CN111333822B - 氨水结合超声提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PHA提取分离的技术领域，公开了一种氨水结合超声提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统，其中，该方法包括：(1)将氨水与含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞混合得到菌悬液并进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯；采用本发明的方法和系统能够有效的提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，同时保证得到较高聚合度的聚羟基脂肪酸酯，并且降低了成本。

Description

氨水结合超声提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统
技术领域
本发明涉及聚羟基脂肪酸酯的提取分离领域，具体涉及一种氨水结合超声提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类完全由微生物合成的高分子聚酯的统称。PHA具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，有助于解决日益严重的环境污染问题。
虽然PHA的使用能够有效地避免石化塑料对环境造成的危害，但目前，这种环境友好的生物塑料的生产成本高昂，而且现有技术提取分离PHA的的回收率和纯度较低。PHA的提取分离有两种方向，第一种方向是选取有机试剂(如二氯甲烷、氯仿、N-甲基吡咯烷酮和N-乙基已内酰胺)溶解提取PHA，但有机溶剂成本高，存在较大的环境污染风险，且部分有机溶剂如二氯甲烷和氯仿有致癌风险，N-甲基吡咯烷酮和N-乙基已内酰胺本身为非常规试剂，生产和运输成本偏高。第二种是强酸(硫酸)强碱(氢氧化钠、氢氧化钾)处理或者表面活性剂(SDS)处理，但这类处理方法会一定程度的降解PHA，使得PHA的聚合度降低。另外，大量的污水处理会大大提高PHA的生产成本。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产成本高，提取的PHA的聚合度较低，且PHA的纯度和收率较低的问题，提供一种氨水结合超声提取聚羟基脂肪酸酯的方法和系统，以实现提取得到聚合度较高的PHA，且得到的PHA的纯度和收率较高以及降低PHA生产成本的目的。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将氨水与含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞混合得到菌悬液并进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
本发明第二方面提供一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统，该系统包括细胞破碎单元、第一固液分离单元和氨水供给单元；
所述细胞破碎单元用于将所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
所述氨水供给单元与细胞破碎单元连通以向所述细胞破碎单元提供氨水；
所述第一固液分离单元用于将细胞破碎单元中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述的聚羟基脂肪酸酯。
采用本发明的技术方案，能够有效提高所得聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，并且降低了生产成本。
并且以氨水作为提取试剂，并以超声波进行辅助提取，可以显著的缓解PHA的降解情况，进而使得得到的PHA具有较高的聚合度。
附图说明
图1是本发明中优选的一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统的示意图。
附图标记说明
1、第二固液分离单元 2、细胞破碎单元 3、第一固液分离单元
4、氨水供给单元 5、PHA发酵单元 11第二固液分离区Ⅰ
12、第二固液分离区Ⅱ 13、第二固液分离区Ⅲ 31、第一固液分离区Ⅰ
32、第一固液分离区Ⅱ 111、碟片离心设备Ⅱ 121、带式真空过滤设备
131、板框过滤设备Ⅱ 311、碟片离心设备Ⅰ 321、板框过滤设备Ⅰ
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(1)将氨水与含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞混合得到菌悬液并进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
本发明的发明人经过研究发现，超声波的频率范围为2×104-109Hz，作为纵波，在介质中通过疏密振动传播，当超声波在液体中传播时，液体质点的振动是机械波传播的必然需求，当介质质点大幅度高频率振动的需求与介质流动性的局限性之间的矛盾不可调和的时候，液体中就产生了空腔，即空化效应；空腔的猝灭和坍塌，导致空腔的表面能释放，在局部微观环境中，产生了巨大的能量，伴随产生了剧烈振动。空化效应和振动作用不仅可以破碎细胞，促进PHA与细胞内其它大分子的剥离，从而可以在弱碱的条件下，实现进一步提纯PHA，使得得到的PHA具有较高的聚合度，且得到的PHA的纯度和收率较高以及降低了PHA生产成本，避免了使用强碱及强酸或SDS等带来的不利影响。
本发明的发明人经过进一步的研究发现，以氨水作为提取试剂，并以超声波进行辅助提取，可以更加显著的缓解PHA的降解情况，进而明显使得得到的PHA具有更高的聚合度，且结合本发明固液分离的方法能够有效提高所得PHA的纯度和收率，降低了成本，而且本发明避免了使用强酸强碱，减少了三废的排放和处理成本，提高了操作安全性；由于分离出的液流中含有氨和细胞溶出物等成分，可以将所得液流作为发酵培养基的氮源，从而降低了发酵的成本。
本发明中，聚羟基脂肪酸酯的聚合度即平均聚合度，指的是聚合物分子中羟基烷酸单体的数量，通过重均分子量进行表征。可以理解的是聚羟基脂肪酸酯的聚合度与其重均分子量为正相关关系。
本发明中，所述的压力均为表压。
应当理解的是，本发明中，所述菌体细胞指的是从发酵液中分离出的菌体沉淀，主要成分为菌体细胞，其他杂质成分(如，少量的菌体细胞碎片、菌体细胞溶出物、菌体代谢产物等)的含量和水含量由固液分离的次数和条件所决定。随着固液分离次数的增加，所得菌体沉淀中的其他杂质成分会逐渐减少甚至基本全部除去。
