CN102373251B - 一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素d发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,通过在埃博霉素D发酵生产时添加特异性吸附埃博霉素D的分子印迹聚合物,这样在发酵时分子印迹聚合物在达到吸附平衡之前将持续的吸附发酵时产生的埃博霉素D,另一方面,埃博霉素D被分子印迹聚合物吸附,也有利于其在发酵产物中的分离,只要离心分离收集作为沉淀的分子印迹聚合物,就可以将其从发酵液中分离,然后再从分子印迹聚合物将埃博霉素D萃取出来就可以了,而分子印迹聚合物经过干燥处理还可以重复使用。
Description
技术领域
本发明属于埃博霉素D的生产技术领域,涉及一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法。
背景技术
埃博霉素D(Epothilone D,KOS-862)是微生物纤维堆囊菌产生的一种目前正在进行II期临床试验的抗肿瘤药物,是目前抗肿瘤药物的一个研究热点。目前埃博霉素生产成本很高,其中有两个重要原因。第一是埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大程度导致埃博霉素发酵产量很难提高,这方面的困难虽然已经依靠在发酵液中添加大孔吸附树脂XAD-16得到一定的缓减,但树脂对发酵液中营养物质的非特异性吸附为埃博霉素的产量提高又带来许多新的困难。第二个导致埃博霉素生产成本高的原因是发酵结束后产物中存在大量埃博霉素同系物,导致目标产物(例如:埃博霉素D)分离纯化成本非常高。因此开发能特异性吸附特定埃博霉素类化合物的吸附剂用于它的发酵生产和分离提取中将极大降低埃博霉素药物的生产成本。分子印迹聚合物作为一种特异性靶向吸附能力聚合物,在药物分析分离方法已有成功应用的实例,但还没有将分子印迹聚合物应用到埃博霉素D的发酵生产中。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,降低发酵生产中的反馈抑制作用,提高埃博霉素D发酵产量,并降低其分离提取成本。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,包括以下步骤:
1)按100ml接种1~10mg菌种的比例,将纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)接种于发酵液中,然后加入菌种质量100~800倍的特异性吸附埃博霉素D的分子印迹聚合物,在25~35℃下摇床发酵96~192h;
2)发酵完成后,分离并收集发酵液中的吸附了埃博霉素D的分子印迹聚合物,然后用甲醇多次萃取,将埃博霉素D从分子印迹聚合物中分离出来,分别收集含有埃博霉素D的甲醇和分子印迹聚合物;蒸除甲醇后获得埃博霉素D。
所述的发酵液中含有酵母粉20~50g/L、玉米淀粉5~10g/L、磷酸二氢钠1~2g/L、磷酸氢二钠1~2g/L、MgSO4·7H2O2~5g/L、FeSO4·7H2O0.1~0.5g/L、CaCl22~5g/L、MnCl20.1~0.5g/L和葡萄糖10~15g/L,pH为7.2~7.5。
所述的分子印迹聚合物的制备为:
按照埃博霉素D:功能单体:交联剂:引发剂:溶剂=1:(2~6):(20~30):(0.6~1):(3~20)的摩尔比,将上述反应原料加入到反应容器中,在保护气氛下超声振荡20~30min,在搅拌下通入氮气20~30min;然后在45~55℃下聚合反应12~24h,再在55~65℃下聚合反应8~12h;聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40~60μm的聚合反应物;
所述的功能单体为:丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、烯丙胺或2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸;所述的交联剂为:2-甲基丙烯酸乙二醇酯、4-咪唑丙烯酸乙酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺或4-咪唑丙烯酸;
将收集的聚合反应物用水充分洗涤后,然后用乙酸:甲醇体积比=1:9~3:7的混合溶液连续洗涤,脱去埃博霉素D,真空干燥后得到埃博霉素D的分子印迹聚合物。
所述的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰;所述的溶剂为去离子水、甲醇或乙腈。
所述的摇床的转速为100~160r/min。
所述的分子印迹聚合物从发酵液中的分离为:将发酵结束后含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500~3000r/min离心20~30min,收集下层沉淀物,得到吸附有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
所脱去埃博霉素D的分子印迹聚合物经过甲醇充分洗涤后,然后真空干燥后还作为埃博霉素D的特异性吸附剂在发酵时加入,重复使用次数为2~5次。
