하게는 이소아밀 프로피오네이트로 구성된 용매의 그룹 2.
- 메틸 부티레이트, 프로필 부티레이트, 이소프로필 부티레이트, 이소아밀 부티레이트, 펜틸 부티레이트 (아밀 부티레이트), 카프로일 부티레이트 (또는 헥실 부티레이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 프로필 부티레이트, 이소프로필 부티레이트, 이소아밀 부티레이트, 펜틸 부티레이트 (아밀 부티레이트), 더욱더 바람직하게는 이소아밀 부티레이트 (3-메틸-1-부틸의 부티레이트)로 구성된 용매의 그룹 3.
- 메틸 이소부티레이트, 프로필 이소부티레이트, 이소프로필 이소부티레이트, 이소아밀 이소부티레이트, 펜틸 이소부티레이트 (아밀 이소부티레이트), 카프로일 이소부티레이트 (또는 헥실 이소부티레이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 프로필 이소부티레이트, 이소프로필 이소부티레이트, 이소아밀 이소부티레이트, 펜틸 이소부티레이트 (아밀 이소부티레이트), 더욱더 바람직하게는 이소아밀 이소부티레이트 (3-메틸-부틸 이소부티레이트)로 구성된 용매의 그룹 4.
- 프로필 발레레이트, 이소프로필 발레레이트, 부틸 발레레이트, 이소부틸 발레레이트, 이소아밀 발레레이트 (3-메틸-1-부틸의 발레레이트), 펜틸 발레레이트 (아밀 발레레이트) 및 카프로일 발레레이트 (또는 헥실 발레레이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 프로필 발레레이트, 이소프로필 발레레이트, 부틸 발레레이트, 이소부틸 발레레이트, 이소아밀 발레레이트, 펜틸 발레레이트 (아밀 발레레이트), 더욱더 바람직하게는 이소아밀 발레레이트로 구성된 용매의 그룹 5.
- 메틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (메틸-3-메틸 부타노에이트), 에틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (에틸 3-메틸부타노에이트), 프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (프로필 3-메틸 부타노에이트), 이소프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소프로필 3-메틸 부타노에이트), 부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸부틸 3-메틸 부타노에이트), 펜틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (아밀) (펜틸-3 부타노에이트) 및 카프로일 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (헥실 3-메틸 부타노에이트) 및 이들 용매의 혼합물, 더욱 바람직하게는 프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트), 이소프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트), 부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트), 이소부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트), 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트), 펜틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (아밀), 더욱더 바람직하게는 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트)로 구성된 용매의 그룹 6.
본 발명의 임의의 형태로, 추출 단계에서 배출액인 수득된 조 추출물은, 이어 PHA가 농후한 PHA 용매 용액으로부터 예를 들어, 여과, 원심분리, 더욱 바람직하게는 불용성 고체가 없는 여과 스트림을 발생하는 여과에 의해 불용성 고체를 분리하는 공정으로 처리하면, PHA가 농후한 PHA 용액 및 분리된 불용성 고체를 함유하는 케이크를 포함한다.
본 명세서에 고려된 용매를 사용하면 용해된 PHA에 의해 농후해진 PHA 용매 현탁액이 최소 약 2 중량%의 PHA 농도를 나타내며, 선택된 용매의 적당한 부분은 현탁액의 약 5 중량% 이상이다. 사용된 용매가 약 5 중량%와 같거나 큰 PHA 용해도를 가진 것들인 경우, PHA 용액으로부터 용매를 제거하는 단계는 냉각 및 미세여과의 중간 단계를 거치지 않고 수행된다. 그후, 용해된 PHA를 함유하고 바이오매스의 불용성 잔류물을 함유하지 않는 용액은 바람직하게는 추출 온도에서 바람직하게는 분쇄 방식(pulverized manner)으로 스팀 흐름으로 공급된 다음, 진공 내지 실질적으로 대기압의 압력, 바람직하게는 100 내지 600 mmHg의 진공으로 유지되는 반응기에서 즉시 팽창되어, 물과 공급 용액의 일부인 PHA 용매의 상당 부분을 함유하는 이원 스팀 흐름 및 도입된 증기 일부의 응축에 의해 생성된 잔류 용매의 분획과 수중의 미분(finely divided) PHA 입자의 현탁액을 생성한다. 이어, 스팀 주입을 통해 잔존하는 액체(모액)중 최종 잔류 용매가 완전히 소모될 때까지 상기 현탁액을 증발 처리한다. 이로써, 공정의 말기에 수중에 미분산된 PHA 입자의 현탁액이 수득된다. 이어, 이 현탁액을 약 45℃ 이하로 신속하게 냉각시키고, 이 현탁액중에 분산된 PHA 입자를 분리하는 공정, 예를 들어 PHA 입자를 함유하는 여과 케이크를 실질적으로 용매를 함유하지 않는 물로 여과 및 세정하는 것에 의해 처리한다. 이렇게 하여 수득된 PHA 입자를 이어 건조 공정으로 처리하여 높은 수준의 순도, 지극히 낮은 수준의 잔류 용매, 착색, 회분 및 불순물, 및 높은 전체 수율(즉, 원래 바이오매스에 함유된 PHA에 대하여 회수된 PHA의 양이 약 90% (중량/중량)을 초과함), 및 300,000 Da 이상, 보통은 400,000 내지 800,000 Da의 분자량을 나타내는 분말 형태의 PHA를 수득한다.