本发明中，优选地，所述菌悬液中，以NH4OH计的氨的浓度为0.1-1mol/L(例如，可以为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L，或者上述数值之间的任意值)，优选为0.2-0.5mol/L。
更优选地，所述菌悬液的OD600值为100-800；更优选为200-600。
本发明中，对所述进行超声破碎的功率没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，步骤(1)中所述进行超声的功率为200-2000W/m3菌悬液(例如，200W/m3菌悬液、300W/m3菌悬液、500W/m3菌悬液、800W/m3菌悬液、1000W/m3菌悬液、1500W/m3菌悬液、2000W/m3菌悬液，或者上述数值之间的任意值)，优选为300-1000W/m3菌悬液。
本发明中，对所述进行超声的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述进行超声破碎的时间为20-180min(例如，20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min、120min、150min、180min，或者上述数值之间的任意值)，优选为60-90min。
本发明中，对所述进行超声的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述超声的温度为60-90℃(例如，60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，或者上述数值之间的任意值)，优选为70-80℃。
本发明中，在进行超声破碎的同时进行搅拌，优选地，搅拌转速为50-350rpm(50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值)，优选为200-300rpm。
本发明中，优选地，所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞由以下方法得到：将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离，得到所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
本发明中，优选地，所述第二固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为70-90重量％，更优选为75-85重量％。
本发明中，更优选地，将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离的方法包括：
(a)将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一菌体细胞和第一发酵残液；
(b)将所得的第一菌体细胞进行第二次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二菌体细胞和第二发酵残液。
能够理解的是，当所述第二固液分离仅进行步骤(a)时，则所述菌体细胞指的是所述的第一菌体细胞；当所述第二固液分离依次进行步骤(a)和步骤(b)时，则所述菌体细胞指的是所述的第二菌体细胞。
优选地，在进行所述第二次第二固液分离之前，先将所得第一菌体细胞进行洗涤；更优选地，相对于1体积份的第一菌体细胞，所述洗涤使用的洗涤剂的用量为1-2体积份；进一步优选地，所述洗涤的次数为1-3次。可以使用本领域常规使用的洗涤剂进行洗涤，例如水、生理盐水或缓冲液等，优选为使用水进行洗涤，更优选为蒸馏水。
优选地，所述第一次第二固液分离的条件使得所得的第一菌体细胞的水含量为70-90重量％。
优选地，所述第二次第二固液分离的条件使得所得的第二菌体细胞的水含量为75-85重量％。需要说明的是，在进行第二次第二固液分离之前包括洗涤的情况下，所述第二菌体细胞的水含量可以大于第一菌体细胞的水含量。
本发明中，优选地，所述第一次第二固液分离为碟片式离心分离。
优选地，所述第二次第二固液分离为真空过滤分离。
优选地，所述真空过滤分离在带式真空过滤机中完成。
本发明中，为了提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，所述方法还包括：将所得的第一发酵残液和所得的第二发酵残液进行第三次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，然后将所得的第三菌体细胞与所得的第二菌体细胞混合作为所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
优选地，所述第三次第二固液分离为板框过滤分离；更优选地，所述板框过滤分离的条件包括：压力为0.1-0.6MPa，进一步优选为0.2-0.5MPa；进一步优选地，所述板框过滤分离使用的滤布的孔径为500-1000目。
本发明中，为了进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度，优选地，在进行步骤(1)之前，先将所述菌体细胞进行洗涤；更优选地，对所述菌体细胞进行洗涤1-5次。本发明中，可以使用本领域常规使用的洗涤剂进行洗涤，例如水、生理盐水或缓冲液(例如，PBS缓冲液)等，优选为使用水进行洗涤，更优选为蒸馏水。
本发明中，步骤(2)中进行第一固液分离的方法可以为常规的固液分离方法，只要能够有效地将聚羟基脂肪酸酯与氨、水、细胞溶出物和细胞碎片等成分进行有效分离即可，例如，可以采用静置分离、过滤分离、离心分离等；为了降低PHA生产成本，并将分离出聚羟基脂肪酸酯后的剩余物质回用于聚羟基脂肪酸酯发酵，同时提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，步骤(2)中进行第一固液分离的方法包括第一过滤分离，更优选为第一板框过滤分离。
优选地，所述第一板框过滤分离的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.1-0.6MPa，时间为0.5-5小时；更优选地，温度为10-30℃，压力为0.15-0.55MPa，时间为1-4小时；更优选地，温度为15-25℃，压力为0.2-0.5MPa，时间为2-3h。
本发明中，步骤(2)中所述浆液中含有聚羟基脂肪酸酯、氨、菌体细胞碎片、细胞溶出物等物质，为了除去聚羟基脂肪酸酯之外的其他成分，进而进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度和收率，优选地，步骤(2)中，所述固液分离的方法包括依次进行的第一离心分离和第一板框过滤分离。