所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25531。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明提供的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,通过在埃博霉素D发酵生产时添加特异性吸附埃博霉素D的分子印迹聚合物,这样在发酵时分子印迹聚合物在达到吸附平衡之前将持续的吸附发酵时产生的埃博霉素D,解决了埃博霉素D发酵时的反馈抑制作用,实现连续液体发酵生产埃博霉素D;另一方面,埃博霉素D被分子印迹聚合物吸附,也有利于其在发酵产物中的分离,只要离心分离收集作为沉淀的分子印迹聚合物,就可以将其从发酵液中分离,然后再从分子印迹聚合物将埃博霉素D萃取出来就可以了,而分子印迹聚合物经过干燥处理还可以重复使用。
本发明提供的埃博霉素D的分子印迹聚合物,从待吸附的大环内酯化合物埃博霉素D的分子结构式的角度出发,选择的功能单体满足能与大环内酯化合物之间形成共价键或者非共价键如氢键、静电力、偶极作用、疏水作用以及范德华力、分子间络合物等的结合,交联剂为和功能单体聚合性质匹配的交联剂;所制备的分子印迹聚合物能够对埃博霉素D特异性的吸附,而且达到平衡吸附量为30-50mg/g,平衡吸附时间为10h,在发酵液中足量加入分子印迹聚合物即可。
具体实施方式
本发明提供一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,在进行发酵时将添加作为吸附剂的分子印迹聚合物,以便于埃博霉素D的连续生产和分离。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
分子印迹聚合物的合成:
功能单体、交联剂、引发剂的选择:从待吸附的大环内酯化合物埃博霉素D的分子结构式的角度出发,选择的功能单体应该满足能与大环内酯化合物之间形成共价键或者非共价键如氢键、静电力、偶极作用、疏水作用以及范德华力、分子间络合物等的结合;交联剂为和功能单体聚合性质匹配的交联剂;引发剂为自由基聚合引发剂。
在进行反应聚合时:
分子印迹聚合物的合成过程中功能单体的浓度为0.015-0.03mol/L,致孔剂用量为0.004-0.01mol/L或致孔剂/功能单体=1:4-1:3(摩尔比),交联剂用量为0.05-0.1mol/L或交联剂/功能单体=1:1-1:7(摩尔比),模板分子用量为0.002-0.006mol/L或模板分子/功能单体=1:3-1:15(摩尔比),引发剂用量为0.003-0.01mol/L或引发剂/功能单体=1:2-1:10(摩尔比);
实施例1
分子印迹聚合物的制备及埃博霉素D的发酵,包括以下步骤:
1)分子印迹聚合物的制备
按以下比例称取:0.4917g(1mmol)埃博霉素D,0.284g(4mmol)丙烯酰胺或者0.228g(4mmol)烯丙胺,3.35g(25mmol)N,N-亚甲基双丙烯酰胺、120mg偶氮二异丁腈和3ml去离子水加入到三口瓶中,于N2或者Ar保护下,并将此容器进行超声波振荡20分钟,使之充分溶解并脱气;
于搅拌状态下通入氮气30分钟排出反应器的氧气,50℃水浴中聚合24小时,再于60℃水浴中聚合12小时得到反应产物;
将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60μm的含有模板分子的分子印迹聚合物颗粒,然后再用乙酸:甲醇(体积比1:9)混合溶液连续洗涤,直到分子印迹聚合物中无埃博霉素D为止;将去除模板分子的埃博霉素D分子印迹聚合物真空干燥(真空度为60Pa,温度为30℃)得到埃博霉素D分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素D的发酵
将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂,按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/10mg/3g的用量投入到埃博霉素D的发酵液中;
发酵液的组成为酵母粉20g/L,玉米淀粉5g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,CaCl25g/L,MnCl20.1g/L,葡萄糖10g/L,pH7.2;
发酵温度为30℃,发酵摇床转速为120rpm,发酵时间为96小时;
将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离30分钟进行分离分子印迹聚合物,弃去上清液,下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
3)埃博霉素D的分离
埃博霉素D的洗脱采用溶剂萃取法:
以甲醇作为萃取液,常温下将含有埃博霉素D的分子印迹聚合物用甲醇重复萃取3次后,再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次;
含有埃博霉素D的甲醇溶液旋转蒸发(转速为100rpm,温度为40℃)回收甲醇,甲醇重复利用;蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素D粗品。
甲醇洗涤过的埃博霉素D的分子印迹聚合物,经真空干燥、研磨、过40~60μm筛或真空干燥即可重复使用,能够保证高效吸附埃博霉素D的使用次数为3次。
实施例2
分子印迹聚合物的制备及埃博霉素D的发酵,包括以下步骤:
1)分子印迹聚合物的制备
按以下比例称取:0.4917g(1mmol)埃博霉素D,0.344g(4mmol)甲基丙烯酸,4.96g(25mmol)2-甲基丙烯酸乙二醇酯和120mg过氧化二苯甲酰溶于3ml甲醇溶液,于N2或者Ar保护下,并将此容器进行超声波振荡20-30分钟,使之充分溶解并脱气;
于搅拌状态下通入氮气30分钟排出反应器的氧气,50℃水浴中聚合24小时,再于60℃水浴中聚合12小时得到反应产物;
