TWI363094B - Process for extracting and recovering polyhydroxyalkanoates (phas) from cellular biomass - Google Patents

Description

1363094 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種使用對環境無侵蝕性之非齒化PHA溶 劑由細菌細胞生質萃取及回收聚羥基烷酸酯（PHA)之方 法’該方法允許獲得高純度及高分子量之聚羥基烷酸酯 (PHA)。 【先前技術】 目前已知在全世界工業内需要藉由使用可再生原料及能 源經由對環境無侵蝕性之方法生產生物可降解性及生物相 容性材料。 在現代社會中，大規模使用塑料材料正導致各種日益嚴 重之環境問題。鑒於此等問題，生物可降解性塑料樹脂之 研製已受到全世界關注，主要為藉助於清潔技術使用可再 生來源生產之彼專塑料樹脂。如相同申請者之巴西專利申 請案PI04005622-l(PCT/BR04/000237)之引言中描述，最可 月匕在市％上成功之此等生物可降解性生物聚合物的應用包 括如拋棄式材料之產品，例如封裝、化妝品接受器及有毒 農用化學品接受器、醫學及醫藥物品。 生物可降解性生物聚合物之重要家族為聚羥基烷酸酯 (PHA)，其為由大量生物天然合成之聚酯。在文獻中所描 述之多於170種代表物中，PHA之商業重要性不僅直接與 生物可降解性相關且與其熱機械特性及生產成本直接相 關。因此，僅有一些PHA已找到工業應用，最具代表性物 為PHB(聚·3·經基丁酸酷）、pHB_v(聚（經基丁酸醋-共經基 I09033.doc 1363094 戊酸酯））、P4HB(聚（4-羥基丁酸酯））、P3HB4HB(聚（3-羥基 丁酸酯-共-4經基丁酸酯））及一些PHAmcl(中長鏈聚經基炫 酸酯），此最後家族之最典型代表物為PHHx(聚羥基己酸 酯）。 該等PH A之化學結構可描述為由以下單元重複構成之聚 合鏈： r f ffl —CH——(CH2)m— C——