步骤(2)中，所述第一离心分离的条件使得细胞壁等杂质在上层，PHA在下层。如此，上层中不仅包含了大部分的大分子等不溶性杂质，还包括了所有的可溶性杂质，而下层主要为PHA不溶性物质。
优选地，步骤(2)中所述的第一离心分离为第一碟片式离心分离。
本发明中，优选地，步骤(2)中先将第一离心分离得到的含聚羟基脂肪酸酯的物料第一洗涤后再进行过滤。
更优选地，所述第一洗涤的方式为水洗。
更优选地，所述第一洗涤的次数为3-5次。
本发明中，为了进一步提高过滤的效果，进而提高聚羟基脂肪酸酯的收率和纯度，优选地，所述滤布表面预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
本发明中，优选地，所述预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-25μm，更优选为13-23μm。
本发明中，优选地，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径。需要说明的是，“所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径”并非是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯的颗粒的粒径均大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯颗粒的粒径，而是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径。所述浆料中的聚羟基脂肪酸酯的粒径通常为0.1-10μm。
更优选地，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径为1-200μm。
本发明中，为了进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度，优选地，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-20mm，优选为5-10mm。
本发明中，在所述滤布表面涂覆聚羟基脂肪酸酯的方法包括：先将聚羟基脂肪酸酯与水混合配制成悬浮液，然后将所得悬浮液涂覆在滤布表面，再然后将涂覆悬浮液的滤布进行干燥，得到涂覆聚羟基脂肪酸酯的滤布。
本发明中，根据实际需要，还可以将所得聚羟基脂肪酸酯进行干燥，优选为喷雾干燥。
本发明中，将所得含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，还得到了液流。所得的液流中含有氨、细胞溶出物等物质，因此，可以作为氮源配制培养基，优选地，将所得的液流回用于聚羟基脂肪酸酯发酵。
本发明中，所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液可以为本领域常规的可用于制备聚羟基脂肪酸酯的微生物的发酵液，优选的，所述微生物为嗜盐菌，例如，可以为盐单胞菌属中的一种，根据本发明一种优选的实施方式，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)；更优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353(CN201010578858.8)。
本发明中，对所述聚羟基脂肪酸酯发酵使用的发酵培养基没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵培养基，此处不再进行赘述。
本发明中，对所述聚羟基脂肪酸酯发酵的条件没有特别的限制，可以为本领域常规使用的发酵条件。此处不再进行赘述。
第二方面，本发明提供了一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统，如图1所示，该系统包括细胞破碎单元2、第一固液分离单元3和氨水供给单元4；
所述细胞破碎单元2用于将所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
所述氨水供给单元4与细胞破碎单元2连通以向所述细胞破碎单元提供氨水；
所述第一固液分离单元3用于将细胞破碎单元2中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述的聚羟基脂肪酸酯。
优选地，所述细胞破碎单元2中设置有超声装置。
优选地，所述细胞破碎单元2中设置有搅拌装置。
优选地，所述细胞破碎单元2中设置有加热装置。
优选地，该系统还包括第二固液分离单元1，所述第二固液分离单元1用于将含聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
优选地，所述第二固液分离单元1包括依次连通的第二固液分离区Ⅰ11和第二固液分离区Ⅱ12；
其中，所述第二固液分离区Ⅰ11用于将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一次第二固液分离，得到含菌体细胞的第一菌体细胞和第一发酵残液；所述第二固液分离区Ⅱ12用于将在第二固液分离区Ⅰ11得到的第一菌体细胞进行第二次第二固液分离，得到含菌体细胞的第二菌体细胞和第二发酵残液，所得的第二菌体细胞进入细胞破碎单元2。
优选的，所述第二固液分离单元1中还设置有第二固液分离区Ⅲ13，所述第二固液分离区Ⅲ13用于接收在第二固液分离区Ⅰ11得到的第一发酵残液和在第二固液分离区Ⅱ12得到的第二发酵残液并进行第三次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，并将所得的第三菌体细胞输送至所述细胞破碎单元2。
优选地，所述第二固液分离区Ⅰ11中设置有碟片离心设备Ⅱ111。
优选地，所述第二固液分离区Ⅱ12中设置有带式真空过滤设备121。
优选地，所述第二固液分离区Ⅲ13中设置有板框过滤设备Ⅱ131。
优选地，所述第一固液分离单元3包括可选的第一固液分离区Ⅰ31和第一固液分离区Ⅱ32；
所述第一固液分离区Ⅰ31用于将在细胞破碎单元2中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一次第一固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的物料；
