CN102491946A - 分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，包括以下步骤：1)将千层塔粉碎超声逆流萃取，所得的提取液减压浓缩后加入活性炭进行脱色处理；2)脱色处理后的提取液上固相柱，固相柱内装有作为固定相的石杉碱甲分子烙印聚合物，先用5～10％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗，再用40～50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗至淋洗液无色；拆柱将柱中的固定相取出，用60～70％乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体，得抽提液；3)将抽提液减压浓缩，再用溶剂重结晶，得石杉碱甲。采用该方法制备石杉碱甲具有安全、操作简便、成本低、生产周期短、纯度高等特点。

Description

分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法

技术领域

本发明涉及一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法。

背景技术

石杉碱甲(Huperzine A，简称Hup A)，又名福定碱，是从石杉科石杉属蛇足杉(千层塔)中分离得到的一种天然生物碱，属强效的可逆性乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，对早老性痴呆症、单纯记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效，且药效持续时间较长，无严重不良反应，是目前国内外上述病症最有效的药物，深受关注。由于它的治疗指数高，且作用时间长，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。但Hup A在自然界中存在量极低，且含有大量杂质，分离纯化困难。

目前现有一些有关制备石杉碱甲的专利文献如下：

1、《一种从千层塔中提取分离石杉碱甲的方法》(中国专利，CN101134743A)用有机溶剂提取，调酸；依次经阳离子交换树脂色谱分离和硅胶色谱分离，结晶，得纯度达98％的石杉碱甲。

2、《从中草药千层塔中提取石杉碱甲的方法》(中国专利，CN1448390A)应用以下工艺步骤制备石杉碱甲：原料粉碎→浸渍→浓缩→萃取(反复)→柱层析→结晶→高效液相色谱选段→浓缩干燥→成品，纯度98％以上。

3、《一种石杉碱甲的制备方法》(中国专利，CN101602727A)采用千层塔为原料，经以下步骤：原料粉碎→酸液超声提取→阴离子交换树脂除杂→氯仿萃取→减压回收→大孔吸附树脂分离→乙醇水洗脱→减压回收→结晶→干燥，得到石杉碱甲成品，纯度95％。

4、《一种石杉碱甲的提纯方法》(中国专利，CN10880259A)采用以下步骤：原料粉碎→酸水加热提取→膜过滤除杂浓缩→氨化氯仿萃取浓缩→中压氧化铝柱层析→氯仿甲醇重结晶→干燥，得成品，纯度98％。

5、《一种泡沫分离法分离千层塔中石杉碱甲的方法》(中国专利，CN101747275A)所述方法为：千层塔浸膏溶于乙醇，然后和阴离子表面活性剂加入泡沫分离塔内，搅拌均匀后从塔底连续鼓入空气，形成泡沫，收集泡沫直至无泡沫产生，得到的泡沫由塔顶排出泡沫液，搅拌反应，过滤取滤饼得石杉碱甲粗品，用重结晶的溶剂进行重结晶，干燥得石杉碱甲成品，纯度65％左右。

6、《一种高纯度石杉碱甲的制备方法》(中国专利，CN1587260A)用正构烷烃-脂肪醇-水作为溶剂体系，用高速逆流色谱法从石杉植物千层塔中分离高纯度石杉碱甲，纯度99％。

7、《一种从千层塔中提取分离高纯度石杉碱甲的新方法》(中国专利，CN101693689A)采用原料粉碎浸泡→大孔吸附树脂预分离→高速逆流色谱纯化，最后获得纯度98％以上的石杉碱甲。

上述各种方法，中国专利CN101134743A、中国专利CN101602727A、中国专利CN10880259A虽然分离出的石杉碱甲纯度较高，但工艺复杂、有机溶剂用量多、耗时长、成本高，不适合工业化生产；中国专利CN101747275A分离出的石杉碱甲纯度较低；中国专利CN1448390A、中国专利CN1587260A、中国专利CN101693689A分别采用高效液相色谱法和高速逆流色谱法分离石杉碱甲，得到产品纯度较高，但生产量小，设备昂贵，大多局限于实验室应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，采用该方法制备石杉碱甲具有安全、操作简便、成本低、生产周期短、纯度高等特点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，包括以下步骤：

1)、将千层塔粉碎后投入超声逆流萃取器中，加入质量浓度为0.5～1.2％酒石酸水溶液，超声逆流萃取30～50分钟；千层塔与酒石酸水溶液的料液比为：1kg千层塔/5～10L的酒石酸水溶液；

所得的提取液减压浓缩至1/3～1/10体积，得浓缩提取液；在浓缩提取液中加入活性炭进行脱色处理，得脱色处理后提取液；

2)、将脱色处理后提取液上固相柱，固相柱内装有作为固定相的石杉碱甲分子烙印聚合物，先用体积浓度为5～10％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗，淋洗液弃去；再用体积浓度为40～50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗至淋洗液无色，淋洗液弃去；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为60～70％乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体，得抽提液；