其中R為可變長度之烧基或稀基且m及n為整數，在以上提 及之聚合物中R及m採用以下值： PHB: R=CH3, m=l PBH-V: R = CH3 或 CH3-CH2, m=l P4HB: R = H, m=2 P3HB-4HB: R=H 或 CH3，m=l 或 2 • PHHx: R=CH3-CH2-CH2-, m=l 在近二十年中尤其在生物技術上自然科學之重大發展已 允δ爷在PHA之商業生產中使用最不同的天然或基因上修飾 ί 之有機體。尤其與本發明相關的是所確定菌株之用途，該 . 等菌株在其内部能生產及累積富有意義之大量此等聚合 物。在允許達到高細胞密度、高含量細胞内聚合物及與工 業方法相容之產量的特定條件下培養，此等菌株可使用不 同可再生原料，諸如蔗糖汁、糖蜜或經水解之纖維素萃取 I09033.doc 1363094 物。 雖然實際上已嘗試應用諸如描述於美國專利3丨〇7丨72中 之細菌細胞（不使用PHA助溶劑）作為可塑材料，但在大部 分狀況下PHA之商業應用需要其純度足夠高以獲得所要塑 料特性。.為達成加工尤其PHA之生物聚合物之純度的適當 3里通*存在必需步驟，在該專步驟中必須利用用於由 剩餘生質萃取及回收PHA之溶劑。 在專利EPA-0 1455233 A2中，已描述藉由使用酶及/或界 面活性劑以溶解非PHA細胞材料進行含PHA之細胞的水性 懸浮液的消化的若干可能性，考慮到酶非常昂貴且在該方 法中不可回收，在使用溶劑時不願此狀況發生。亦需要細 胞材料之高度稀釋，此導致在該方法中產生大量排出物。 通常所提議萃取方法基本上在於曝露含生物聚合物之幹 細胞生質或濕細胞生質以與溶解其之溶劑有力接觸，接著 為分離細胞殘餘物（碎片）步驟。接著含有生物聚合物之溶 液接受減溶劑之添加，此引起生物聚合物在溶劑中沉澱 (見’例如巴西專利PI 9103116-8 ’ 1991年7月16日申請及 1993年2月24公佈）。 在經由有機溶劑之萃取方法中，所利用之溶劑為經部分 鹵化之烴，諸'如三氯甲烷（美國專利·327561〇)、亞甲基-乙 醇氣化物（US-3044942)、熔點在65。〇至17〇〇c範圍内之氣乙 烷及氯丙烷、1，2,3-二氯乙烷及i’13·三氣丙烷（專利 EP-0014490 B 1及 EP 2446859)。 諸如二氣甲烷、二氣乙烷及二氣丙烷之其他齒化化合物 I09033.doc 1363094 於美國專利 4,562,245(1985) 、 4,310,684(1982)、 4’705,604(1987)及歐洲專利〇36 699(198〇及德國專利 239,609(1986)中提到。 現今利用卣化溶劑由生質萃取及純化生物聚合物之方法 已疋王禁止，因為該等方法對環境及人類健康具有高度侵 蝕性。因此，待用作由細胞生質萃取生物聚合物的潛在萃 取劑的洛劑應首先滿足對環境無侵蝕性之條件。 就此而5，巴西專利？1 93〇2312〇(1993年申請及2〇〇2年 4月30日頒予）屐現一種由細菌生質萃取生物聚合物之方 法，該方法使用具有3個碳之高鏈醇類或自其衍生之乙酸 酯作為溶劑。此專利首選異戊醇(3_甲基·i•丁醇）、乙酸戊 酯（或戊基-乙酸酯）及雜醇油，該雜醇油為作為醇類發酵之 釗產獲得且為異戊醇為主要成分之高級醇類的混合物。 此專利亦以使用單一溶劑作為萃取劑及純化劑為特徵不 需要利用減溶劑或反萃溶劑及/或邊界非溶劑。藉由冷卻 溶液進行ΡΗΑ溶液之溶質（生物聚合物）之沉澱。 美國專利6,043,063(1998年4月14日申請及2000年3月28 日頒予）、仍6,087,471(1998年4月14曰申請及2〇〇〇年6月 π日頒予）及國際專利申請案冒〇_98/46783(1997年4月15日 申請）提及可潛在地使用作為由生質萃取生物聚合物之溶 劑的非函化溶劑的廣泛列表，但其之許多展現除高成本外 之諸如工業處理困難、毒性之特徵。在巴西專利 ΡΙ 93023 12-0中亦提到之溶劑亦包括在該廣泛列表中，僅 小部分溶劑具·有工業上用於由細菌生質或植物生質萃取生 I09033.doc 1363094 物么合物之潛能，此歸因於關於與生物聚合物不相容之問 題或歸因於其毒性、爆炸性及高成本。 因為該等生物聚合物為熱敏性，即當其經受確定數值以 上之溫度時，其不可逆地降解、損失分子量，此最終可影 響表徵其為熱塑性塑料之特性，所以基本所記住之具有工 業上使用潛能的溶劑的列表變得甚至更受限制。若溶劑與 允許萃取生物聚合物而不引起分子量上重大改變的適當方 法聯合，則為促進生物聚合物之萃取而選擇之溶劑的工業 利用潛能將會增加。雖然各種應用使用具有在1〇,〇〇〇至 50,000祀圍内之低分子量的pHA，但在更大商業應用範圍 内超過500,〇〇〇 Da之分子量符合需要。 如相同申請者之PI〇4〇05622-l(PCT/BR04/0〇〇237)之以上 提及先前專利申請案中所討論，為生產具有分子量盡可能 接近於最初分子量意即在細胞内時PHA之分子量的聚羥基 烷酸酯（PHA)，重要的係考慮以下狀況：pHA溶劑需要加 熱至70 C以上以溶解生物聚合物；其在加工期間保持曝露 於此溫度時間越長，其將降解越多，此實情可不可彌補地 削弱其熱塑性特性。 舉例而言，最初含有LOOOOOO Da分子量且經受異戊醇 在110°C下之萃取的聚羥基丁酸酯曝露5分鐘之時間將產生 95 1,230 Da;曝露15分鐘，產生853 692 Da;曝露3〇分 鐘’產生707,410 Da;曝露60分鐘，產生414 77i Da;及 曝露90分鐘’產生122,230 Da» 考慮到除萃取外，為獲得具有良好機械特性之純淨產 I09033.doc •10- 物，諸如溶劑之蒸發及乾燥的其他操作係必需的，且此等 操作多次將主物聚合物曝露於關於該材料之臨界情況，不 難想像加工此種材料之内在困難。除溶劑之外，希望有一 種不熱降解產物之適當方法。 鑒於生物聚合物之熱敏性及為達成生產具有高分子量之 材料之目的’應考慮溶劑(例如美國專利6,043,063中提及 之冷剑）之工業利用潛能與生物聚合物在萃取及回收方法 中曝露於彼等高溫的時間密切相Μ，此將界^生物聚合物 經受之熱㈣水平。在所提到之專利中，未涉及所獲得材 料之特性尤其與產物分子量相關之材料特性。 其他關於此模式ΡΗΑ萃取之工業生存力之相應實情為， 因為其為一種強烈能量消耗方法，所以產品之生存力亦與 低成本可再生能量來源密切相關。 考慮到以上所暴露之實情，可能推斷用於生產ρΗΑ之工 業方法應預期：展現原料轉變為聚合物之高效率的微生物 菌株’其具有簡單且有效之生產協定；低成本及高產量之 原料；萃取及純化聚合物之程序，其允許以高產量及效率 且經由對環境無侵蝕性之方法獲得高純度、最大化保存生 物聚合物之最初特徵之產品。 除此等經濟方面外，因為其一種更環境友好之產品，所 以其整個方法應具有相容性。因此，在任一生產步驟中應 避免使用對環境有害之產品。此外，用以運行該生產之方 法的能量來源應來自可再生來源。例如若僅使用非可再生 能量來源，則生足低環境影響之產品將無意義。 I09033.doc 1363094 與可用廉價原料（糖及糖蜜）及作為醇發酵之副產物獲得 之天然；容劑聯合之可再生及廉價⑫量使得糖及醇工業成為 生產生物塑料之理想發源地。 針對由低成本原料有效獲得之具有高純度及高分子量之 PHA，相同申請者之先前專利申請案PI04005622-1 (PCT/BR2004/000237)提議一種由發酵獲得之細菌細胞生 質回收PHA之方法，該方法藉由使用非鹵化溶劑展現對環 境無侵姓性之特徵。 考慮到用於進行該方法之溶劑之適合性，後者使用一種 呈水性懸浮液形式且具有不低於約18重量之乾燥細胞材料 内含物的細胞生質漿料作為原料，該漿料經受溶劑、撥拌 及在一反應器中加熱以生產包含溶劑及溶解之PHa的懸浮 液’隨後仍熱的懸浮液自剩餘細胞生質之不溶性殘餘物中 分離。接著PHA及溶劑溶液經冷卻至允許pha沉澱之溫度 且使其經受微過濾以獲得PHA濃度為約5%或5%以上之 PHA糊狀物，該糊狀物藉由注入水蒸氣進行再次加熱且攪 拌以去除溶劑且形成PHA顆粒之水性懸浮液，該懸浮液將 經受最終分離。 利用在先前所述方法中所建議溶劑，在溶劑中溶解PHA 的濃度低於5 % ’在經濟生存力方面允許該方法之連續性 條件下需要微過濾操作以允許懸浮液中之該PHA濃度達到 最小值。為保存生物聚合物分子量，將溶液在微過遽前快 速冷卻β 因此在先前方法中能量之需求相當大，因為將最初經加 I09033.doc 1363094 熱的大量經稀釋懸浮液冷卻且接著在溶劑蒸發前再加熱。 此外，此方法需要具備進行快速冷卻及微過濾步驟必需之 门成本的裝置。考慮到ρΗΑ在所提及溶劑中之低溶解度， 除用於其操作及溶劑蒸發之更高量電能及熱能外，在此方 法中循環溶劑量高，需要泵站及更大設備。 【發明内容】 從上文，表發明之一般目標係提供一種使用對環境無侵 蝕性之非鹵化溶劑由經發酵獲得之細菌細胞生質回收ΡΗΑ 以藉助於相對簡化裝置及較低能量消耗使用可再生材料及 月匕里產生兩純度及面分子量之產品之方法。 根據本發明，所討論之方法包含以下步驟： I)使該細胞生質經受PHA溶劑注入、有力攪拌及在反應器 内部快速加熱之相伴操作，以促進生質細胞壁破裂及包含 於生質細胞中之PHA溶解，及形成包含pha溶劑及細胞生 質（碎片）之不溶性殘餘物之懸浮液，該PHA溶劑富含以該 懸浮液之至少2重量％、較佳5重量❹/〇以上之濃度溶解之 PHA ； u)使在該反應器中形成之懸浮液經受用於由剩餘細胞生 質之不溶性殘餘物回收富含溶解之pha之溶劑的分離步 驟；