所述第一固液分离区Ⅱ32用于将在细胞破碎单元2中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液或者第一固液分离区Ⅰ31中得到的含聚羟基脂肪酸酯的物料进行第二次第一固液分离。
优选地，所述第一固液分离区Ⅰ31设置有碟片离心设备Ⅰ311。
优选地，所述第一固液分离区Ⅱ32设置有板框过滤设备Ⅰ321。
优选的，所述板框过滤设备Ⅰ321的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
优选地，所述聚羟基脂肪酸酯层的厚度为1-20mm，更优选为5-10nm。
优选地，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-25μm，更优选为13-23μm。
优选地，所述系统还包括聚羟基脂肪酸酯发酵单元5，所述第一固液分离单元3与聚羟基脂肪酸酯发酵单元5之间设置有回流管，使第一分离单元3得到的液流回流至聚羟基脂肪酸酯发酵单元5。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
聚羟基脂肪酸酯聚合度即平均聚合度，指的是聚合物分子中羟基烷酸单体的数量，通过聚羟基脂肪酸酯的重均分子量进行表征；
碟片式离心机购自南京华盛分离机械技术有限公司，型号DR203；
带式真空过滤机购自湖州核工惠能环保过滤科技有限公司，型号DY-500；
板框过滤机购自海宁市云飞过滤设备有限公司，型号YF-100-1；
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径1-200μm；
氨水购自山东恒昌圣诚化工股份有限公司，浓度为25重量％；
超声循环提取机GCXZ-2B购自北京弘祥隆生物技术股份有限公司；
PHA的收率和纯度的检测方法参考文献(Engineering self-flocculatingHalomonas campaniensis for wastewaterless open and continuous fermentation)
所述补料培养基：葡萄糖浓度400-800g/L，玉米浆粉0-80g/L，根据生长曲线，配置不同的碳氮比补料培养基，控制发酵体系的残糖浓度为5-20g/L。
制备例1
将盐单胞菌(TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353(CN201010578858.8))接种于种子培养基(5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨以及60g/L的氯化钠)中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积％的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。
然后将10体积％的接种量将二级种子液接入到初始发酵培养基(氯化钠50g/L，葡萄糖50g/L，玉米浆粉15g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾5g/L，微量元素母液I10mL/L，微量元素母液II 3mL/L。所述微量元素母液I和II，参照引用专利CN201010578858.8)中，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，转速控制600-1000rpm，通风量0.5-2.0vvm，初始溶氧控制在30％以上；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间，用NaOH控制发酵pH为8-9之间，发酵55小时。
实施例1
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量90重量％)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体(含水量75重量％)(第二菌体细胞)进入超声波辅助提取罐，滤液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.2MPa，滤布孔径为500目，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中杂质。
(5)开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为200rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.2mol/L，菌悬液的OD600值为200，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为300W/m3菌悬液，菌悬液的温度为70℃、超声破碎的时间为60min，压力为常压。
(6)将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流(液流)和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为25℃，压力为0.5MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为13μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为10mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例2
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量80重量％)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
(2)将步骤(1)得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体(含水量80重量％)(第二菌体细胞)进入超声波辅助提取罐待下一步处理，滤液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.4MPa，滤布孔径为800目得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
(5)开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为250rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.35mol/L，菌悬液的OD600值为400，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为500W/m3菌悬液，菌悬液的温度为75℃、超声破碎的时间为75min，压力为常压。
