CN104805149A - 一种伊沙匹隆的半合成制备方法 - Google Patents

Abstract

一种制备抗癌药物伊沙匹隆的方法，该方法采用基因突变方法，使用eopK抑制剂，促使epoK基因产物——细胞色素P450氧化酶失活，定向获得埃博霉素C和D而不产生埃博霉素A和B。上述突变菌株进一步进行UV诱变育种，得到埃博霉素D的高产菌株，使用该菌株发酵生产埃博霉素D，再以埃博霉素D为起始原料经钯催化开环生成一种氨基酸，然后氧化环合成为内酰胺埃博霉素D，再经过环氧化合成伊沙匹隆。

Description

一种伊沙匹隆的半合成制备方法

技术领域

本发明涉及一种伊沙匹隆的生产方法，具体地说涉及一种通过粘细菌中纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素D，然后以其为起始原料，通过半合成方法产生伊沙匹隆的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物。埃博霉素A和B是在20世纪90年代由及其同事最先从南非Zambesi河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum(Myxococcales)菌株So ce90，从其培养物中分离提取了一种具有抗癌活性的化合物，埃博霉素A、B、C、D结构如下：

埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。埃博黴素目前被世界上公认为21世纪将取代紫杉醇的最有效的抗癌药物。与紫杉醇比较，埃博霉素水溶性好，注射、口服均可：结构简单，有利于化学合成及衍生化：埃博霉素在P-糖蛋白表达型的多药耐药性(MDR)细胞中也维持很大的细胞毒性，约为紫杉醇的2000-5000倍。

目前，已有六种埃博霉素类化合物进入了临床试验：他们是Ixepa(Ixabepilone)、埃博霉素B、ABJ879、埃博霉素D、KOS-1584、ZK-Epo。其中施贵宝公司的Ixabelilone于2007年10月16日被FDA批准作为一线乳癌的治疗药物。Ixabelilone实际上是一种Aza-epothilone B，即埃博霉素B内酰胺衍生物。它是由纤维堆囊菌So ce90(DSM6773)经UV诱变得到So ce90B2菌株，然后再经亚硝基胍(NTG)诱变育种，得到一株高产菌株SC16408，发酵得到埃博霉素B。然后，以发酵产物埃博霉素B为起始原料转化为伊沙匹隆。阎家麒(CN1554659)曾以全合成埃博霉素B为原料，采用区域性和立体选择性钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素B开环，得到一种氮酸，再经三苯磷处理，生成亚氨基正膦，经氢氧化铵水解成为氨基酸。最后用二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)和固体碳酸氢钠促进氨基酸环化反应，得到标的的伊沙匹隆。

微生物发酵方法生产埃博霉素的产量都很低，只有原始文献(Gerth et al，The Journal of Antibiotics，1996，49：560)埃博霉素A和B产率分别为22和11mg/L。但是，其后许多文献重复发酵方法，均未得到该产率。即使经诱变选育的“高产菌株”实际也只有埃博霉素A 1.0-6.0mg/L和埃博霉素B 0.5-3.0mg/L。邱荣国(CN1629283)采用UV诱变育种方法，获得了一种以埃博霉素D为主要代谢产物的新菌株S.cellulosum BGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他条件相同的情况下，该类菌株只产生埃博霉素C和D，而不产生埃博霉素A和B。