将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60μm的含有模板分子的分子印迹聚合物颗粒,然后再用乙酸:甲醇(体积比3:7)混合溶液连续洗涤,直到分子印迹聚合物中无埃博霉素D为止;将去除模板分子的埃博霉素D分子印迹聚合物真空干燥得到埃博霉素D分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素D的发酵
将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂,按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/10mg/6g的用量投入到埃博霉素D的发酵液中;
发酵液的组成为酵母粉50g/L,玉米淀粉10g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,CaCl25g/L,MnCl20.1g/L,葡萄糖15g/L,pH7.2;
发酵温度为28℃,发酵摇床转速为160rpm,发酵时间为192小时;
将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于3000rpm的离心机上分离20分钟进行分离分子印迹聚合物,弃去上清液,下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
3)埃博霉素D的分离
埃博霉素D的洗脱采用溶剂萃取法:
以甲醇作为萃取液,常温下将含有埃博霉素D的分子印迹聚合物用甲醇重复萃取3次后,再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次;含有埃博霉素D的甲醇溶液旋转蒸发(转速为100rpm,温度为40℃)回收甲醇,甲醇重复利用,蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素D粗品。
甲醇洗涤过的埃博霉素D的分子印迹聚合物,经真空干燥、研磨、过40~60μm筛或真空干燥即可重复使用,能够保证高效吸附埃博霉素D的使用次数为3次。
实施例3
分子印迹聚合物的制备及埃博霉素D的发酵,包括以下步骤:
1)分子印迹聚合物的制备
按以下比例称取:称取0.4917g(1mmol)埃博霉素D,0.414g(2mmol)2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸,3.82g(25mmol)4-咪唑丙烯酸乙酯和120mg偶氮二异丁腈溶于3ml乙腈溶液,于N2或者Ar保护下,并将此容器进行超声波振荡20-30分钟,使之充分溶解并脱气;
于搅拌状态下通入氮气30分钟排出反应器的氧气,55℃水浴中聚合24小时,再于65℃水浴中聚合12小时得到反应产物;
将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60μm的含有模板分子的分子印迹聚合物颗粒。然后再用乙酸:甲醇(体积比2:6)混合溶液连续洗涤,直到分子印迹聚合物中无埃博霉素D为止;将去除模板分子的埃博霉素D分子印迹聚合物真空干燥得到埃博霉素D分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素D的发酵
将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂,按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/5mg/4g的用量投入到埃博霉素D的发酵液中;
发酵液的组成为酵母粉50g/L,玉米淀粉10g/L,磷酸二氢钠2g/L,磷酸氢二钠2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,FeSO4·7H2O0.1g/L,CaCl25g/L,MnCl20.1g/L,葡萄糖15g/L,pH7.2;
发酵温度为35℃,发酵摇床转速为100rpm,发酵时间为150小时;
将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于3000rpm的离心机上分离20分钟进行分离分子印迹聚合物,弃去上清液,下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
3)埃博霉素D的分离
埃博霉素D的洗脱采用溶剂萃取法:
以甲醇作为萃取液,常温下将含有埃博霉素D的分子印迹聚合物用甲醇重复萃取3次后,再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次;
含有埃博霉素D的甲醇溶液旋转蒸发(转速为100rpm,温度为45℃)回收甲醇,甲醇重复利用,蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素D粗品。
甲醇洗涤过的埃博霉素D的分子印迹聚合物,经真空干燥、研磨、过40~60μm筛或真空干燥即可重复使用,能够保证高效吸附埃博霉素D的使用次数为3次。
实施例4
分子印迹聚合物的制备及埃博霉素D的发酵,包括以下步骤:
1)分子印迹聚合物的制备
按以下比例称取:1mmol埃博霉素D,5mmol丙烯酰胺,3.45g(25mmol)4-咪唑丙烯酸和100mg过氧化二苯甲酰溶于10ml甲醇,于N2或者Ar保护下,并将此容器进行超声波振荡30分钟,使之充分溶解并脱气;
于搅拌状态下通入氮气30分钟排出反应器的氧气,50℃水浴中聚合24小时,再于60℃水浴中聚合12小时得到反应产物;
