CN114262724B - 喷射液化连续破壁法提取分离聚羟基脂肪酸脂的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及PHA提取分离技术领域，公开了一种喷射液化连续破壁法提取分离聚羟基脂肪酸脂(PHA)的方法和系统，该方法包括以下步骤：(1)将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；(3)在蛋白酶的存在下，将所得含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；(4)将得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。采用本发明的方法能够有效提高PHA的纯度，并实现连续性分离纯化，得到的PHA的聚合度和分子量较高。
Description
技术领域
本发明涉及聚羟基脂肪酸酯的提取分离领域，具体涉及一种喷射液化酶解连续破壁法提取分离聚羟基脂肪酸脂的方法和系统。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类完全由微生物合成的高分子聚酯的统称。由于PHA具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，PHA的应用有助于解决日益严重的环境污染问题。
虽然PHA的使用能够有效地避免石化塑料对环境造成的危害，但目前，这种环境友好的生物塑料存在生产成本高昂，且提取PHA的收率较低的问题。
目前PHA的提取分离方法主要分两大类，第一种类是通过有机溶剂(如二氯甲烷、氯仿、N-甲基吡咯烷酮和N-乙基已内酰胺)溶解菌体后并提取PHA，但有机溶剂本身成本高(比如，N-甲基吡咯烷酮和N-乙基已内酰胺本身为非常规试剂，生产，运输成本偏高)，而且存在较大的环境污染风险(部分有机溶剂如二氯甲烷和氯仿有致癌风险)。
第二类是通过使用酸(硫酸)碱(氢氧化钠、氢氧化钾)处理菌体细胞或者表面活性剂处理菌体细胞，但这类处理方法对PHA会有一定程度的降解，使得其聚合度和分子量降低。
另外，采用上述两类分离提取方法会产生大量的污水，导致额外增加污水处理工序，增加了工艺的复杂性和生产成本。而且，采用上述两类分离提取方法得到的PHA的纯度较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种蛋白酶结合喷射液化设备提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统，采用本发明的方法可以利用喷射液化过程中瞬间的高压剪切力破碎细胞，酶水解蛋白质能够有效提高PHA的纯度，并实现连续性分离纯化，得到的PHA的聚合度和分子量较高。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；
(3)在蛋白酶的存在下，将所得含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；
(4)将得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
本发明第二方面提供一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统，其中，该系统包括第一细胞破碎单元、第一固液分离单元、蛋白酶供给单元、第二细胞破碎单元、第二固液分离单元；
所述第一细胞破碎单元用于将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化破壁，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；
所述第一固液分离单元用于将第一细胞破碎单元中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；
所述第二细胞破碎单元用于将第一固液分离单元得到的含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化破壁，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；
所述蛋白酶供给单元与第二细胞破碎单元连通以向所述第二细胞破碎单元提供蛋白酶；
所述第二固液分离单元用于将第二细胞破碎单元中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
通过上述技术方案，能够有效提高所得聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，并且具有较低的生产成本。进而使得得到的PHA具有较高的聚合度和分子量。
附图说明
图1是本发明中优选的一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统的示意图。
附图标记说明
1、第三固液分离单元 2、第一细胞破碎单元 3、第一固液分离单元
4、蛋白酶供给单元 5、第二细胞破碎单元 6、第二固液分离单元
7、PHA发酵单元 11、第三固液分离区Ⅰ 12、第三固液分离区Ⅱ
13、第三固液分离区Ⅲ 31、第一固液分离区Ⅰ 32、第一固液分离区Ⅱ
111、碟片离心设备Ⅲ 121、带式真空过滤设备 131、板框过滤设备Ⅲ
311、碟片离心设备Ⅰ 321、板框过滤设备Ⅰ 61、第二固液分离区Ⅰ
62、第二固液分离区Ⅱ 611、碟片离心设备Ⅱ 621、板框过滤设备Ⅱ
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；
(3)在蛋白酶的存在下，将所得含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；
(4)将得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
本发明的发明人在研究过程中发现，提取分离PHA过程中所用的试剂如果涉及强酸强碱，会产生大量的废水；提取分离环境的温度较高且操作时间较长时，会明显降低PHA的聚合度和分子量；提取分离PHA过程中存在蛋白难以去除，从而增加离心分离难度和降低产品纯度。本发明的发明人在研究过程中进一步发现，以喷射液化结合蛋白酶提取PHA，利用喷射液化的瞬间高压剪切力破碎细胞，可以在更低的温度下操作，同时采用蛋白酶破坏细胞壁、细胞膜结构，对聚羟基脂肪酸酯的聚合度的降解影响较小，可以最大限度的保留PHA的聚合度和较高的分子量，并且酶水解蛋白质提高了产品的收率和纯度，且易操作，可以实现连续性运行，对于工业化操作具有重要意义。
本发明中，喷射液化的过程包括：蒸汽系统喷射出蒸汽(蒸汽的温度即为喷射液化的温度)，蒸汽和菌体在喷射器中相遇，然后在喷射产生的剪切力下破坏细胞壁；在二次喷射时加入蛋白酶进一步酶解细胞壁上的多肽，从而使菌体细胞破壁完全，另外蛋白酶对于菌体内部蛋白的酶解作用会提高PHA产品的纯度。
本发明中，在步骤(1)中，所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞以菌悬液形式存在，其中，制备所述菌悬液使用的水的量与所述菌体细胞的体积比为0.5-20:1，(例如，可以为0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1、10:1、12:1、15:1、17:1、20:1，或者上述数值之间的任意值)，更优选为5-10:1。
优选地，在pH值为8-12的条件下进行所述一次喷射液化。
本发明中，对所述一次喷射液化的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述一次喷射液化的时间为3-60min(例如，可以为3min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min，或者上述数值之间的任意值)，优选为10-30min。