所述石杉碱甲分子烙印聚合物中的石杉碱甲与千层塔中的石杉碱甲的摩尔比为1～1.1∶1；

3)、将上述抽提液减压浓缩，再用溶剂重结晶，得石杉碱甲。

作为本发明的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法的改进：步骤2)中的石杉碱甲分子烙印聚合物的制备方法为：

在作为溶剂的致孔剂中，将作为模板分子的石杉碱甲、功能单体、交联剂和引发剂混合均匀后进行聚合反应，得到聚合物；石杉碱甲、功能单体、交联剂和引发剂的质量比为：1∶10～20∶15～25∶0.02～0.08；聚合反应的温度为50～80℃，反应时间为4～15小时；

聚合物先研磨成粉体，再用溶剂抽提掉粉体状聚合物中残余的石杉碱甲，得到石杉碱甲分子烙印聚合物(MIPs)。

作为本发明的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法的进一步改进：

致孔剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲苯、二氯甲烷或氯仿；

功能单体为甲基丙烯酸、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物或丙烯酰胺；

交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或乙烯基衍生物；

引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。

作为本发明的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法的进一步改进：步骤1)中的脱色处理为：先调节浓缩提取液为pH1～2，然后加入活性炭脱色5～15分钟；活性炭与千层塔的质量比为5～10％。

作为本发明的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法的进一步改进：步骤3)中的用于重结晶的溶剂为乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷或甲醇。

在本发明的步骤1)的脱色处理中，用质量浓度为0.5～2％的盐酸溶液调节pH。

步骤1)的超声逆流提取法是：药材(即千层塔)与溶剂(即质量浓度为0.5～1.2％酒石酸水溶液)在浸出容器中沿相反方向运动，连续而充分地进行接触提取的一种方法。设备采用高效连续动态超声逆流提取机，其提取原理是：通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固--液萃取分离。超声逆流提取设备是动态提取、逆流提取、煎煮提取工艺的结合，在保留多种传统工艺优点的同时，创造了这些传统工艺所无法达到的诸多优点：安全性好，操作简单易行，维护保养方便，提取效率高，具有广谱性，减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低，萃取时间短，因此大大降低能耗。药材原料处理量大，能成倍或数倍提高处理量，且杂质少，有效成分易于分离和净化。

在本发明的步骤2)的石杉碱甲分子烙印聚合物的制备方法中，作为溶剂的致孔剂的用量只需保证石杉碱甲、功能单体、交联剂和引发剂能被溶解即可。

分子烙印技术，也称分子印迹技术(MIT)，其应用前提是能制备出具有分子识别能力的聚合物-分子烙印聚合物(MIPs)。MPs的制备过程大致为：①将模板分子和功能单体按照一定比例混合后在一定条件下反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物；②将加入交联剂等，使之与前面的模板-功能单体复合物通过聚合反应形成多孔性的高聚物；③将模板分子从高聚物种抽提出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预定”选择性的分子识别位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形状、大小完全一样，从而实现对模板分子的特异性识别。

本发明采用了超声逆流萃取，缩短了提取时间和增加了提取收率，又采用了分子烙印技术进行分离纯化，具有制备简单，成本低廉，环保，产品收率高、纯度高，稳定性好可重复使用。

采用本发明方法制备的石杉碱甲，其纯度可高达99％，收率可高达90％。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1、一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，依次进行以下步骤：

1)、制备石杉碱甲的分子烙印聚合物

量取10ml的氯仿于25ml试管中，将0.60g质量含量为98％的石杉碱甲(模板分子)，12.05g乙二醇二甲基丙烯酸酯(交联剂)，10.06g甲基丙烯酸(功能单体)，0.03g偶氮二异丁腈(引发剂)依次加入到上述试管中，密封，超声(40KHz频率的超声波)溶解20min。将混合均匀的聚合溶液充氮气10min。将试管放入65℃的水浴中，加热聚合4h，聚合后将温度升高到68℃，继续加热2h，使聚合完全。

将得到的本体聚合物取出，研磨至能过400目，用400目不锈钢筛湿法在水中筛分，抽滤，将得到的粒径小于400目的石杉碱甲分子烙印聚合物烘干(至恒重)，用乙醇于索氏提取器中抽提上述粉末状的石杉碱甲分子烙印聚合物中残余的石杉碱甲，直到提取液中检测不到石杉碱甲为止，然后将分子烙印粉末烘干，得石杉碱甲分子烙印聚合物21.0g，备用。