본 발명에 따라, PHA 용액으로부터 용매의 제거는 증발 챔버내에서 PHA 용액을 스팀 흐름으로 직접 분쇄한 다음 물과 용매의 혼합물에서 PHA를 침전시키는 것에 의해 수행된다.
본 발명을 수행하는 한 방법에 따라, PHA 용액으로부터 용매를 제거하는데 사용되는 스팀은 증발 챔버중의 작동 압력에 관한 과열 스팀(superheated steam)이다. 증발 챔버는 대기압 이하의 압력 또는 실질적으로 대기압에서 유지될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명을 수행하는 다른 방법으로, PHA 용액으로부터 용매의 제거는 물 및 스팀으로 용액을 직접 주입하고 대기압 이하의 압력 또는 실질적으로 대기압으로 유지된 반응기에서 교반하에 가열함으로써 수행된다.
본 발명에서, 그룹 1 내지 그룹 6에 속하는 선택된 용매는 예를 들어 산 촉매제(이온 H+)의 존재하에 알콜과 카복시산의 유기 합성으로서 에스테르화 반응로 불리는 공지된 반응을 통해 수득될 수 있다[MORRISON, R. e BOYD, R., Quimica Organica, 9a ed., Fundacao Calouste Gulbenkian, Lisboa, Portugal, p. 991-1016, 1990 e Solomons, T.W. G., Organic Chemistry, 2a ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, USA, p. 749-801, 1980]. 특히 그룹 6에서, 에스테르화 반응에 관여하는 산은 3-메틸-1-부탄산 또는 이소아밀산이고, 이것은 예를 들어 전통적인 유기화학 문헌(예를 들어, MORRISON, R. e BOYD, R., Quimica Organica, 9a ed., Fundacao Calouste Gulbenkian, Lisboa, Portugal, p. 616-618 e 471-472, 1990 e Solomons, T.W. G., Organic Chemistry, 2a ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, USA, p. 654-657, 1980)에 설명된 바와 같은 상전이 촉매 공정을 통한 1차 알콜인 이소아밀 알콜 (3-메틸-1-부탄올)의 산-촉매 산화에 의해 수득될 수 있음이 강조되어야 한다.
상술한 선택 용매를 사용하면 예를 들어 브라질 특허출원 제 PI 04005622-1 호(PCT/BR04/000237) 및 미국 특허 제6,043,063 호에 기술된 용매들, 예컨대 이소아밀 아세테이트, 부틸 아세테이트, 1-헥산올, 아밀 알콜, 이소아밀 알콜 및 프로필 프로피오네이트 보다 PHA를 약 2-20 배 가용화하는 이점을 나타낸다. 용해도는 사용되는 용매 및 선택된 추출 온도에 의존한다.