本发明中，对所述一次喷射液化的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述一次喷射液化的温度为60-150℃(例如，可以为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃，或者上述数值之间的任意值)，优选为90-130℃。所述一次喷射液化的温度是指蒸汽系统喷出蒸汽的温度。
本发明中，对所述一次喷射液化的压力没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述一次喷射液化的压力为0.1-1MPa，优选为0.2-0.9MPa。
本发明中，优选地，在进行一次喷射液化前需要进行搅拌，搅拌转速为50-350rpm(比如，可以为50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值)，优选为200-300rpm。
本发明中，优选地，在进行步骤(3)之前，该方法还包括先将所得的含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀与水混合得到悬浊液。更优选地，制备所述悬浊液使用的水的用量与所述沉淀的体积比为0.5-20:1(例如，可以为0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1，或者上述数值之间的任意值)，更优选为5-10:1。
本发明中，优选地，在步骤(3)中，所述蛋白酶为酶活2×107-4×107U/L的液体剂型。
优选地，在步骤(3)中，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述蛋白酶的添加量为1×106-1.2×107U。
本发明中，本领域技术人员能够理解的是，所述蛋白酶为能够耐受二次喷射液化温度也即在较高的二次喷射液化温度下也不失活的蛋白酶，例如可以为嗜热菌蛋白酶(嗜热菌蛋白酶优先在疏水性的氨基酸残基的N末端进行剪切，包括亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸)，可以商购获得，如默克公司的T7902。
优选地，在pH值为7-9的条件下进行二次喷射液化。
本发明中，对所述二次喷射液化的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，所述二次喷射液化的时间为10-60min(例如，可以为10min、20min、30min、40min、50min、60min，或者上述数值之间的任意值)，优选为10-30min。
本发明中，对所述二次喷射液化的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，在二次喷射液化的温度为60-100℃(例如，可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、100℃，或者上述数值之间的任意值)，优选为65-80℃。所述二次喷射液化的温度是指蒸汽系统喷出蒸汽的温度。
本发明中，对所述二次喷射液化的压力没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述二次喷射液化的压力为0.1-1MPa，优选为0.2-0.9MPa。
本发明中，为了进一步提高对菌体细胞的破碎效果，更优选地，在进行二次喷射液化前进行搅拌，搅拌转速为50-350rpm(50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值)，优选为100-300rpm。
本发明中，优选地，步骤(1)中所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞由以下方法得到：将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第三固液分离，得到所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞和发酵残液。
应当理解的是，本发明中，所述菌体细胞指的是从发酵液中分离出的菌体沉淀，主要成分为菌体细胞，其他杂质成分(如，少量的菌体细胞碎片、菌体细胞溶出物、菌体代谢产物等)的含量和水含量由固液分离的次数和条件所决定。随着固液分离次数的增加，所得菌体沉淀中的其他杂质成分会逐渐减少甚至基本全部除去。
本发明中，优选地，所述第三固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为70-90重量％，更优选为75-85重量％。
本发明中，优选地，将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第三固液分离的方法包括：
(a)将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行离心分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一菌体细胞和第一发酵残液，将所得第一菌体细胞进行洗涤；
(b)将洗涤后的第一菌体细胞进行真空过滤分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二菌体细胞和第二发酵残液。
能够理解的是，当所述第三固液分离仅进行步骤(a)时，则所述菌体细胞指的是所述的第一菌体细胞；当所述第三固液分离依次进行步骤(a)和步骤(b)时，则所述菌体细胞指的是所述的第二菌体细胞。
优选地，步骤(a)中，相对于1体积份的第一菌体细胞，所述洗涤使用的洗涤液的用量为1-2体积份；进一步优选地，所述洗涤的次数为1-3次。本发明中，可以使用本领域常规使用的洗涤剂进行洗涤，例如水、生理盐水或缓冲液等，优选为使用水进行洗涤，更优选为蒸馏水。
优选地，步骤(a)中，所述离心分离的条件使得所得的第一菌体细胞的水含量为70-90重量％。
优选地，步骤(b)中，所述真空过滤分离的条件使得所得的第二菌体细胞的水含量为75-85重量％。需要说明的是，在进行真空过滤分离之前包括洗涤的情况下，所述第二菌体细胞的水含量可以大于第一菌体细胞的水含量。
本发明中，为了提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，所述方法还包括：将所得的第一发酵残液和所得的第二发酵残液进行板框过滤分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，然后将所得第三菌体细胞与所得的第二菌体细胞混合作为所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化。
优选地，所述板框过滤分离的条件包括：压力为0.1-0.6MPa，进一步优选为0.2-0.5MPa；进一步优选地，所述板框过滤分离使用的滤布的孔径为1-25μm。
本发明中，所述的压力均为表压。
本发明中，为了进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度，优选地，在进行步骤(1)之前，先将所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行洗涤；优选地，所述洗涤的次数为1-5次。本发明中，可以使用本领域常规使用的洗涤液进行洗涤，例如水、生理盐水或缓冲液(例如，PBS缓冲液)等。