Hi)使富含PHA之PHA溶劑的溶液在一溫度下經受撥拌及 用水及/或蒸氣洗滌之操作，該溫度足夠且適合促進經由 蒸發移除大體上所有PHA溶劑且沉澱PHA，以形成包含沉 澱於水中之PHA及剩餘溶劑之懸浮液； 109033.doc •13- 1363094 iv) 藉由在該PHA懸浮液中注入蒸汽，使經沉澱之PHA之 懸浮液經受剩餘溶劑之蒸發直至其耗盡以在水性懸浮液中 獲得經純化之PHA粒子； v) 在水性介質中冷卻已耗盡PHA溶劑之懸浮液至約45°C 或低於45°C，且自該懸浮液分離PHA粒子；及 使經分離之PHA粒子經受乾燥步驟。 為由經發酵之細胞生質萃取PHA，本文提議之方法利用 選自下列群之溶劑之至少一者：群1 :甲酸甲酯、甲酸乙 酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸異戊酯、甲酸戊酯及甲酸 己醋；群2 :丙酸異丙S旨、丙酸異戊g旨、丙酸己g旨；群3 : 丁酸甲g旨、丁酸丙醋、丁酸異丙酷、丁酸異戊酯、丁酸戊 酯、丁酸己酯；群4 :異丁酸曱酯、異丁酸乙酯、異丁酸 丁酯、異丁酸丙酯、異丁酸異丙酯、異丁酸異戊酯、異丁 酸戊醋、異丁酸己醋，群5 .戊酸丙g旨、戊酸異丙g旨、戊 酸丁酯、戊酸異丁酯、戊酸異戊酯（戊酸3-甲基-1- 丁基 酯）、戊酸戊酯及戊酸己酯；及群6 :異戊酸甲酯（丁酸3-甲 基-1-曱基酯）、異戊酸乙酯（丁酸3-甲基-1·乙基酯）、異戊 酸丙酯（丁酸3 -甲基-卜丙基酯）、異戊酸異丙酯（丁酸3-甲 基-1-異丙基酯）、異戊酸丁酯（丁酸3-甲基-1-丁基酯）、異 戊酸異丁酯（丁酸3-甲基-1-異丁基酯）、異戊酸異戊酯（丁酸 3 -甲基-1-異戊基酯）、異戊酸戊酯（丁酸3-甲基-1-戊基酯） 及異戊酸己酯。 所描述之方法相當簡單，其利用可再生能量及原料來 源，因為其與酵及自蔗糖之糖生產聯合，所以其與環境及 I09033.doc 14 1363094 人類健康相容且界定一種用於大規模萃取及回收聚羥基烷 酸酯（PHA)之經濟替代方法。 【實施方式】 用於本發明之說明書中之術語之定義列表如下描述： -1稀基"意謂C,至cn之不飽和碳鏈，其中η自2至約20變化， 該碳鏈可為直鏈、支鏈或環狀且該不飽和可為單不飽和 的’意即在該碳鏈中具有一個雙鍵或三鍵；或多元不飽和 的’意即在該碳鏈中具有兩個或兩個以上雙鍵或具有兩個 或兩個以上三鍵或還具有一或多個雙鍵及一或多個三鍵。 -1烧基”意謂C|至Cn之飽和碳鏈，其中η自2至約20變化， 該碳鏈可為直鏈、支鏈或環狀。 • ”細胞生質”意謂由任一微生物或植物產生之生質，其能 天然或藉由基因修飾生產PH a ’以使其成為ρη Α生產者或 使其生產更多PHA » -包含”或’'以包含”意謂可添加或可存在不影響最終結果 之其他步驟或其他階段或其他化合物或其他成分。此術語 亦可由以下術語替代或替代以下術語：，,由…組成”、"基本 上由· _.組成"。 • Da1’意謂道耳頓（Dah〇n)，其為量測聚合物之分子量的單 位。 •由生質萃取聚羥基烧酸酯”或"由生質聚羥基烷酸酯之萃 取思谓萃取由生產單一類型PHA之生質生產的確定pHA或 由生產單一類型PHA之生質生產的確定PHA之萃取，及另 外其亦可意謂在生產多於僅一種類型PHA之細胞生質生產 I09033.doc 15 1363094 PHA的情況下萃取由生質生產之多於一種類型PHA或由生 質生產之多於一種類型PHA之萃取。 -π粗萃取物''意謂由富含PHA之PHA溶劑及不溶性固體組 成之懸浮液，該ΡΗΑ由ΡΗΑ細胞塊萃取，該ΡΗΑ細胞塊含 有（溶解於其中）水及萃取於細胞塊之雜質，該不溶性固體 為細胞生質之殘餘物，由該細胞生質萃取ΡΗΑ。 大體大氣壓力π意謂非常接近於大氣壓力之壓力，意即 等於、略微超過或低於大氣壓力之壓力。 -"萃取反應器π意謂由生產ΡΗΑ之細胞生質進行萃取ΡΗΑ 之操作所在之設備。 -π快速冷卻’'蒸汽（溶液或懸浮液）意謂：藉由膨脹經與另 一較冷蒸汽熱交換及/或藉由藉助於熱交換器冷卻在若干 秒中冷卻此蒸汽（溶液或懸浮液）。 溶劑”意謂就分子尺寸或離子尺寸而言，能夠溶解名為 溶質之其他物質以形成溶質均勻分散於溶劑中之名為溶液 之混合物的物質。 -”ΡΗΑ溶劑”意謂能夠溶解聚羥基烷酸酯之物質。 -”富含PHA溶劑'’或”富含PHA溶劑溶液”意謂含有由生產 PHA之細胞生質萃取之PHA的PHA溶劑溶液。 -”實質上無”或”實際上無”意謂”具有非常少之量”或”有微 量之存在”或”具有並非顯著之量”或”具有近乎無法覺察之 量丨’ ° 存在相當大量之公告描述藉助於非齒化溶劑由微生物或 植物之生質來源萃取PHA。然而，當希望以商業規模應用 I09033.doc -16- 1363094 所描述之教示時，在獲得大體上保存細胞内生物聚合物之 最初特性的產品上存在大量困難，絕大部分時間該等特徵 對精細商業產品而言為重要的。吾人觀察到在大部分該等 a 〇中極少主意產品在高溫時之熱敏性。針對pH a萃取及 回收，所提及之用作PHA萃取之候選者的大部分非齒化溶 劑對此溶質展現低溶解性且需要通常高於7〇。〇之高溫。當 希望以商業規模用該等溶劑進行PHA之萃取時，用於