본 명세서에 기술된 방법과 연관된 본 발명의 목적으로서 선택된 용매에 의해 달성된 우수한 용해도는 다음을 가능하게 한다:
a) 유기체의 바이오매스로부터 PHA를 신속하고 효율적으로 추출하는 것;
b) 스팀 흐름으로 주입되고 증발 챔버, 바람직하게는 진공하에서 팽창된 PHA 용액에 함유된 상당량의 용매를 동시적으로 증발시키는 것(여기서, 공급된 PHA 용액에 함유된 열감수성 부분은, 증기에 의해 동시에 냉각되고 시스템에 남게 되는 증기로부터 응축된 물에서 PHA의 침전을 유발하는 것과 같은 시간에 회수되며; 후자는 주입된 스팀에 의해 들어가게 되는 물의 부분 및 그와 함께 공급된 PHA 용액에 함유된 상당량의 용매를 함유함);
c) 5 중량%와 같거나 그 이상의 PHA 용해도를 가진 용매의 경우, 항목 b)에 기술된 바와 같은 단계를 사용함으로써, PHB 냉각, 결정화 또는 침전, 및 기계적 농축(또는 막에 의함)의 추가적 단계를 제거하게 되어, 용매 중 PHB 현탁액의 증발 유닛을 크게 감소시키고 PHA 불용화제(역용매) 첨가의 필요성을 동시에 배제하는 것;
d) 약 2 중량% 내지 약 5 중량%의 PHA 용해도를 가진 용매의 경우, 항목 b)에 기술된 바와 같은 단계를 사용함으로써, PHB 냉각, 결정화 및 침전, 및 기계적 농축(또는 막에 의함)의 사이즈를 감소시키게 되어, PHA 불용화제(역용매) 첨가의 필요성을 배제하는 것;
e) 항목 b)에 기술된 스팀 작용을 통해, 용매를 신속하게 증발시키고 PHA를 침전시킴으로써, 분자량에 대한 손상가능성을 감소시킴과 동시에 그와 접촉하여 이들을 수상(water phase)으로 전위시키는 경우 PHA 용매에 용해된 불순물을 열-기계적 작용에 의해 제거하는 것; 추가로 미분산 PHA 입자를 수득하게 하여 잔류 용매 및 불순물의 제거 및 또한 후속 건조 조작을 용이하게 하는 것;
f) 항목 b)에 기술된 방법에 따라, 증기의 추진 작용을 통해 스팀 흐름으로 PHA 용액을 분쇄하는 것; 및
g) PHA 추출 공정에 필요한 순환 용매의 양을 유의적으로 감소시킴으로써, 공업적으로 사용될 수 있는 장비의 상당 부분에 대하여 비례적으로 크기를 감소시키고, 공정에 필요한 열적 및 기계적 에너지 소비를 크게 감소시킬 뿐만 아니라 추출 및 정제 공정에서 비용을 크게 감소시키는 것.
실시예 1: 용매로서 이소아밀 프로피오네이트를 사용하는 PHB 추출 및 회수
500㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질 78.4%와 분자량 1,000,000 Da의 PHB 58.8%를 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)의 농축 바이오매스 50 g 및 이소아밀 아세테이트 300 g을 첨가하였다. 이어서, 증류 플라스크에 연결된 가열 모포(heating blanket)를 사용하여 상기 현탁액으로부터 용매와 물의 분획을 교반하에 증발시켰다. 이렇게 하여 생성된 이원 증기를 응축용 직선관 응축기(Liebig 형)에서 처리하고, 생성된 응축물을 삼각 플라스크(Erlenmeyer recipient)에 수집하였다. 상기 현탁액을 추출 온도에 도달할 때까지 교반하에 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기상과 접촉하고 있는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 3 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비점은 약 95℃(초기 온도)에서 약 115℃(추출 온도)로 변하였다. 이어, 상기 현탁액을 115℃(추출 온도)의 온도에서 약 5분 동안 교반하에 응축물 환류 상태로 유지하게 한 다음, 여과 용매에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해 가열된 상태로 여과지로 여과하였다. 이어, 약 8.82% (w/w)의 가용화된 PHB를 함유하는 뜨거운 여과 물질을 PHB 침전을 위해 냉각시키고 여과를 통해 농축시킨 다음 용매를 증발처리하여 건조시켰다. 수득된 PHB의 분자량은 약 558,000 Da이었다. 본 시험에 사용된 농축 바이오매스의 양은 사용된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는데 필요한 양보다 약 2.0-3.5 배 더 많았다. 따라서, 사용된 추출 온도에서의 용매(이소아밀 프로피오네이트)에 대한 용질(PHB)의 포화 농도를 결정할 수 있었다.