本发明中，步骤(2)中进行第一固液分离的方法可以为常规的固液分离方法，只要能够有效地将聚羟基脂肪酸酯与非聚羟基脂肪酸酯细胞溶出物和细胞碎片等成分进行有效分离即可，例如，可以采用静置分离、过滤分离、离心分离等；为了进一步降低PHA生产成本，将步骤(2)中分离出聚羟基脂肪酸酯后的剩余物质回用于聚羟基脂肪酸酯发酵，同时提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，步骤(2)中所述第一固液分离的方法包括第一离心分离。
本发明中，优选地，步骤(2)中所述第一离心分离的条件使得所述第一浆液中杂质在上层，未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯在下层。如此，上层中不仅包含了大部分的大分子等不溶性杂质，还包括了所有的可溶性杂质，而下层主要为PHA不溶性物质。
优选地，所述方法还包括将步骤(2)中第一离心分离得到的下层中的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯进行洗涤；更优选地，所述洗涤的方式可以为水洗；进一步优选地，所述洗涤的次数为3-5次。
本发明中，优选地，所述方法还包括将步骤(2)中第一离心分离得到的下层中的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯进行洗涤之后再进行板框过滤分离。
优选地，步骤(2)中所述下层中的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯的板框过滤分离的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.1-0.6MPa，时间为0.5-5小时；更优选地，温度为10-30℃，压力为0.15-0.55MPa，时间为1-4小时；更优选地，温度为15-25℃，压力为0.2-0.5MPa，时间为2-3h。更优选地，所述板框过滤分离使用的板框上滤布的孔径为1-150μm。
本发明中，优选地，步骤(4)中，所述的第二固液分离的方法包括板框过滤分离。
更优选地，步骤(4)中在将所述第二浆液进行板框过滤分离之前，先对所述第二浆液进行第二离心分离。
本发明中，优选地，步骤(4)中所述第二离心分离的条件使得所述第二浆液中杂质在上层，聚羟基脂肪酸酯在下层。如此，上层中不仅包含了大部分的大分子等不溶性杂质，还包括了所有的可溶性杂质，而下层主要为PHA不溶性物质。
优选地，所述方法还包括将步骤(4)中第二离心分离得到的下层中的聚羟基脂肪酸酯进行洗涤；更优选地，所述洗涤的方式可以为水洗；进一步优选地，所述洗涤的次数为3-5次。
优选地，步骤(4)中所述的板框过滤的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.1-0.6MPa，时间为0.5-5小时；更优选地，温度为10-30℃，压力为0.15-0.55MPa，时间为1-4小时；更优选地，温度为15-25℃，压力为0.2-0.5MPa，时间为2-3h。
本发明中，为了进一步提高过滤的效果，进而提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，所述板框过滤分离使用的滤布的表面预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
本发明中，优选地，所述板框过滤所使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径。需要说明的是，“所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径”并非是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯的颗粒的粒径均大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯颗粒的粒径，而是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径。所述第二浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径通常为0.1-10μm。
更优选地，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径为1-250μm，优选为1-200μm。
本发明中，为了进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度，优选地，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-10mm，优选为1-5mm。
优选地，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-100μm。
本发明中，在所述滤布表面涂覆聚羟基脂肪酸酯的方法包括：先将聚羟基脂肪酸酯与水混合配制成悬浮液，然后将所得悬浮液涂覆在滤布表面，再然后将涂覆悬浮液的滤布进行干燥，得到涂覆聚羟基脂肪酸酯的滤布。
本发明中，根据实际需要，还可以将所得聚羟基脂肪酸酯进行干燥，优选为喷雾干燥。
本发明中，步骤(2)中将所得含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，还得到了液流。其中，所得的液流中含有氮源，非聚羟基脂肪酸酯细胞溶出物和细胞碎片等物质，优选地，将步骤(2)中所得的液流回用于聚羟基脂肪酸酯发酵。
根据本发明，所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液可以为本领域常规的可用于制备聚羟基脂肪酸酯的微生物的发酵液，优选的，所述微生物为嗜盐菌，例如，可以为盐单胞菌属中的一种，根据本发明一种优选的实施方式，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)；更优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCCNO.4353(CN201010578858.8)。
本发明中，对所述聚羟基脂肪酸酯发酵使用的发酵培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵培养基，此处不再进行赘述。
本发明中，对所述聚羟基脂肪酸酯发酵的条件没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵条件。此处不再进行赘述。
第二方面，本发明提供了一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统，其中，该系统包括第一细胞破碎单元2、第一固液分离单元3、蛋白酶供给单元4、第二细胞破碎单元5、第二固液分离单元6；
所述第一细胞破碎单元2用于将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；
所述第一固液分离单元3用于将第一细胞破碎单元2中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯沉淀；
所述第二细胞破碎单元5用于将第一固液分离单元3得到的含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；
所述蛋白酶供给单元4与第二细胞破碎单元5连通以向所述第二细胞破碎单元5提供蛋白酶；
所述第二固液分离单元6用于将第二细胞破碎单元5中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
优选地，所述第一细胞破碎单元2和第二细胞破碎单元5中设置有搅拌装置和喷射液化装置。
优选地，所述第一固液分离单元3包括第一固液分离区Ⅰ31，所述第一固液分离区Ⅰ31中设置有碟片离心设备Ⅰ311。