回收之必要時間通常太長，以不可逆轉方式熱降解pHA。 因此取決於高溫下曝露之時間，所獲得產品受限於工業上 非常有限數量之應用’或甚至根本受限於任何其他應用。 本發明提及-種工業規模方法，在該方法中加工步驟以 此方式組合以允許：a)最小化由細胞生質萃取之大部分

PHA曝露在高溫下之時間，使用非鹵化溶劑，允許最小* 其降解，以最大地保存其最初特性特別為其分子量；匕）菊 得通常高於99%之高純度產品，該產品保存生物聚合^ 天然顏色及實質上不存在剩餘溶劑，在該方法中無須包相 脫色及純化所生產PHA之特定額外步驟；c)獲得由生質区 收之通常高於嶋之高含fPHA;d)以整合方式使用由糖 及醇工業產生之可再生原料及能量來源，使生產糖及醇之 工業群之利益增加。 植物生產之PHA，或合成生產之PHA。取β w 展< 。聚經基烷酸i PH A為由以下單元之重複構成之聚合物·· i09033.doc 1363094 —一Ο — CH——(CH2>——c ^ Jn 其中R為可變長度之烷基或烯基且m&n為整數，在以上提 及之聚合物中，r及m採用以下值： PHB: R=CH3, m=l PBH-V: R=CH3或 CH3-CH2·，m=l P4HB: R=H, m=2 P3HB-4HB: R=H或 CH3, m=l 或 2 PHHx： R=CH3-CH2-CH2-, m=l 本發明應用於由微生物之生質回收之PHA，較佳應用於 PHB(聚-3_羥基丁酸酯）、PHB_V(聚（羥基丁酸酯·共·羥基戊 酸酯））、P4HB(聚-4-經基丁酸酯）、P3HB4HB(聚（3-經基丁 酸醋-共_4羥基丁酸酯））及一些PHAmcl(中長鏈聚羥基烷酸 醋），此最後家族之典型代表物為PHHx(聚羥基己酸酯）。 在生物聚合物短時間曝露於熱降解之條件下，藉由使用非 鹵化溶劑萃取PHA之方法 本發明提及一種方法，該方法使用經由發酵獲得之細菌 細胞生質.之經發酵材料，且在萃取步驟中該材料經受較佳 呈經加熱液體形式及蒸汽形式之PHA溶劑注入、有力攪拌 及在一反應器中快速加熱之相伴操作，以快速驅使細胞生 質加熱至在約90°C至在大體上大氣壓力下之溶劑沸騰溫度 間之溫度’及包含於生質中之PHA之溶解，及以產生由包 含富含PHA溶劑之懸浮液界定之粗萃取物及細胞生質之不 109033.doc -18 - 1363094 溶性殘餘物，該富含PHA溶劑中PHA以該懸浮液之至少2 重量％且經常超過5重量。/〇之濃度溶解。 在本發明之一較佳形式中，細菌細胞生質以乾燥形式引 入萃取操作，在萃取步驟中獲得之粗萃取物由一包含富含 PHA之PHA溶劑的液相及一由剩餘細胞生質（碎片）之不溶 性殘餘物界定之固相組成。 在進仃本發明之另一方式中，將細菌細胞生質以水性懸 汙液形式進行萃取步驟，較佳地於其中濃縮1〇重量％以上 之乾性材料（重量/重量）且亦名為漿料以獲得粗萃取物’該 粗萃取物由下列相組成：一包含富含PHA之PHA溶劑及細 胞生質之剩餘水的液相；一由剩餘細胞生質之不溶性殘餘 物界疋之固相；及一含有水蒸氣及pHA溶劑蒸汽之蒸汽 相。將在若干加工步驟中產生之水蒸汽及pHA溶劑蒸汽在 兩液相中冷凝且分離：富含溶劑相，其回到萃取及回 收階段之方法中；及溶劑貧乏相，其在方法中再循環以允 許回收其中所含之PHA溶劑。 除加熱細胞生質外，此程序亦起到以蒸汽之形式移除提 供給漿料之過量水的作用，該漿料為由PHA溶劑及水組成 之二元混合物。大體上含有大部分與生質一起引入反應器 之水的蒸汽相接著可自反應器萃取以隨後進行冷凝，除經 萃取之細胞生質之不溶性殘餘物之外，留下由富含Pfi A之 PHA溶劑之溶液及小部分溶解於溶劑中之水組成之懸浮 液。 在萃取及回收PHA之方法中，使用至少一種pha溶劑， I09033.doc •19- 1363094 其係選自下列群： -群1溶劑由下列各物組成：甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙 酯、曱酸丁酯、甲酸異戊酯、甲酸戊酯及甲酸己酯及此等 溶劑之混合物，更佳為甲酸丙酯、曱酸丁酯、曱酸異戊 酯、甲酸戊酯且甚至更佳為甲酸異戊酯。 -群2溶劑由下列各物組成：丙酸乙酯、丙酸異丙酯、丙酸 異戊酯、丙酸己酯及此等溶劑之混合物，且更佳為丙酸異 丙酯、丙酸異戊酯，且甚至更佳為丙酸異戊酯。