실시예 2: 용매로서 프로필 부티레이트를 사용하는 PHB 추출 및 회수
500㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질 78.4%와 분자량 1,000,000 Da의 PHB 58.8%를 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)의 농축 바이오매스 50 g 및 프로필 부티레이트 300 g을 첨가하였다. 이어서, 증류 플라스크에 연결된 가열 모포를 사용하여 상기 현탁액으로부터 용매와 물의 분획을 교반하에 증발시켰다. 이렇게 하여 생성된 이원 증기를 응축용 직선관 응축기(Liebig 형)에서 처리하고, 생성된 응축물을 삼각 플라스크에 수집하였다. 상기 현탁액을 추출 온도에 도달할 때까지 교반하에 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기상과 접촉하고 있는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 3 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비점은 약 98℃(초기 온도)에서 약 120℃(추출 온도)로 변하였다. 이어, 상기 현탁액을 120℃(추출 온도)의 온도에서 약 5 분 동안 교반하에 응축물 환류 상태로 유지하게 한 다음, 여과 용매에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해 가열된 상태로 여과지로 여과하였다. 이어, 약 3.0% (w/w)의 가용화된 PHB를 함유하는 뜨거운 여과 물질을 PHB 침전을 위해 냉각시키고 여과를 통해 농축시킨 다음 용매를 증발처리하여 건조시켰다. 수득된 PHB의 분자량은 약 638,000 Da이었다. 본 시험에 사용된 농축 바이오매스는 사용된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는데 필요한 양보다 약 2.0-3.5 배 많은 과량으로 첨가되었다. 따라서, 사용된 추출 온도에서의 용매(프로필 부티레이트)에 대한 용질(PHB)의 포화 농도를 결정할 수 있었다.
실시예 3: 용매로서 이소아밀 발레레이트를 사용하는 PHB 추출 및 회수
500㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질 78.4%와 분자량 1,000,000 Da의 PHB 58.8%를 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)의 농축 바이오매스 50 g 및 이소아밀 발레레이트 300 g을 첨가하였다. 이어서, 증류 플라스크에 연결된 가열 모포를 사용하여 상기 현탁액으로부터 용매와 물의 분획을 교 반하에 증발시켰다. 이렇게 하여 생성된 이원 증기를 응축용 직선관 응축기(Liebig 형)에서 처리하고, 생성된 응축물을 삼각 플라스크에 수집하였다. 상기 현탁액을 추출 온도에 도달할 때까지 교반하에 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기상과 접촉하고 있는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 3 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비점은 약 98℃(초기 온도)에서 약 130℃(추출 온도)로 변하였다. 이어, 상기 현탁액을 130℃(추출 온도)의 온도에서 약 10 분 동안 교반하에 응축물 환류 상태로 유지하게 한 다음, 여과 용매에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해 가열된 상태로 여과지로 여과하였다. 이어, 약 27.8% (w/w)의 가용화된 PHB를 함유하는 뜨거운 여과 물질을 PHB 침전을 위해 냉각시키고 여과를 통해 농축시킨 다음 용매를 증발처리하여 건조시켰다. 수득된 PHB의 분자량은 약 735,000 Da이었다. 본 시험에 사용된 농축 바이오매스는 사용된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는데 필요한 양보다 약 2.0-3.5 배 많은 과량으로 첨가되었다. 따라서, 사용된 추출 온도에서의 용매(이소아밀 발레레이트)에 대한 용질(PHB)의 포화 농도를 결정할 수 있었다.