优选地，所述第一固液分离单元3还包括位于所述第一固液分离区Ⅰ31下游的第一固液分离区Ⅱ32。
优选地，所述第一固液分离区Ⅱ32设置有板框过滤设备Ⅰ321。
优选地，该系统还包括第三固液分离单元1，所述第三固液分离单元1用于将含聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第三固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
优选地，所述第三固液分离单元1包括依次连通的第三固液分离区Ⅰ11和第三固液分离区Ⅱ12；
其中，所述第三固液分离区Ⅰ11用于将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一次第三固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一菌体细胞和第一发酵残液；所述第三固液分离区Ⅱ12用于将在第三固液分离区Ⅰ11得到的第一菌体细胞进行第二次第三固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二菌体细胞和第二发酵残液，所得的第二菌体细胞进入第一细胞破碎单元2。
优选的，所述第三固液分离单元1中还设置有第三固液分离区Ⅲ13，所述第三固液分离区Ⅲ13用于接收在第三固液分离区Ⅰ11得到的第一发酵残液和在第三固液分离区Ⅱ12得到的第二发酵残液并进行第三次第三固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，并将所得的第三菌体细胞输送至所述第一细胞破碎单元2。
优选地，所述第三固液分离区Ⅰ11中设置有碟片离心设备Ⅲ111。
优选地，所述第三固液分离区Ⅱ12中设置有带式真空过滤设备121。
优选地，所述第三固液分离区Ⅲ13中设置有板框过滤设备Ⅲ131。
优选地，所述第二固液分离单元6包括第二固液分离区Ⅰ61和第二固液分离区Ⅱ62；
所述第二固液分离区Ⅰ61用于将在第二细胞破碎单元5中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第一次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的物料；
所述第二固液分离区Ⅱ62用于将在第二细胞破碎单元5中得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液或在第二固液分离区Ⅰ61中得到的含聚羟基脂肪酸酯的物料进行第二次第二固液分离。
优选地，所述第二固液分离区Ⅰ61设置有碟片离心设备Ⅱ611。
优选地，所述第二固液分离区Ⅱ62设置有板框过滤设备Ⅱ621。
优选的，所述板框过滤设备Ⅱ621的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
优选地，所述聚羟基脂肪酸酯层的厚度为1-20mm，更优选为5-10nm。
优选地，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-25μm，更优选为13-23μm。
优选地，所述系统还包括聚羟基脂肪酸酯发酵单元7，所述第一固液分离单元3与聚羟基脂肪酸酯发酵单元7之间设置有回流管，使第一固液分离单元3中得到的液流回流至聚羟基脂肪酸酯发酵单元7。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
聚羟基脂肪酸酯重均分子量通过凝胶渗透色谱法测得；
碟片式离心机购自南京华盛分离机械技术有限公司，型号DR203；
带式真空过滤机购自湖州核工惠能环保过滤科技有限公司，型号DY-500；
板框过滤机购自海宁市云飞过滤设备有限公司，型号YF-100-1；
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径为1-200μm；
PHA的收率和纯度的检测方法参考文献(Engineering self-flocculatingHalomonas campaniensis for wastewaterless open and continuous fermentation)
制备例1
将盐单胞菌(TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353(CN201010578858.8))接种于种子培养基(5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨以及60g/L的氯化钠)中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积％的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。
然后将10体积％的接种量将二级种子液接入到初始发酵培养基(氯化钠50g/L，葡萄糖50g/L，玉米浆粉15g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5g/L，微量元素母液I10mL/L，微量元素母液II 3mL/L。所述微量元素母液I和II，参照引用专利CN201010578858.8)中，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，转速控制600-1000rpm，通风量0.5-2.0vvm，初始溶氧控制在30％以上；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间，用NaOH控制发酵pH为8-9之间，发酵55小时。
实施例1
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量70％重量)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后进行真空过滤分离，离心后的菌体(含水量80％重量)(第二菌体细胞)进入第一喷射液化暂存罐，开启搅拌装置，转速为250rpm，上清液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和上清液液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.3MPa，滤布孔径为10μm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入第一喷射液化暂存罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将喷射液化暂存罐中的菌体细胞进行水洗1次，离心分离，得到待破碎菌体细胞，去除其中的杂质。然后加入5倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液。
(5)喷射液化暂存罐中的菌悬液用泵打入第一喷射液化器中，在pH值为10的条件下进行一次喷射液化，在喷射器中菌体和蒸汽相遇，蒸汽温度为110℃，压力为0.6MPa，出料温度为90℃，保温时间为10min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液。