经HPLC法检测，该石杉碱甲分子烙印聚合物中石杉碱甲的质量浓度为2.69％，即，含有0.58克的石杉碱甲，即，0.00239mol的石杉碱甲。

2)、取粉碎好的千层塔药材2kg(粉碎后药材全部通过40目的筛)，投入超声逆流萃取器中，加入15L的质量浓度1％的酒石酸水溶液，超声(40KHZ频率的超声波)逆流提取50分钟。

经HPLC法检测，该千层塔中石杉碱甲的含量为0.26mg/g，即2kg千层塔中含有0.52g(即0.00215mol)的石杉碱甲。

3)、将步骤2)所得的提取液减压浓缩至约2500ml，得浓缩提取液；先将浓缩提取液用1％(质量浓度)的盐酸溶液调节pH为2；再加入100g活性碳搅拌脱色10分钟，过滤后，所得滤液为脱色处理后提取液；

4)、在固相柱中装入制备好的21.0克石杉碱甲分子烙印聚合物作为固定相，将步骤3)所得的全部脱色处理后提取液上该固相柱；先用体积浓度为10％的乙醇水溶液100ml进行淋洗，淋洗液弃去；再用体积浓度为40％的乙醇溶液(约150ml)进行淋洗至淋洗液无色，淋洗液弃去；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为70％乙醇水溶液200ml抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体；得抽提液；

5)、将步骤4)所得的抽提液减压浓缩至回收器无液体流出，得浓缩物；

用2倍体积量(相对于浓缩物而言)的氯仿回流溶解，加入3倍体积量(相对于浓缩物而言)的甲醇，于4℃冷藏结晶，滤出晶体，得晶体0.49g，经HPLC检测石杉碱甲的含量989.1mg/g，纯度99.0％，总收率为93.2％。

实施例2、一种分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，依次进行以下步骤：

1)、制备石杉碱甲的分子烙印聚合物：

量取30ml的丙酮于100ml烧瓶中，将1.0g质量含量为98％石杉碱甲，21.0g季戊四醇三丙烯酸酯，14.56g 4-乙烯苯基硼酸(亦名：4-乙烯基苯硼酸)，0.05g偶氮二异丁腈依次加入到烧瓶中，密封，超声(40KHz频率的超声波)溶解30min。将混合均匀的聚合溶液充氮，65℃的水浴中加热聚合12h，使聚合完全。

将得到的本体聚合物取出，研磨至能过200目，用200目不锈钢筛湿法在水中筛分，抽滤，将得到的粒径小于200目的石杉碱甲分子烙印聚合物烘干，用乙醇于索氏提取器中抽提述粉末状的石杉碱甲分子烙印聚合物中残余的石杉碱甲，直到提取液中检测不到石杉碱甲为止，然后将分子烙印粉末烘干，得石杉碱甲分子烙印聚合物34.0g，备用。

经HPLC法检测，该石杉碱甲分子烙印聚合物中石杉碱甲的质量浓度为2.77％，即，含有0.97克的石杉碱甲，即，0.00401mol的石杉碱甲。

2)、取粉碎好的千层塔药材5kg(能过40目的筛)，投入超声逆流萃取器中，加入40L的质量浓度0.5％的酒石酸水溶液，超声(40KHZ频率的超声波)逆流萃取80分钟。

经HPLC法检测，该千层塔中石杉碱甲的含量为0.18mg/g，即5kg千层塔中含有0.90g(即0.00372mol)的石杉碱甲。

3)、将步骤2)所得的提取液减压浓缩至约5500ml，得浓缩提取液；先将浓缩提取液用1％(质量浓度)的盐酸溶液调节pH为2；再加入200g活性碳搅拌脱色20分钟，过滤后，所得滤液为脱色处理后提取液；

4)、在固相柱中装入制备好的34.0g石杉碱甲分子烙印聚合物作为固定相，将步骤3)所得的全部脱色处理后提取液上该固相柱；先用体积浓度为10％的甲醇水溶液170ml进行淋洗，淋洗液弃去；再用体积浓度为40％的甲醇溶液(约220ml)进行淋洗至淋洗液无色，淋洗液弃去；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为70％甲醇水溶液350ml抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体；得抽提液；

5)、将步骤4)所得的抽提液减压浓缩至回收器无液体流出，得浓缩物；

用3倍体积量(相对于浓缩物而言)的丙酮加热至回流溶解，室温放置12小时，自然冷却结晶，得晶体0.845g，经HPLC检测石杉碱甲的含量990.7mg/g，纯度99.2％，收率93.0％。

对比例1、将实施例1步骤1)的作为功能单体的10.06g甲基丙烯酸改成10.06g 4-乙烯基咪唑，其余同实施例1的步骤1)，得石杉碱甲分子烙印聚合物17.6g。