目前，缺乏一种高产埃博霉素D的生物合成方法，尤其是适用于工业规模生产埃博霉素D的实用技术，进而以其为起始材料，采用简易的半合成方法，制造抗癌药物伊沙匹隆。

发明内容

黏细菌的纤维素堆囊菌原始菌株目标产物产率低，采用物理或化学方法诱变育种，所得到的菌株生产能力仍然不理想。在埃博霉素生物合成中，影响基因突变的因素很多。

纤维素堆囊菌So oe90与埃博霉素生物合成有关的基因簇进行的筛选和全测序，获得了埃博霉素合成酶基因的全部序列。埃博霉素生物合酶全长约56kb，是聚酮合酶/非核糖体肽合成酶的杂合体基因簇，即同时含有I型聚酮合酶(PKS)模版和非核糖体肽合成酶(NRPS)。埃博霉素生物合成酶依照转录顺序顺序依次是epoA(1个负载模版)→epoP(1个NRPS模版)→epoB(1个PKS模版)→epoC(4个PKS模版)→epoD(2个PKS模版)→epoE(1个PKS模版)→epoF(环氧酶P450)，这些基因的转录方向一致，同时由于epoA/epoP、epoB/epoC中存在基因的重叠现象，推测epoA/epoP、epoB/epoC可能共转录。而在epoP/epoB(147bp)，epoD/epoE(15bp)和epoE/epoF(115bp)基因之间短小的间区序列中没有发现转录终止子，这表明所有这些基因可能是有一个异常大的操纵子(≥56kb)构成。根据同位素¹³C标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括5个阶段：

1、聚酮链的引发：在酰基转移酶的作用下，活化载体蛋白，形成活化中心；

2、链合成的起始和噻唑环的形成：在epoA和epoP模版的共同作用下催化乙酰基和半胱氨酸，缩合形成埃博霉素合成的特殊起始物-2-甲基噻唑五元杂环；

3、链的延伸和转移：埃博霉素骨架每经过一个模版就有一个二碳单元结合到聚酮链上，并加以适当的修饰。在延伸阶段，埃博霉素骨架依次经过epoB(1个PKS模版)、epoC(4个PKS模版)、epoD(2个PKS模版)、epoE(1个PKS模版)，共经过8个模版，形成了埃博霉素的16元骨架。

4、链合成的终止释放和环化：在进行到epoE的末端的时候，16元环的骨架从活化位点转移到epoE末端区域中硫酯酶的丝氨酸位点上，终止了链的合成。在环化酶的作用下，自身分子内环化，解离形成16元大环内酯化合物。

5、产物的后修饰：埃博霉素基因序列中的P450(epoF)是由420个氨基酸组成，氨基酸序列与细胞色素P450氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素C12-C13之间的环氧化，使埃博霉素C和D环氧化成为埃博霉素A和B。突变该基因，可以使埃博霉素的合成停留在C和D上。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。

本发明以纤维堆囊菌ATCC15384为出发菌株，首先使用一种epoK的抑制剂，致使基因突变，由于新菌株缺乏epoK氧化酶功能，抑制了C12-C13环氧化反应，使得埃博霉素C和D向埃博霉素A和B的转化受到遏制，因而，该菌株只产生埃博霉素C和D，而不产生埃博霉素A和B。然后，将该突变菌株通过UV诱变育种，获得一种埃博霉素D的高产菌株，用于提高埃博霉素D的产量。

本发明提供的伊沙匹隆的半合成制备方法，是以埃博霉素D作为起始原料合成伊沙匹隆。该方法特征在于以埃博霉素D为原料，采用立体选择性钯催化大环内酯氮化反应，促使埃博霉素D开环，得到一种氮酸，经水解成为氨基酸。最后促进氨基酸环化反应，得到标的伊沙匹隆。

下面对本发明方法作进一步描述：

以粘细菌的纤维堆囊菌YM-3880为出发菌株，培养基含生物大分子化合物、糖、氨基酸、盐、核酸、维生素、抗菌素、微量元素，以及来源于生物材料的酵母提取物、脱脂大豆粉、马铃薯淀粉等。

突变epoK基因产物-细胞色素P450氧化酶，采用的epoK抑制剂包括metyrapone和ketoconazole，itraconazole，miconazole，furafylline，sulfaphenazole，proadifen，debrisoquin等具有炔类作用机理的不可逆抑制剂。其中更优选的是metyrapone。Metyrapone在培养基中有效地抑制epoK，增加埃博霉素C和D的产量而不抑制菌株的生长。抑制剂加入发酵培养基的终浓度为1nM至1M，优选1μM至100mM，更优选的的是10μM至10mM，在发酵开始时一次或发酵过程中分批加入。