(6)将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为25℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为7mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例3
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量70重量％)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体(含水量85重量％)(第二菌体细胞)进入超声波辅助提取罐，滤液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.5MPa，滤布孔径为1000目，得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)将超声波提取罐中的含菌体细胞的固相进行水洗2次，离心分离去除其中杂质。
(5)开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH的氨的浓度为0.5mol/L，菌悬液的OD600值为600，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为1000W/m3菌悬液，菌悬液的温度为80℃、超声破碎的时间为90min，压力为常压。
(6)将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
(7)将步骤(6)中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为23μm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层(厚度为5mm)；所得滤液作为发酵培养基的配料。
(8)将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例4
按照实施例2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(5)中最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为1mol/L。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例5
按照实施例2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的平均厚度为20mm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例6
按照实施例2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(1)中，使用板框过滤机进行过滤，步骤(2)中使用碟片式离心机进行离心分离，步骤(3)中使用带式真空过滤机进行过滤。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例7
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(5)中，超声的功率为2000W/m3混合液，温度为60℃、时间为180min，压力为常压。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例8
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(7)中板框过滤机的滤布不预涂覆聚羟基脂肪酸酯层。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例9
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(7)中板框过滤机的滤布孔径为25μm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例10
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量80重量％)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体(含水量70重量％)(第二菌体细胞)进入超声波辅助提取罐，滤液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.2MPa，滤布的孔径为500目，得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为200rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.4mol/L，菌悬液的OD600值为400；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为1000W/m3菌悬液，菌悬液的温度为60℃、超声破碎的时间为90min，压力为常压。
(5)将步骤(4)中所得浆液送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.5MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19μm，所得滤液用于发酵培养基的配料。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
实施例11
(1)将制备例1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流(水含量90重量％)(第一菌体细胞)和发酵残液顶流(第一发酵残液)，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
(2)将步骤(1)得到的富含菌体细胞的底流用等体积的水洗涤3次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体(含水量70重量％)(第二菌体细胞)进入超声波辅助提取罐待下一步处理，滤液(第二发酵残液)进入发酵残液暂存罐。