•群3溶劑由下列各物組成：丁酸f酯、丁酸丙酯、丁酸異 丙酯、丁酸異戊酯、丁酸戊酯、丁酸己酯及此等溶劑之混 合物’且更佳為丁酸丙酯、丁酸異丙酯、丁酸異戊酯、丁 酸戊酯，且甚至更佳為丁酸異戊酯（丁酸3-甲基-1-丁基 酯）。

-群4溶劑由下列各物組成：異丁酸甲酯、異丁酸丙酯、異 丁酸異丙酯、異丁酸異戊酯、異丁酸戊酯、異丁酸己酯及 此等溶劑之混合物，且更佳為異丁酸丙酯、異丁酸異丙 酯、異丁酸異戊酯、異丁酸戊酯’且甚至更佳為異丁酸異 戊酯（異丁酸3-甲基-1-丁基酯）。 -群5溶劑由下列各物組成：戊酸丙酯、戊酸異丙酯、戊酸 丁酯、戊酸異丁酯、戊酸異戊酯（戊酸3_甲基_丨_丁基酯卜 戊酸戊酯及戊酸己酯及此等溶劑之混合物，且更佳為戊酸 丙醋、戊酸異丙醋、戊酸丁 S|、戊酸異丁酿、戊酸異: S旨、戊酸戊醋，且甚至更佳為戊酸異戊酯。 -及群6溶劑由下列各物組成 異戊酸甲酯（丁酸3_甲基 109033.doc •20· 1363094 甲基酯）' 異戊酸乙酯（丁酸3-甲基-1_乙基酯）、異戊酸丙西曰 (丁酸3-甲基-丨·丙基酯）、異戊酸異丙酯（丁酸3-甲基-卜異 丙基酯）、異戊酸丁酯（丁酸3 -甲基-1-丁基酯）、異戊酸異丁 酯（丁酸3-甲基-1-異丁基酯）、異戊酸異戊酯（丁酸3-甲基· 1-異戊基酯）、異戊酸戊酯（丁酸3-曱基-1-戊基酯）及異戊酸 己醋及此等溶劑之混合物，且更佳為異戊酸丙酯、異戊酸 異丙酯、異戊酸丁酯、異戊酸異丁酯、異戊酸異戊酯、異 戊酸戊酯，且甚至更佳為異戊酸異戊酯。 在本發明之任一形式中，自萃取步驟排出之所獲得粗萃 取物接著經受自富含PHA之PHA溶劑溶液中分離不溶性固 體之處理，例如該處理藉由過濾、離心、更佳地藉由過濾 進行’此產生一無不溶性固體且包含富含PHA之PHA溶液 的經過濾液流及含有經分離之不溶性固體之濾餅。 本文所考慮溶劑之使用允許富含溶解之PHA的PHA溶劑 懸浮液呈現懸浮液之至少約2重量％的PHA濃度及對所選溶 劑之相應部分而言至少高於懸浮液之約5重量％的pH a濃 度。當所用溶劑為具有PHA溶解度等於或高於約5重量。/〇之 彼等溶劑時，自PHA溶液移除溶劑之步驟可在不經由冷卻 及微過濾之中間步驟的情況下進行。接著較佳以霧化方式 將含有溶解之PHA且無生質之不溶性殘餘物的溶液較佳在 萃取溫度下饋入一蒸氣流中’接著瞬時使其在一保持在真 空至大體上大氣壓力（較佳自100至6〇〇 mmHg之真空）範圍 的壓力下之反應器中膨脹，在該反應器中產生：含有水及 為所II入溶液之部分的大部分PHA溶劑的二元蒸汽流，及 I09033.doc 21 1363094 在水中經精細分開之PHA粒子及小部分由冷凝部分所引入 蒸汽產生之剩餘溶劑的懸浮液。接著藉由注入蒸汽使此懸 浮液經受最终剩餘溶劑之蒸發直至在剩餘液體（母液）中其 耗盡。因此在該處理結束時，獲得精細分散於水中之PHA 粒子的懸浮液。接著快速冷卻此懸浮液至45°C或45°C以下 且使其經受用於分離分散於此懸浮液中之PHA粒子的處 理，例如藉由過濾及用大體上無溶劑之水沖洗含有PHA粒 子之經過濾濾餅。接著使因此所獲得PHA粒子經受乾燥處 理，獲得粉末形式之PHA，該PHA展現高水平純度、非常 低之剩餘溶劑、顏色、灰分及雜質含量及高總產量，意即 與最初生質中含有之PHA相比所回收PHA量高於約90%(重 量/重量）且分子量在300,000 Da以上，通常為400,000至 800,000 Da ° 根據本發明，藉由在蒸汽流中直接霧化PHA溶液在一蒸 發室中進行自PHA溶液移除溶劑之處理，繼而在溶劑與水 混合物中沉殿PHA。 根據一進行本發明之方式，用於自PHA溶液移除溶劑之 蒸汽為一與該蒸發室中之操作壓力相關的過熱蒸汽。應瞭 解該蒸氣室應保持在低於大氣壓力或大體上大氣壓力之壓 力下。 在另一進行本發明之方式中，藉由直接注入該溶液至水 及蒸汽中且在一保持在低於大氣壓力或大體上大氣壓力之 壓力下的反應器中攪拌下加熱，進行自PHA溶液移除溶劑 之處理。 109033.doc -22- 1363094 在本發明令’所選擇且屬於1至6之群的溶劑可（例如）經 由已知之有機合成反應獲得’該反應係在酸催化劑（離子 H + )存在下使醇與羧酸間進行反應且命名為酯化反應 (MORRISON, R. e BOYD, R.，Quimica OrgSnica，9a版， Funda<?a〇 Calouste Gulbenkian，Lisboa, Portugal，第 99 卜 1016 頁 ’ 01990 e Solomons, T.W. G., Organic