(6)将所得第一浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得第一浆液分成分布在上层的含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)，以及分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯。所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯用水洗涤，洗涤后送入板框过滤机进行固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的沉淀和滤液，固液分离的条件为：温度为20℃，压力为0.2MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为100μm；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将步骤(7)所得沉淀送入第二喷射液化暂存罐，开启搅拌装置，转速为250rpm，向第二喷射液化暂存罐中加入5倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到含PHA的悬浊液，然后加入嗜热菌蛋白酶得到混合物料，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述嗜热菌蛋白酶的添加量为1×106U；然后进入第二喷射液化器中，在pH值为7的条件下进行二次喷射液化，蒸汽温度为60℃，压力为0.6MPa，出料温度为55℃，保温时间为10min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液。
(9)将所得第二浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得第二浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗3次。
(10)将步骤(9)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为3mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(11)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
实施例2
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量90％重量)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后进行真空过滤分离，离心后的菌体(含水量75重量％)(第二菌体细胞)进入喷射液化暂存罐，开启搅拌装置，转速为300rpm，上清液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和上清液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.5MPa，滤布孔径为7μm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入喷射液化暂存罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将喷射液化暂存罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。然后加入5倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液。
(5)喷射液化暂存罐中的菌悬液用泵打入喷射液化器中，在pH值为12的条件下进行一次喷射液化，在喷射器中菌体和蒸汽相遇，蒸汽温度为130℃，出料温度为95℃，压力为0.9MPa，保温时间为20min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液。
(6)将所得第一浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得第一浆液分成分布在上层的含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)，以及分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯。所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯用水洗涤，洗涤后送入板框过滤机进行固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的沉淀和滤液，固液分离的条件为：温度为15℃，压力为0.3MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为120μm；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将步骤(7)所得沉淀送入喷射液化暂存罐，开启搅拌装置，转速为300rpm，向喷射液化罐中加入3倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到PHA悬浊液，然后加入嗜热菌蛋白酶得到混合物料，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述嗜热菌蛋白酶的添加量为1×107U；然后进入喷射液化器中，在pH值为9的条件下进行二次喷射液化，蒸汽温度为70℃，压力为0.9MPa，出料温度为55℃，保温时间为20min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液。
(9)将所得第二浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得第二浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗5次。
(10)将步骤(9)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为40℃，压力为0.5MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为13μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为3mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(11)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
实施例3
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量70％重量)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后进行真空过滤分离，离心后的菌体(含水量85重量％)(第二菌体细胞)进入喷射液化暂存罐，开启搅拌装置，转速为100rpm，上清液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和上清液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.2MPa，滤布孔径为25μm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入喷射液化暂存罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将喷射液化暂存罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。然后加入4倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液。
(5)喷射液化暂存罐中的菌悬液用泵打入喷射液化器中，在pH值为8的条件下进行一次喷射液化，在喷射器中菌体和蒸汽相遇，蒸汽温度为100℃，出料温度为85℃，压力为0.2MPa，保温时间为30min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液。