(3)将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.4MPa，滤布的孔径为800目，得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤(2)中的菌体(第二菌体细胞)混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
(4)开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.2mol/L，菌悬液的OD600值为480；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为1000W/m3菌悬液，菌悬液的温度为90℃、超声破碎的时间为20min，压力为常压。
(5)将步骤(4)中所得浆液送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.5MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19μm，所得滤液用于发酵培养基的配料。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
对比例1
按照CN106687502A中实施例1公开的方法对实施例1的步骤(3)中提取罐中的菌体细胞进行PHA的提取。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
对比例2
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，将步骤(5)中加入的氨水替换为等体积的水。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
对比例3
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤(5)中不开启超声设备。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
对比例4
按照实施例1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，将氨水替换为氢氧化钠，且使得菌悬液的pH值与实施例1相同。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表1所示。
表1
编号 收率(％) 纯度(％) PHA重均分子量
实施例1 89 96 350KDa
实施例2 89 96 360KDa
实施例3 88 95 340KDa
实施例4 87 94 300KDa
实施例5 85 92 310KDa
实施例6 83 93 320KDa
实施例7 85 92 320KDa
实施例8 80 90 310KDa
实施例9 83 93 320KDa
实施例10 84 92 330KDa
实施例11 85 91 330KDa
对比例1 77 85 260KDa
对比例2 77 90 270KDa
对比例3 76 90 280KDa
对比例4 75 90 230KDa
通过表1的结果可以看出，采用本发明方法提取得到的聚羟基脂肪酸酯具有较高的收率和纯度，以及较高的聚合度(由PHA的重均分子量表征)，而较高的PHA收率和纯度则间接的降低了成本；采用本发明最优选技术方案的实施例1-3具有明显更好的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (40)

1.一种提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将氨水与含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞混合得到菌悬液并进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
(2)将所得含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述聚羟基脂肪酸酯；
其中，所述菌悬液中，以NH4OH计的氨的浓度为0.1-1mol/L，所述菌悬液的OD600值为100-800；
其中，步骤(1)中，所述超声破碎的条件包括：超声的功率为200-2000W/m3菌悬液；超声的温度为60-90℃；超声的时间为20-180min；搅拌转速为50-350rpm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌悬液中，以NH4OH计的氨的浓度为0.2-0.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌悬液的OD600值为200-600。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)中，所述超声破碎的条件包括：超声的功率为300-1000W/m3菌悬液；超声的温度为70-80℃；超声的时间为60-90min；搅拌转速为200-300rpm。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞由以下方法得到：将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离，得到所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为70-90重量％。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第二固液分离的条件使得所得菌体细胞的水含量为75-85重量％。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离的方法包括：
(a)将聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一菌体细胞和第一发酵残液；
(b)将所得的第一菌体细胞进行第二次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二菌体细胞和第二发酵残液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在进行所述第二次第二固液分离之前，先将所得第一菌体细胞进行洗涤。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一次第二固液分离为碟片式离心分离。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二次第二固液分离为真空过滤分离。