Chemistry, 2a版，John Wiley & Sons，Inc·，紐約，USA， 第 749-801頁，1980)。

尤其在酯化反應中涉及之酸為在群6中之3_甲基-卜丁酸 或異戊酸，應強調，例如可藉由酸催化氧化（異戊醇（3•甲 基-1-丁醇）、第一醇）經由傳統有機化學文獻中詳述之相轉 移催化方法可獲得該酸（例如MORRISON.，R e b〇YD> R

Quimica Orgdnica，9a版，Funda?a〇 Calouste Gulbenkian，

Lisboa, Portugal，第 616-618 e 471-472 頁，199〇 e

Solomons，T.W. G” Organic Chemistry，？版，J〇hn & Sons, Inc· ’ 紐約，USA，第 654-6.57 頁，1980) 〇 以上描述之所選溶劑之利用展現以下優勢：其所溶解之 PHA為例如專利PI 93〇2312_〇、專利申請案ρι 〇4〇〇5622· l(PCT/BR〇4/〇〇〇237)及美國專利6,〇43,〇63中插述之諸如乙 酸異戊S旨、乙酸丁S旨、i•己#、戊醇、異戊醇及丙酸丙酿 彼等溶劑所溶解之PHA的約2.2()倍。溶解度取決於所用溶 劑及所選萃取溫度。 按本發明之目標㈣之溶職叙良好溶解性與本文所 述之方法相關，其允許： I09033.doc -23- 1363094 a) 由微生物之生質獲得快速及有效PHA萃取；