(6)将所得第一浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为3000rpm，分离条件使得第一浆液分成分布在上层的含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)，以及分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯。所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中分布在下层的未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯用水洗涤，洗涤后送入板框过滤机进行固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的沉淀和滤液，固液分离的条件为：温度为15℃，压力为0.5MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为100μm；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将步骤(7)所得沉淀送入喷射液化暂存罐，开启超搅拌装置，转速为100rpm，向喷射液化暂存罐中加入1倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到PHA悬浊液，然后加入嗜热菌蛋白酶得到混合物料，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述嗜热菌蛋白酶的添加量为5×106U；然后进行喷射液化，在pH值为8的条件下进行二次喷射液化，蒸汽温度为65℃，压力为0.2MPa，出料时间为60℃，保温时间为10min，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液。
(9)将所得第二浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为3000rpm，分离条件使得第二浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗3次。
(10)将步骤(9)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为23μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为5mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(11)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
实施例4
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(5)中，pH值为7，蒸汽温度为55℃，压力为0.08MPa，出料温度为50℃，保温时间为3min。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
实施例5
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(8)中，pH值为10，蒸汽温度为100℃，出料温度为90℃，保温时间为60min。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
实施例6
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(8)中，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述嗜热菌蛋白酶的添加量为1×105U。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
对比例1
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(8)中不添加嗜热菌蛋白酶。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
对比例2
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，不进行一次喷射液化，具体步骤为：按照实施例1步骤(1)-步骤(4)的方法得到的菌悬液，菌悬液直接送入第二喷射液化暂存罐，然后按照实施例1步骤(8)-步骤(11)的操作过程进行处理，其中步骤(8)中二次喷射液化的保温时间为120min。对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和重均分子量进行测定，结果如表1所示。
表1
| 编号 | 收率(％) | 纯度(重量％) | PHA重均分子量 |
| 实施例1 | 90 | 97 | 600KDa |
| 实施例2 | 85 | 95 | 650KDa |
| 实施例3 | 86 | 96 | 550KDa |
| 实施例4 | 75 | 90 | 450KDa |
| 实施例5 | 56 | 83 | 300KDa |
| 实施例6 | 60 | 85 | 350KDa |
| 对比例1 | 40 | 70 | 180KDa |
| 对比例2 | 70 | 88 | 410KDa |
通过表1的结果可以看出，采用本发明的技术方案提取得到的聚羟基脂肪酸酯具有较高的收率和纯度，以及较高的分子量，而较高的PHA收率和纯度间接地降低了成本；采用本发明最优选技术方案的实施例1-3具有明显更好的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (29)
1.一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行一次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞以菌悬液形式存在；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液进行第一固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；
(3)在蛋白酶的存在下，将所得含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行二次喷射液化，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液；
(4)将得到的含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液进行第二固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯；
所述一次喷射液化的温度为90℃-130℃；压力为0.2-0.9MPa；时间10-30min；pH值为8-12；
所述二次喷射液化的条件包括：二次喷射液化的温度为65℃-80℃；压力为0.1-1MPa；时间为10-60min，pH值为7-9；