12.根据权利要求5所述的方法，其中，该方法还包括：将所得的第一发酵残液和所得的第二发酵残液进行第三次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，然后将所得第三菌体细胞与所得的第二菌体细胞混合作为所述含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第三次第二固液分离为板框过滤分离。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在进行步骤(1)之前，该方法还包括对所述菌体细胞进行洗涤的步骤。
15.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤(2)中所述第一固液分离的方法包括第一板框过滤分离。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一板框过滤的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.1-0.6MPa，时间为0.5-5小时。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一板框过滤的条件包括：温度为10-30℃，压力为0.15-0.4MPa，时间为1-4小时。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一板框过滤的条件包括：温度为15-25℃，压力为0.2-0.3MPa，时间为2-3h。
19.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤(2)中，所述第一固液分离的方法包括依次进行的第一离心分离和第一板框过滤分离。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，其中，所述预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-25μm。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径为1-200μm。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-20mm。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述第一板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为5-10mm。
26.一种提取聚羟基脂肪酸酯的系统，其特征在于，该系统包括细胞破碎单元(2)、第一固液分离单元(3)和氨水供给单元(4)；
所述细胞破碎单元(2)用于将含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液；
所述氨水供给单元(4)与细胞破碎单元(2)连通以向所述细胞破碎单元(2)提供氨水；
所述第一固液分离单元(3)用于将细胞破碎单元(2)中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一固液分离，得到所述的聚羟基脂肪酸酯。
27.根据权利要求26所述的系统，其中，所述细胞破碎单元(2)中设置有搅拌装置和超声装置。
28.根据权利要求26所述的系统，其中，该系统还包括第二固液分离单元(1)，所述第二固液分离单元(1)用于将含聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞。
29.根据权利要求28所述的系统，其中，所述第二固液分离单元(1)包括依次连通的第二固液分离区Ⅰ(11)和第二固液分离区Ⅱ(12)；
其中，所述第二固液分离区Ⅰ(11)用于将所述聚羟基脂肪酸酯的发酵液进行第一次第二固液分离，得到含菌体细胞的第一菌体细胞和第一发酵残液；所述第二固液分离区Ⅱ(12)用于将在第二固液分离区Ⅰ(11)得到的第一菌体细胞进行第二次第二固液分离，得到含菌体细胞的第二菌体细胞和第二发酵残液，所得的第二菌体细胞进入细胞破碎单元(2)。
30.根据权利要求29所述的系统，其中，所述第二固液分离单元(1)中还设置有第二固液分离区Ⅲ(13)，所述第二固液分离区Ⅲ(13)用于接收在第二固液分离区Ⅰ(11)得到的第一发酵残液和在第二固液分离区Ⅱ(12)得到的第二发酵残液并进行第三次第二固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的第三菌体细胞和第三发酵残液，并将所得的第三菌体细胞输送至所述细胞破碎单元(2)。
31.根据权利要求29所述的系统，其中，所述第二固液分离区Ⅰ(11)中设置有碟片离心设备Ⅱ(111)。
32.根据权利要求29所述的系统，其中，所述第二固液分离区Ⅱ(12)中设置有带式真空过滤设备(121)。
33.根据权利要求30所述的系统，其中，所述第二固液分离区Ⅲ(13)中设置有板框过滤设备Ⅱ(131)。
34.根据权利要求26-33中任意一项所述的系统，其中，所述第一固液分离单元(3)包括可选的第一固液分离区Ⅰ(31)和第一固液分离区Ⅱ(32)；
所述第一固液分离区Ⅰ(31)用于将在细胞破碎单元(2)中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液进行第一次第一固液分离，得到含聚羟基脂肪酸酯的物料；
所述第一固液分离区Ⅱ(32)用于将在细胞破碎单元(2)中得到的含聚羟基脂肪酸酯的浆液或者第一固液分离区Ⅰ(31)中得到的含聚羟基脂肪酸酯的物料进行第二次第一固液分离。
35.根据权利要求34所述的系统，其中，所述第一固液分离区Ⅰ(31)设置有碟片离心设备Ⅰ(311)。
36.根据权利要求34所述的系统，其中，所述第一固液分离区Ⅱ(32)设置有板框过滤设备Ⅰ(321)。
37.根据权利要求36所述的系统，其中，所述板框过滤设备Ⅰ(321)的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
38.根据权利要求37所述的系统，其中，所述聚羟基脂肪酸酯层的厚度为1-20mm。
39.根据权利要求38所述的系统，其中，所述聚羟基脂肪酸酯层的厚度为5-10nm。
40.根据权利要求39所述的系统，其中，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1-25μm。
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