通过基因突变处理，致使纤维堆囊菌的epoK基因失活，所获得的变异菌株，由于缺乏功能性epoK，产生的埃博霉素A和B大为减少或者不产生埃博霉素A和B。突变菌株可以通过一次或多次诱变获得，如紫外线诱变育种，照射200nm-400nm，优选250nm-300nm，所得的突变菌株以埃博霉素C和D为主要产物而不产生埃博霉素A和B。

突变菌株用于发酵生产埃博霉素的出发菌株，得到的埃博霉素C和埃博霉素D，采用动态轴向压缩色谱分离。得到的埃博霉素D可用于半合成本发明标的物——伊沙匹隆。

合成步骤可以分三步进行，也可以将三步并成一步(三步一锅)。

本发明的新颖性在于：

1、纤维堆囊菌(以so ce90为例)，无论采取驯化或是UV和NTG诱变育种，只能有限地提高埃博霉素A和B的产量，而埃博霉素C和D产量极少。本发明的纤维堆囊菌采用epoK抑制剂，突变epoK基因产物-细胞色素P450氧化酶，使纤维堆囊菌中epoK失活，该突变菌株可以定向获得埃博霉素C和D，不产生埃博霉素A和B。

2、产生埃博霉素C和D的突变菌株再经UV诱变育种，获得只产生埃博霉素D的高产菌株，该菌株用于大规模发酵生产埃博霉素D。

3、用突变的新菌株发酵生产可同时得到两种埃博霉素产物，埃博霉素C和埃博霉素D，前者可用于半合成埃博霉素D内酰胺衍生物(另一种具有微管解聚抑制剂)，后者可以半合成伊沙匹隆。一举两得。

4、以分离的到的埃博霉素D以起始材料，经两步即可合成得到伊沙匹隆，合成路线短，产率高(≥32％)。适合放大生产。

附图说明

图1为埃博霉素生物合成路线

图2为由YM-3880经epoK抑制剂处理得到的突变菌株发酵产生的埃博霉素C和D

图3为突变菌株经UV诱变处理得到的高产菌株产生埃博霉素D

图4为伊沙匹隆半合成路线。

具体实施方式

实施例1

基因突变和定向筛选，得到一个含有失活epoK基因的纤维堆囊菌突变菌株。

出发菌株为粘细菌菌株中的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)YM-3880，是由阎家麒教授提供。

上述菌株接种在固体培养基上，斜面固体培养基成分为：大豆蛋白胨8g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物10g/L，无水葡萄糖5g/L，CaCl₂·H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，Fe-EDTA8mg/L，琼脂粉15g/L。30℃培养5d后，接种至液体发酵培养基。液体发酵培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，酵母提取物4g/L，无水葡萄糖15g/L，CaCl₂·H₂O1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，Fe-EDTA 8mg/L，树脂XAD-1620ml/L。30℃，120转/分，摇床培养4d。加入epoK抑制剂Mytyrapone使终浓度为5mM至10mM。30℃，120转/分，摇床继续培养7d。

检测培养物中产生的埃博霉素C和埃博霉素D：

取培养物50ml，用尼龙筛(孔隙150μm)过滤，用少量水冲洗保留在尼龙筛上的树脂，然后与滤膜一起置于50ml离心管中，加入异丙醇10ml，密封。以180转/分摇动1h，然后离心分离1.5ml液体，将约0.8ml上清液用移液管转移到HPLC试管中。依据样品的HPLC分析结果决定哪一个培养物中含有最高量埃博霉素C和D，在上述相应菌落的部分平皿上用塑料杯将1cm²琼脂区域的细胞转移到10ml G52培养基(马铃薯淀粉8g/L，葡萄糖2g/L，脱脂大豆粉2g/L，酵母浸膏2g/L，Na-FeIII-EDTA 8mg/L，CaCl₂·H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，HEPES11.5g/L，用KOH调节pH7.4)中，在30℃，180转/分条件下培养7d。将培养物5ml转移到250ml锥形烧瓶中的50ml G52培养基中，在30℃，180转/分培养3d。第一次基因突变获得了缺失epoK基因的突变菌株，该菌株只产生埃博霉素C和D。进一步的筛选和UV诱变，即获得埃博霉素D突变高产菌株。