실시예 4: 용매로서 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸-1-부탄올의 3- 메틸 -1- 부타노에이트 )를 사용하는 PHB 추출 및 회수
500㎖ 둥근 바닥 증류 플라스크에, 건조 물질 78.4%와 분자량 1,000,000 Da의 PHB 58.8%를 함유하는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus)의 농축 바이오매스 50 g 및 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸-1-부탄올의 3-메틸-1-부타노에이트) 300 g을 첨가하였다. 이어서, 증류 플라스크에 연결된 가열 모포를 사용하여 상기 현탁액으로부터 용매와 물의 분획을 교반하에 증발시켰다. 이렇게 하여 생성된 이원 증기를 응축용 직선관 응축기(Liebig 형)에서 처리하고, 생성된 응축물을 삼각 플라스크에 수집하였다. 상기 현탁액을 추출 온도에 도달할 때까지 교반하에 증발 공정에서 유지시켰다. 온도는, 플라스크 노즐 중 하나에 고정되고 플라스크 내부의 증기상과 접촉하고 있는 수은 온도계로 읽었다. 추출 온도는 약 3 분의 증발 시간이 경과한 후에 도달하였고, 혼합물의 비점은 약 98℃(초기 온도)에서 약 125℃(추출 온도)로 변하였다. 이어, 상기 현탁액을 125℃(추출 온도)의 온도에서 약 10 분 동안 교반하에 응축물 환류 상태로 유지하게 한 다음, 여과 용매에 용해된 부분으로부터 불용성 부분을 분리하기 위해 가열된 상태로 여과지로 여과하였다. 이어, 약 9.8% (w/w)의 가용화된 PHB를 함유하는 뜨거운 여과 물질을 PHB 침전을 위해 냉각시키고 여과를 통해 농축시킨 다음 용매를 증발처리하여 건조시켰다. 수득된 PHB의 분자량은 약 575,000 Da이었다. 본 시험에 사용된 농축 바이오매스는 사용된 추출 온도에서 용매 중 PHB 포화 농도에 도달하는데 필요한 양보다 약 2.0-3.5 배 많은 과량으로 첨가되었다. 따라서, 사용된 추출 온도에서의 용매(이소아밀 이소발레레이트)에 대한 용질(PHB)의 포화 농도를 결정할 수 있었다.

Claims (22)

  1. i) 세포 바이오매스를 PHA 용매의 주입, 격렬한 교반 및 반응기 내부에서의 신속한 가열의 동시 조작으로 처리하여, 바이오매스 세포 벽의 파괴와 세포 바이오매스에 함유된 PHA의 용해를 유발하고, 현탁액의 중량에 대하여 적어도 2%의 농도로 용해된 PHA에 의해 농후해진 PHA 용매 및 세포 바이오매스의 불용성 잔류물을 포함하는 현탁액을 형성하는 단계로서,
    사용된 PHA 용매가 메틸 포르미에이트, 에틸 포르미에이트, 프로필 포르미에이트, 부틸 포르미에이트, 이소아밀 포르미에이트, 펜틸 포르미에이트 (아밀 포르미에이트) 및 카프로일 포르미에이트 (또는 헥실 포르미에이트) 및 이들 용매의 혼합물; 에틸 프로피오네이트, 이소프로필 프로피오네이트, 이소아밀 프로피오네이트, 카프로일 프로피오네이트 (또는 헥실 프로피오네이트) 및 이들 용매의 혼합물; 메틸 부티레이트, 프로필 부티레이트, 이소프로필 부티레이트, 이소아밀 부티레이트, 펜틸 부티레이트 (아밀 부티레이트), 카프로일 부티레이트 (또는 헥실 부티레이트) 및 이들 용매의 혼합물; 메틸 이소부티레이트, 프로필 이소부티레이트, 이소프로필 이소부티레이트, 이소아밀 이소부티레이트, 펜틸 이소부티레이트 (아밀 이소부티레이트), 카프로일 이소부티레이트 (또는 헥실 이소부티레이트) 및 이들 용매의 혼합물; 프로필 발레레이트, 이소프로필 발레레이트, 부틸 발레레이트, 이소부틸 발레레이트, 이소아밀 발레레이트 (3-메틸-1-부틸 발레레이트), 펜틸 발레레이트 (아밀 발레레이트), 카프로일 발레레이트 (또는 헥실 발레레이트) 및 이들 용매의 혼합물; 및 메틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (메틸-3-메틸 부타노에이트), 에틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (에틸 3-메틸부타노에이트), 프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (프로필 3-메틸 부타노에이트), 이소프로필 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소프로필 3-메틸 부타노에이트), 부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소부틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (이소부틸 3-메틸 부타노에이트), 이소아밀 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (3-메틸부틸 3-메틸 부타노에이트), 펜틸 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (아밀) (펜틸-3 메틸 부타노에이트), 카프로일 이소아밀레이트 (이소발레레이트) (헥실 3-메틸 부타노에이트) 및 이들 용매의 혼합물로 구성된 용매의 그룹중에서 선택되는, 현탁액을 형성하는 단계;
    ⅱ) 반응기내에 형성된 상기 현탁액을 분리 단계로 처리하여 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로부터 용해된 PHA에 의해 농후해진 용매를 회수하는 단계;
    ⅲ) PHA가 농후한 PHA 용매의 용액을 교반 조작, 및 증발을 통한 실질적으로 모든 PHA 용매의 제거 및 PHA 침전을 유발하기에 충분한 온도에서 물과 스팀 또는 물이나 스팀으로 세척 조작으로 처리하여, 물 및 잔존하는 용매에 침전된 PHA를 포함하는 현탁액을 형성하는 단계;