将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60μm的含有模板分子的分子印迹聚合物颗粒。然后再用乙酸:甲醇(体积比2:7)混合溶液连续洗涤,直到分子印迹聚合物中无埃博霉素D为止;将去除模板分子的埃博霉素D分子印迹聚合物真空干燥得到埃博霉素D分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素D的发酵
将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂,按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博霉素D的发酵液中;
发酵液的组成为酵母粉30g/L,玉米淀粉8g/L,磷酸二氢钠1.5g/L,磷酸氢二钠1.5g/L,MgSO4·7H2O3g/L,FeSO4·7H2O0.2g/L,CaCl24g/L,MnCl20.25g/L,葡萄糖12g/L,pH7.45;
发酵温度为28℃,发酵摇床转速为120rpm,发酵时间为160小时;
将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于3000rpm的离心机上分离20分钟进行分离分子印迹聚合物,弃去上清液,下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
3)埃博霉素D的分离
埃博霉素D的洗脱采用溶剂萃取法:
以甲醇作为萃取液,常温下将含有埃博霉素D的分子印迹聚合物用甲醇重复萃取3次后,再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次;
含有埃博霉素D的甲醇溶液旋转蒸发(转速为100rpm,温度为40℃)回收甲醇,甲醇重复利用,蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素D粗品。
甲醇洗涤过的埃博霉素D的分子印迹聚合物,经真空干燥、研磨、过40~60μm筛或真空干燥即可重复使用。
实施例5
分子印迹聚合物的制备及埃博霉素D的发酵,包括以下步骤:
1)分子印迹聚合物的制备
按以下比例称取:0.4917g(1mmol)埃博霉素D,3mmol甲基丙烯酸甲酯,30mmolN,N-亚甲基双丙烯酰胺和100mg偶氮二异丁腈溶于5ml乙腈溶液,于N2或者Ar保护下,并将此容器进行超声波振荡20-30分钟,使之充分溶解并脱气;
于搅拌状态下通入氮气30分钟排出反应器的氧气,45℃水浴中聚合24小时,再于55℃水浴中聚合12小时得到反应产物;
将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60μm的含有模板分子的分子印迹聚合物颗粒。然后再用乙酸:甲醇(体积比1:8)混合溶液连续洗涤,直到分子印迹聚合物中无埃博霉素D为止;将去除模板分子的埃博霉素D分子印迹聚合物真空干燥得到埃博霉素D分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素D的发酵
将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂,按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/2mg/2g的用量投入到埃博霉素D的发酵液中;
发酵液的组成为酵母粉20g/L,玉米淀粉5g/L,磷酸二氢钠1g/L,磷酸氢二钠1g/L,MgSO4·7H2O2g/L,FeSO4·7H2O0.5g/L,CaCl22g/L,MnCl20.5g/L,葡萄糖10g/L,pH7.5;
发酵温度为32℃,发酵摇床转速为150rpm,发酵时间为120小时;
将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于3000rpm的离心机上分离20分钟进行分离分子印迹聚合物,弃去上清液,下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
3)埃博霉素D的分离
埃博霉素D的洗脱采用溶剂萃取法:
以甲醇作为萃取液,常温下将含有埃博霉素D的分子印迹聚合物用甲醇重复萃取3次后,再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次;
含有埃博霉素D的甲醇溶液旋转蒸发(转速为100rpm,温度为50℃)回收甲醇,甲醇重复利用,蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素D粗品。
甲醇洗涤过的埃博霉素D的分子印迹聚合物,经真空干燥、研磨、过40~60μm筛或真空干燥即可重复使用。
Claims (7)
1.一种添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)按100ml接种1~10mg菌种的比例,将纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)接种于发酵液中,然后加入菌种质量100~800倍的特异性吸附埃博霉素D的分子印迹聚合物,在25~35℃下摇床发酵96~192h;
2)发酵完成后,分离并收集发酵液中的吸附了埃博霉素D的分子印迹聚合物,然后用甲醇多次萃取,将埃博霉素D从分子印迹聚合物中分离出来,分别收集含有埃博霉素D的甲醇和分子印迹聚合物;蒸除甲醇后获得埃博霉素D粗品;
所述的分子印迹聚合物的制备为:
按照埃博霉素D∶丙烯酰胺∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶去离子水=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶烯丙胺∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶去离子水=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶甲基丙烯酸∶2-甲基丙烯酸乙二醇酯∶过氧化二苯甲酰∶甲醇=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸∶4-咪唑丙烯酸乙酯∶偶氮二异丁腈∶乙腈=1mmol∶2mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶丙烯酰胺∶4-咪唑丙烯酸乙酯∶过氧化二苯甲酰∶甲醇=1mmol∶5mmol∶25mmol∶100mg∶10ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶甲基丙烯酸甲酯∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶乙腈=1mmol∶3mmol∶30mmol∶100mg∶5ml的比例;
将上述反应原料加入到反应容器中,超声振荡20~30min,在搅拌下通入氮气20~30min;然后在45~55℃下聚合反应12~24h,再在55~65℃下聚合反应8~12h;聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40~60μm的聚合反应物;
将收集的聚合反应物用水充分洗涤后,然后用乙酸:甲醇体积比=1:9~3:7的混合溶液连续洗涤,脱去埃博霉素D,真空干燥后得到埃博霉素D的分子印迹聚合物。
2.如权利要求1所述的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,所述的发酵液中含有酵母粉20~50g/L、玉米淀粉5~10g/L、磷酸二氢钠1~2g/L、磷酸氢二钠1~2g/L、MgSO4·7H2O 2~5g/L、FeSO4·7H2O 0.1~0.5g/L、CaCl2 2~5g/L、MnCl2 0.1~0.5g/L和葡萄糖10~15g/L,pH为7.2~7.5。
3.如权利要求1所述的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,所述的摇床的转速为100~150r/min。
4.如权利要求1所述的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,所述的分子印迹聚合物从发酵液中的分离为:将发酵结束后含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500~3000r/min离心20~30min,收集下层沉淀物,得到吸附有埃博霉素D的分子印迹聚合物。
5.如权利要求1所述的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,脱去埃博霉素D的分子印迹聚合物经过甲醇充分洗涤后,然后真空干燥后还作为埃博霉素D的特异性吸附剂在发酵时加入,重复使用次数为2~5次。
6.如权利要求1所述的添加分子印迹聚合物的埃博霉素D发酵生产方法,其特征在于,所述的纤维堆囊菌为纤维堆囊菌ATCC25531。
7.一种埃博霉素D的分子印迹聚合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
按照埃博霉素D∶丙烯酰胺∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶去离子水=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶烯丙胺∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶去离子水=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶甲基丙烯酸∶2-甲基丙烯酸乙二醇酯∶过氧化二苯甲酰∶甲醇=1mmol∶4mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸∶4-咪唑丙烯酸乙酯∶偶氮二异丁腈∶乙腈=1mmol∶2mmol∶25mmol∶120mg∶3ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶丙烯酰胺∶4-咪唑丙烯酸乙酯∶过氧化二苯甲酰∶甲醇=1mmol∶5mmol∶25mmol∶100mg∶10ml的比例;
或者按照埃博霉素D∶甲基丙烯酸甲酯∶N,N-亚甲基双丙烯酰胺∶偶氮二异丁腈∶乙腈=1mmol∶3mmol∶30mmol∶100mg∶5ml的比例;
将上述反应原料加入到反应容器中,超声振荡20~30min,在搅拌下通入氮气20~30min;然后在45~55℃下聚合反应12~24h,再在55~65℃下聚合反应8~12h;聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40~60μm的聚合反应物;
将收集的聚合反应物用水充分洗涤后,然后用乙酸:甲醇体积比=1:9~3:7的混合溶液连续洗涤,脱去埃博霉素D,真空干燥后得到埃博霉素D的分子印迹聚合物。
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