埃博霉素D突变高产菌株的UV诱变：

上述获得的缺失epoK基因的突变菌株经斜面培养基培养后，将孢子用生理盐水清洗，加入到富培养基(马铃薯淀粉20g/L，无水葡萄糖15g/L，黄豆粉10g/L，酵母提取物4g/L，金属离子等)中，培养5h后，使孢子萌发，离心，并洗涤孢子。转移至带玻璃珠的三角烧瓶中，剧烈震荡15min后，以玻璃棉过滤获得单孢子悬液。调整孢子浓度至10⁶个/ml。取10ml液体于带磁棒的培养皿内，进行紫外诱变，使用15W紫外灯管，提前预热20min后，距离培养皿约20cm进行照射(250-300nm)，分别照射时间为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15min。不同时间照射完成后，从培养皿中取出1ml培养液，放入含有VII号培养基(马铃薯淀粉13g/L，无水葡萄糖4g/L，黄豆粉4g/L，酵母提取物2g/L，金属离子等)的试管中，用黑布包严，避光摇床培养10h，32℃，150转/分。10h后取出试管，每管取20μl菌液用无菌水稀释至2ml，取20μl稀释后菌液涂布平板。固体培养基成分为VII号培养基中加入1％琼脂。培养3d后，挑单菌落，转入VII号液体培养基中培养6d，收获。使用乙酸乙酯萃取发酵液，旋转蒸发至干，少量甲醇溶解后，经HPLC分析产物。结果表明，该高产菌株只产生埃博霉素D，产率8-11mg/L，而埃博霉素C、A和B仅为痕迹量。

实施例2

突变高产菌株发酵生产埃博霉素D

连续种子培养：从液氮中取出的1ml冷冻突变高产菌种接种到10ml的G52培养基中，并在30℃，180转/分，25mm位移条件下培养3d。将5ml种子培养物加入到45ml的G52培养基中生长3d。然后将此50ml的培养物加入到450ml的G52中生长3d。以后每3-4d，以10％接种量将50ml种子培养物接种到450ml的G52培养基中，以进行连续的种子培养。

20L中间种子培养：在30L发酵罐中装18LG52培养基，接种前种子培养液2L，30℃，250转/分，0.5L空气/L/min，过压为0.5bars条件下培养3d培养3-4d，加入10ml硅树脂消泡剂，防止泡沫形成。

250L发酵培养：

1B12培养基(马铃薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，Swizerland)2％，脱脂大豆粉Soyamine50T(Lucas Meyer，Hanburg，Germany)1.1％，EDTAiFe(III)-Na盐(8g/L)1ml，用KOH调节pH为7.8)150L装入250L发酵罐，加入2％XAD-16后进行灭菌，接种15L中间种子培养物。在30℃、200转/min、0.5L空气/L/min，过压为0.5bars用硫酸控制pH值7.6±0.5条件下发酵培养6-7d。

产品分析：取样50ml，用150μm孔径的尼龙筛滤得树脂，弃滤液。用去离子水洗涤树脂2-3次。加入10ml甲醇摇动30min，取2ml离心后的上清液用于HPLC分析。样品注射通过4.6×10mm的保护柱中，然后以从35％到100％乙腈的的梯度，以1ml/min的流速，在UV250nm下10min内通过一个长分离柱(4.6×150mm，Inertsil，ODS-3，5μm)。埃博霉素D(峰面积最大)在9.9min时洗脱出来，埃博霉素C在9.1min洗脱出来，而埃博霉素A和B分别在6.5min和7.3min洗脱出来，峰面积很小。