在步骤(3)中，相对于每吨含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所述蛋白酶的添加量为1×106-1.2×107U。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，制备所述菌悬液使用的水的量与所述菌体细胞的体积比为0.5-20:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，制备所述菌悬液使用的水的量与所述菌体细胞的体积比为5-10:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，进行步骤(3)之前，该方法还包括先将所得的含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀与水混合得到悬浊液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，制备所述悬浊液使用的水的用量与所述沉淀的体积比为0.5-20:1。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，制备所述悬浊液使用的水的用量与所述沉淀的体积比为5-10:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述蛋白酶为酶活2×107-4×107U/L的液体剂型。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(2)中，所述第一固液分离的方法包括第一离心分离。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(2)中所述第一离心分离的条件使得所述第一浆液中杂质在上层，未破壁的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯在下层。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括将步骤(2)中第一离心分离得到的下层中的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯进行洗涤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法还包括将步骤(2)中第一离心分离得到的下层中的含有羟基脂肪酸酯的细胞和聚羟基脂肪酸酯进行洗涤之后再进行板框过滤分离。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(4)中，所述第二固液分离的方法包括板框过滤分离。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，步骤(4)中在将所述第二浆液进行板框过滤分离之前，先对所述第二浆液进行第二离心分离；所述第二离心分离的条件使得所述第二浆液中杂质在上层，聚羟基脂肪酸酯在下层。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法还包括将步骤(4)中第二离心分离得到的下层中的聚羟基脂肪酸酯进行洗涤。
15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述板框过滤的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.05-0.5MPa，时间为0.5-5小时。
16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述板框过滤分离使用的滤布的表面预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述第二浆液中的聚羟基脂肪酸酯。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-10mm。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-100μm。
20.根据权利要求12所述的方法，其中，所述板框过滤的条件包括：温度为10-30℃，压力为0.1-0.3MPa，时间为1-4小时。
21.根据权利要求16所述的方法，其中，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径为1-250μm。
22.根据权利要求16所述的方法，其中，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-5mm。
23.根据权利要求12所述的方法，其中，所述板框过滤的条件包括：温度为15-25℃，压力为0.2-0.3MPa，时间为2-3h。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中，所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞由以下方法得到：将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第三固液分离，得到所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞和发酵残液。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述第三固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为70-90重量％。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述第三固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为75-85重量％。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第三固液分离的方法包括：
(a)将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行离心分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一菌体细胞和第一发酵残液，将所得第一菌体细胞进行洗涤；
(b)将洗涤后的第一菌体细胞进行真空过滤分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二菌体细胞和第二发酵残液。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，该方法还包括：将所得的第一发酵残液和所得的第二发酵残液进行板框过滤分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，然后将所得第三菌体细胞与所得的第二菌体细胞混合作为所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，在进行步骤(1)之前，先将所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行洗涤。
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| CN101429467A (zh) * | 2008-12-24 | 2009-05-13 | 青岛生物能源与过程研究所 | 一种从微藻中同时提取油脂和蛋白质的方法 |
| CN102028189A (zh) * | 2009-09-28 | 2011-04-27 | 芜湖市秦氏糖业有限公司 | 连续喷射液化酶解法提取稻壳膳食纤维的方法 |
| CN111349218A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-06-30 | 吉林中粮生化有限公司 | 聚羟基脂肪酸酯的分离方法及其制备的聚羟基脂肪酸酯 |
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