b) 瞬時蒸發經注入蒸汽流及在_蒸氣室中較佳在真空下膨 :A冷液中所含有的大量溶劑，其中回收所饋入pHA L中3有之可感覺熱量的相應部分，同時此促進PHA在 自洛A冷凝之水中沉殿，舰沉澱同時藉由蒸汽冷卻且離 =系統，含有部分水之後者被所注入蒸汽接納且接著ΡΗΑ '令液中含有之大量溶劑與其共同饋入； c) 對於具有ΡΗΑ溶解度等於或高於s重量。/❶之溶劑而言，藉 由使用如b項巾描述之步驟，去除ρΗΒ冷卻、結晶或沉殿 及機械濃縮（或藉由膜）之額外步驟，顯著減少溶劑中觸 &之^^單疋’同時免去添加ρΗΑ減溶劑（反萃溶劑） 之需要； )對於ΡΗΑ容解度在約2重量％與約5重量。/❶間之溶劑而 言，藉由使用摇述之步驟，藉由免去添加ρηα減溶 劑（反+萃溶劑）之需要減小ΡΗΒ冷卻、結晶或沉澱及機械濃 縮（或藉由膜）之規模； e) 經由蒸汽作用’如卜項中描述，快速蒸發溶劑及沉澱 pHA，此減少引起對分子量破壞之可能性，同時當與之接 觸f藉由熱機械作用移除溶解於pHA溶劑中之雜質，使雜 質脫離至水相；進一步允許獲得精細分開之pHA粒子，此 便於剩餘溶劑及雜質之移除亦及隨後之乾燥操作； f) 根據b項中描述之方法，經由蒸汽之推動作用，促進pHA 溶液在蒸汽流中之霧化；及 g) 顯著減少PHA萃取方法中所需循環溶劑量，此意味工業 109033.doc -24- 1363094 上可使用之大部分設備的相應尺寸減小，及除促進該方法 中所需之熱能及電能消耗明顯減少外此允許顯著減少在萃 取及純化之方法中之投資。 實例 實例1 :使用丙酸異戊酯作溶劑萃取及回收PHb。 添加50 g含有78.4%乾燥物質及58 8%分子量為1〇〇〇 〇〇〇 Da之PHB之展的真養產驗桿菌⑽户办“！）生質 及300 g丙酸異戊酯至50〇 mL圓底蒸餾燒瓶中。接著藉由 使用與该洛餾燒瓶耦接之加熱毯，使該懸浮液在攪拌下經 受小部分溶劑及水之蒸發。將因此產生之二元蒸汽導入一 用於冷凝之直管冷凝器（李比希（Liebig)型）中且將所得冷凝 物在三角接受器中收集。在攪拌下使懸浮液保持在一蒸發 處理中直至達到萃取溫度。該溫度在一附於一燒瓶管嘴且 保持與燒瓶内部之蒸汽相接觸之水銀溫度計中讀出。在約 3分鐘之蒸發時間過去後達到萃取溫度，混合物之彿騰溫 度歷經約95°C (最初溫度）至約ii5°C(萃取溫度）。接著在搜 拌下使該懸浮液在115。(：溫度（萃取溫度）下保持在冷凝回流 方式下歷時約5分鐘，且接著將仍然熱的懸浮液在—遽紙 上進行過濾以自溶解於經過濾溶劑中的部分中分離不溶性 部分。接著冷卻含有約8_82%(w/w)溶解之PHB的熱經過濟 物質以沉澱PHB，經由過濾濃縮，經受溶劑之蒸發且接著 乾燥。所獲得PHB展現約558,〇〇〇 Da之分子量。測試中所 用之濃生質之量比在所用萃取溫度下PHB在溶劑中達到飽 和辰度需要之量大約大2.0-3.5倍。因此，對所用萃取溫产 I09033.doc -25- 1363094 而言，可確定溶質（PHB)在溶劑（丙酸異戊酯）中之飽和濃 度。 實例2 :使用丁酸丙酯作溶劑萃取及回收PHb〇 添加50 g含有78.4%乾燥物質及58 8%分子量為〖，〇〇〇,〇〇〇 Da之PHB的濃的真養產鹼桿菌生質及3〇〇 g丁酸丙酯至 mL圓底蒸餾燒瓶中。接著藉由使用與該蒸餾燒瓶耦接之 加熱毯，使該懸浮液在攪拌下經受小部分溶劑及水之蒸 發。將因此產生之二元蒸汽導入一用於冷凝之直管冷凝器 (李比希型）中且將所得冷凝物在三角接受器中收集在攪 拌下使懸浮液保持在一蒸發處理中直至達到萃取溫度。該 溫度在-附於-燒瓶管嘴且保持與燒瓶内部之蒸汽相接觸 之水銀溫度計中讀出。在約3分鐘之蒸發時間過去後達到 萃取溫度，混合物之沸騰溫度歷經約98艽（最初溫度）至約 120°C(萃取溫度）。接著在攪拌下使該懸浮液在i2〇(>c溫度 (萃取溫度）下保持在冷凝回流方式下歷時約5分鐘，且接著 將仍然熱㈣浮液在m進行過渡以自溶解於經過遽 溶劑中的部分中分離不溶性部分。接著冷卻含有約 3.0%(w/w)溶解之PHB的熱經過濾物質以沉澱pHB，經由過 濾來濃縮，經受溶劑之蒸發且接著乾燥。所獲得pHB展，現 約638,000 Da之分子量。測試令所用之濃生質以超過在所 用萃取溫度下PHB在溶劑中達到飽和濃度所需要之量約 2.0-3.5倍之量添加。因此，對所用萃取溫度而言，可確定 溶質（PHB)在溶劑（丁酸丙酯）中之飽和濃度。 實例3 :使用戊酸異戊醋作溶劑由乾燥生質萃取及回收 I09033.doc •26- 1363094 PHB。 添加50 g含有78.4%乾燥物質及58 8%分子量為1〇〇〇 〇〇〇 Da之PHB之濃的真養產鹼桿菌生質及3〇〇 g戊酸異戊酯至 500 mL圓底蒸餾燒瓶中。接著藉由使用與該蒸餾燒瓶耦接 之加熱毯，使該懸浮液在攪拌下經受溶劑及水之蒸發。將 因此產生之一元洛汽導入一用於冷凝之直管冷凝器（李比 希型）中且將所得冷凝物在三角接受器中收集。在攪拌下 使懸浮液保持在-蒸發處理巾直至達到萃取溫度。該溫度 在一附於一燒瓶管嘴且保持與燒瓶内部之蒸汽相接觸之水 銀溫度計中讀出。在約3分鐘之蒸發時間過去後達到萃取 溫度，混合物之沸騰溫度歷經約98。〇(最初溫度）至約 130°C (萃取溫度）。接著在攪拌下使該懸浮液在13〇t溫度 (萃取溫度）下保持在冷凝回流方式下歷時約1〇分鐘，且接 著將仍^熱的懸浮液在-I紙上進行㈣以自溶解於經過 濾溶劑中的部分中分離不溶性部分。接著冷卻含有約 2 7_8%(〜~)溶解之1>1^的熱經過濾物質以沉澱1)1^，經由 過濾來濃縮，經受溶劑之蒸發且接著乾燥。所獲得pHB展 現約735,000 Da之分子量。測試中所用之濃生質以超過在 所用萃取溫度下PHB在溶劑中達到飽和濃度所需要之.量約 2.0-3.5倍之量添加。因& ’對所用萃取溫度而言，可確定 溶質（PHB)在溶劑（戊酸異戊酯）中之飽和濃度。 實例4 .使用異戊酸異戊酯曱基4 •丁醇之3_曱基ο —丁酸 酯）作溶劑由乾燥生質萃取及回收PIiB。 添加50 g含有78.4%乾燥物質及58 8%分子量為1〇〇〇 〇〇〇 109033.doc •27- 1363094