    ⅳ) 잔존하는 용매가 소모될 때까지 상기 PHA 현탁액에 스팀을 주입함으로써 상기 침전된 PHA의 현탁액으로부터 잔존 용매를 증발 처리하여 수성 현탁액중 정제된 PHA의 입자를 수득하는 단계;
    ⅴ) PHA 용매가 소모된 수성 매질중의 현탁액을 45℃ 이하로 냉각하여 상기 현탁액으로부터 PHA 입자를 분리하는 단계; 및
    ⅵ) 분리한 PHA 입자를 건조 단계로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하여, 발효에 의해 수득된 박테리아 세포 바이오매스로부터 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 추출 및 회수하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    사용된 PHA 용매가 이소아밀 프로피오네이트, 프로필 부티레이트, 이소아밀 발레레이트, 및 이소아밀 이소아밀레이트 또는 이들의 혼합물로 구성된 용매의 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 PHA 용매는 이소아밀 프로피오네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    사용된 PHA 용매에 대한 PHA 용해도가 적어도 5 중량%이 되게 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    사용된 PHA가 폴리-3-하이드록시부티레이트(PHB), 폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레레이트)(PHBV) 및 이들 중합체와 공중합체의 혼합물로 정의되는 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 PHA가 사탕수수로부터 추출된 설탕을 주원료로서 이용하여 PHA를 생합성할 수 있는 유기체를 사용하는 박테리아 발효에 의해 생산되고, 본 방법에 필요한 열에너지 및 전기에너지를 발생시키는데 사용되는 주된 에너지 공급원이 사탕수수 찌꺼기인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    농축 세포 바이오매스에 용매를 주입하는 단계가, 액체 PHA 용매 및 증기 형태의 PHA 용매를 주입함으로써 실질적으로 대기압하에 90℃ 내지 용매의 비점의 온도에서 세포 바이오매스의 가열을 유발하는 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    PHA 용액으로부터 용매의 제거가, 증발 챔버내에서 PHA 용액을 스팀 흐름으로 직접 분쇄(pulverization)한 다음 응축된 물과 용매의 혼합물에서 PHA를 침전시키는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    용액을 스팀 흐름으로 직접 주입함으로써 증발에 의해 PHA 용액으로부터 용매를 제거하는데 사용되는 스팀이 증발 챔버중의 작동 압력에 대한 과열 스팀(superheated steam)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    PHA 용액으로부터 용매의 제거가, 대기압 이하의 압력으로 유지되는 증발 챔버에서 스팀 흐름으로 용액을 직접 주입하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    PHA 용액으로부터 용매의 제거가, 실질적으로 대기압으로 유지되는 증발 챔버에서 스팀 흐름으로 용액을 직접 주입하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    PHA 용액으로부터 용매의 제거가, 물 및 스팀으로 용액을 직접 주입하는 단계 및 대기압 이하의 압력으로 유지되는 반응기에서 교반하에 가열하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서,
    PHA 용액으로부터 용매의 제거가, 물 및 스팀으로 용액을 직접 주입하는 단계 및 실질적으로 대기압으로 유지되는 반응기에서 교반하에 가열하는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    추출 공정에 사용되는 바이오매스가 수성 현탁액 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    PHA 용매가 물과 함께 증기상으로 이원 혼합물을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    세포 바이오매스 현탁액에 용매를 주입하는 단계가, 액체 PHA 용매 및 증기 형태의 PHA 용매를 주입함으로써 실질적으로 대기압에서 90℃ 내지 용매의 비점의 온도로 세포 바이오매스의 가열을 유발하여 PHA가 농후한 PHA 용매와 세포 바이오매스의 잔존하는 물을 포함하는 액체상; 잔존하는 세포 바이오매스의 불용성 잔류물로 정의되는 고체상; 및 물과 PHA 용매 증기를 함유하는 증기상을 형성하는 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    실질적으로 바이오매스를 통해 반응기 내부에 도입된 과량의 물을 함유하는 증기상을 추출하는 추가의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 바이오매스가 천연 또는 유전자 변형 유기체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
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