从250L发酵培养物中分离代谢产物：过滤收集XAD-16，水洗涤后，用甲醇洗脱，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯抽提余下的水相，减压蒸干，然后均溶于甲醇中，滤除不溶物，将溶液上Sephdex LH20柱，甲醇洗脱，将含目的物的馏分浓缩至干并再次溶于甲醇中，上动态轴向压缩色谱(C18反向硅胶，10-20μm)，柱床预先用3体积50％甲醇平衡，上样后依次用50％、55％、60％、65％甲醇洗脱。馏分用UV检测仪250nm检测。目的馏份减压至干，在丙酮中重悬浮固体，滤去不溶物，丙酮滤液中加入活性炭搅拌脱色1-2h，过滤，滤液减压至干。然后，在搅拌下用甲醇重悬浮干燥物，并缓慢加入水(于66％时达到饱和)。必要时加入少量晶种促进结晶形成。

实施例3

以埃博霉素D为起始材料合成伊沙匹隆

在纯氮保护下，500ml反应瓶中加入埃博霉素D 250mg(1.0eq)、脱气THF 10ml，室温下搅拌10min。反应混合物冷却至0℃，加入氯化烯丙基钯(II)二聚物(0.1eq)和4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(0.1eq)。然后在15min内加入溶于脱气THF的乙酰肼0.15eq。反应混合物在室温下搅拌3h，TLC检测反应完全，反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤，再用盐水洗涤，减压蒸出溶剂。无需纯化即可进入下一步反应。

取上步产物100mg(1.0eq)溶于干燥、脱气的DMF 80ml，氮气保护下冷却至0℃，依次加入碳酸氢钠7.7eq和DPPA 4.0eq，0℃下继续搅拌24h。反应混合物用预冷的磷酸盐缓冲液稀释，用乙酸乙酯萃取，然后用预冷的10％LiCl水溶液洗涤有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到内酰胺埃博霉素D。

在250ml反应瓶中加入去离子水10ml、丙酮10ml和碳酸氢钠2.5g。反应混合物在24℃水浴下剧烈搅拌15min，在减压(ca.50～100mmHg)下，间隔10～15mon分3批加入过一硫酸氢钾复合盐1.67g，在每一次加入过一硫酸氢钾复合盐之后，蒸馏除去DMDO得到一种丙酮溶液。在氮气保护下，在-78℃下，将DMDO 10ml缓慢地通过导管转入内酰胺埃博霉素D 61mg溶于干燥DCM 2ml的溶液内，然后升温至-50℃，搅拌1.5min，TLC检测反应完全，在-50℃下加入二甲基硫醚0.1ml除去过量的DMDO，然后反应混合物升至室温，减压浓缩，得到的残留物经快速硅胶色谱纯化(EtOAc/n-heptane＝2∶1)，得到内酰胺埃博霉素B(伊沙匹隆)27mg，产率42.8％，一种无色油状物。

Claims (4)

1.一种运用半合成技术制备伊沙匹隆的方法，其特征在于：首先采用粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)生物合成埃博霉素C和D，然后以埃博霉素D为原料合成伊沙匹隆。

2.根据权利要求1所述的一种半合成制备伊沙匹隆的方法，其特征在于，所述的粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)为YM-3880，该菌种首先经基因突变，使epoK基因失活，致使在生物合成过程中阻止埃博霉素C和D的环氧化，即不再进一步产生埃博霉素A和B，产物只有埃博霉素C和D。

3.根据权利要求2，其特征在于突变菌株再经UV诱变育种，得到埃博霉素D的高产菌株，用以发酵产生单一的埃博霉素D。

4.根据权利要求1，其特征在于半合成伊沙匹隆的起始材料为埃博霉素D，埃博霉素D经环氧化、开环、氮化反应，得到伊沙匹隆。