Da之PHB之濃的真養產鹼桿菌生質及3〇〇 g異戊酸異戊酯 (3-甲基-1-丁醇之3·甲基_丨·丁酸酯）至5〇〇 mL圓底蒸餾燒瓶 中。接著藉由使用與該蒸餾燒瓶耦接之加熱毯，使該懸浮 液在搜拌下經受溶劑及水之蒸發。將因此產生之二元蒸汽 導入一用於冷凝之直管冷凝器（李比希型）中且將所得冷凝 物在三角接受器中收集。在攪拌下使懸浮液保持在一蒸發 處理中直至達到萃取溫度。該溫度在一附於一燒瓶管嘴且 保持與燒瓶内部之蒸汽相接觸之水銀溫度計中讀出。在約 3分釦之络發時間過去後達到萃取溫度，混合物之沸騰溫 度歷經約98°C (最初溫度）至約12rc(萃取溫度卜接著在攪 拌下使該懸浮液在12 51溫度（萃取溫度）下保持在冷凝回流 方式下歷時約10分鐘，且接著將仍然熱的懸浮液在一攄紙 上進行過濾以自溶解於經過濾溶劑中的部分中分離不溶性 部分。接著冷卻含有約9.8%(w/w)溶解之PHB的熱經過濾 物質以沉澱PHB，經由過濾來濃縮，經受溶劑之蒸發且接 著乾燥。所獲得PHB展現約575,000 Da之分子量。測試中 所用之濃生質以超過在所用萃取溫度下PHB在溶劑中達到 飽和濃度所需要之量約2.0-3.5倍之量添加。因此，對所用 萃取溫度而言，可確定溶質（PHB)在溶劑（異戊醆異戊酯） 中之飽和濃度。 9 【圖式簡單說明】 以上描述之本發明展現其藉助於流程圖中之實例說明之 步驟，該流程圖在所附圖之單一圖1中予以表示。 I09033.doc •28-

Claims (1)

1363094 ：--- 第095107245號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(iOi-年十幵1)

[。|年I月A El峰（聲}正本 十、申請專利範圍： 1. 一種由細菌細胞生質萃取及回收聚羥基烷酸酯（PHA)之 方法，該生質係藉由發酵獲得，其包含以下步驟： i) 使該細胞生質經受下列之相伴操作：注入液體形式 PHA溶劑及蒸汽形式PHA溶劑至該細胞生質、有力攪拌 及快速加熱在反應器内部之該生質，以形成包含富含 PHA之PHA溶劑及該細胞生質之不溶性殘餘物的懸浮 液，該懸浮液中PHA在該懸浮液之至少2重量％的濃度；

ii) 使該懸浮液經受用於自該剩餘細胞生質之不溶性殘 餘物回收該富含該溶解之PHA之溶劑的分離步驟； iii) 使該富含PHA之PHA溶劑之溶液在一溫度下經受攪 拌及用水及/或蒸汽洗滌，該溫度足夠蒸發大體上所有 PHA溶劑及沉澱該PHA ; iv)藉由在該PHA懸浮液中注入蒸汽，自沉澱PHA蒸發 剩餘溶劑直至其耗盡以在水性懸浮液中獲得經純化PHA 之粒子； v) 在水性介質中冷卻該已耗盡該PHA溶劑之懸浮液至 約45°C或45°C以下及自該懸浮液分離該等PHA粒子；及 vi) 使該等經分離PHA粒子經受乾燥步驟， 其中該PHA溶劑為丙酸異戊酯。 2. 如請求項1之方法，其中使用能夠由蔗糖萃取之糖作生 物合成PHA之微生物，藉由細菌發酵生產該PHA，其中 供給該方法的主要能量來源為蔗糖渣。 3. 如請求項1之方法，其中注入該液體PHA溶劑及蒸汽形式 I09033-1010131.doc 1363094 之該PHA溶劑的步驟，在λ體上大氣壓力下促進在約 90°C與該溶劑之沸騰溫度間之溫度下加熱該細胞生質。 4. 如請求項1之方法，其中在蒸汽流中直接霧化該PHA溶液 的情況下在一蒸發室中進行該PHA溶液中該溶劑之移 除，接著在冷凝水與溶劑之混合物中進行該PHA之沉 澱。 5. 如請求項1之方法，其中該自該PHA溶液中該溶劑之移除 包含在水及蒸汽令直接注入該溶液及在攪拌下在一保持 在低於大氣壓力之壓力下的反應器中加熱。 6. 如請求項1之方法，其中該用於該萃取方法中之生質係 呈水性懸浮液形式。 7. 如請求項6之方法，其中在一蒸汽相中該PHA溶劑與水形 成二元混合物。 8. 如請求項7之方法，其中注入該液體PHA溶劑及蒸汽形式 之該PHA溶劑之步驟，在大氣壓力下促進該細胞生質之 加熱至在約90°C與該溶劑之沸騰溫度間之溫度及以形 成：一包含富含PHA之PHA溶劑及該細胞生質之剩餘水 的液相；一由該剩餘細胞生質之該等不溶性殘餘物界定 之固相；及一含有水及PHA溶劑蒸汽之蒸汽相。 9. 如請求項8之方法，進一步包含萃取在該細胞生質内含 有過量水之該蒸汽相的步驟。 10. 如請求項1之方法，其中該細胞生質由天然微生物或基 因上修飾之微生物產生。 109033-1010131.doc