经HPLC法检测，该石杉碱甲分子烙印聚合物中石杉碱甲的质量浓度仅为0.2％，即含有0.035克的石杉碱甲，即0.00014mol的石杉碱甲。

2)、取粉碎好的千层塔药材1kg(粉碎后药材全部通过40目的筛)，投入超声逆流萃取器中，加入7.5L的质量浓度1％的酒石酸水溶液，超声(40KHZ频率的超声波)逆流提取50分钟。

经HPLC法检测，该千层塔中石杉碱甲的含量为0.18mg/g，即1kg千层塔中含有0.18g(即0.00074mol)的石杉碱甲。

3)、将步骤2)所得的提取液减压浓缩至约1000ml，得浓缩提取液；先将浓缩提取液用1％(质量浓度)的盐酸溶液调节pH为2；再加入50g活性碳搅拌脱色10分钟，过滤后，所得滤液为脱色处理后提取液；

4)、在固相柱中装入制备好的17.6克石杉碱甲分子烙印聚合物作为固定相，将步骤3)所得的全部脱色处理后提取液上该固相柱；收集流出液；再用体积浓度为10％的乙醇水溶液120ml进行淋洗，收集淋洗液1；再用体积浓度为40％的乙醇溶液60ml进行淋洗，收集淋洗液2；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为70％乙醇水溶液200ml抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体；得抽提液。

5)、经HPLC检测，流出液中含有石杉碱甲0.17g，淋洗液1中含有石杉碱甲0.009g，淋洗液1中含有石杉碱甲0.001g，抽提液中未检测到石杉碱甲。

对比例2、将实施例1步骤1)的作为功能单体的甲基丙烯酸的用量由10.06g改成7.25g，其余同实施例1的步骤1)，得石杉碱甲分子烙印聚合物16.7g，备用。

经HPLC法检测，该石杉碱甲分子烙印聚合物中石杉碱甲的质量浓度为2.50％，即，含有0.418克的石杉碱甲，即，0.00173mol的石杉碱甲。

2)、取粉碎好的千层塔药材2.5kg(粉碎后药材全部通过40目的筛)，投入超声逆流萃取器中，加入25L的质量浓度1％的酒石酸水溶液，超声(40KHZ频率的超声波)逆流提取50分钟。

经HPLC法检测，该千层塔中石杉碱甲的含量为0.18mg/g，即2.5kg千层塔中含有0.45g(即0.00186mol)的石杉碱甲。

3)、将步骤2)所得的提取液减压浓缩至约2000ml，得浓缩提取液；先将浓缩提取液用1％(质量浓度)的盐酸溶液调节pH为2；再加入125g活性碳搅拌脱色10分钟，过滤后，所得滤液为脱色处理后提取液；

4)、在固相柱中装入制备好的16.7g石杉碱甲的分子烙印聚合物作为固定相，将步骤3)所得的全部脱色处理后提取液上该固相柱；先用体积浓度为10％的乙醇水溶液100ml进行淋洗，淋洗液弃去；再用体积浓度为40％的乙醇溶液150ml进行淋洗至淋洗液无色，淋洗液弃去；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为70％乙醇水溶液250ml抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体；得抽提液；

5)、将步骤4)所得的抽提液减压浓缩至回收器无液体流出，得浓缩物；

用2倍体积量(相对于浓缩物而言)的氯仿回流溶解，加入3倍体积量(相对于浓缩物而言)的甲醇，于4℃冷藏结晶，滤出晶体，得晶体0.42g，经HPLC检测石杉碱甲的含量955.0mg/g，纯度97.0％，总收率较低。

对比例3、

步骤1)、2)、4)、5)同实施例1，

步骤3)中，将所得浓缩提取液直接加入100g活性碳搅拌脱色10分钟(即，取消用盐酸溶液调节pH为2)，其余同步骤3)。

最终得晶体0.500g，经HPLC检测石杉碱甲的含量880.0mg/g，纯度88.1％，收率84.6％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将千层塔粉碎后投入超声逆流萃取器中，加入质量浓度为0.5～1.2％酒石酸水溶液，超声逆流萃取30～50分钟；所述千层塔与酒石酸水溶液的料液比为：1kg千层塔/5～10L的酒石酸水溶液；

所得的提取液减压浓缩至1/3～1/10体积，得浓缩提取液；在浓缩提取液中加入活性炭进行脱色处理，得脱色处理后提取液；

2)、将所述脱色处理后提取液上固相柱，所述固相柱内装有作为固定相的石杉碱甲分子烙印聚合物，先用体积浓度为5～10％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗，淋洗液弃去；再用体积浓度为40～50％的乙醇水溶液或甲醇水溶液进行淋洗至淋洗液无色，淋洗液弃去；拆柱将柱中的固定相取出，用体积浓度为60～70％乙醇水溶液或甲醇水溶液抽提固定相中被吸附的石杉碱甲单体，得抽提液；

所述石杉碱甲分子烙印聚合物中的石杉碱甲与千层塔中的石杉碱甲的摩尔比为1～1.1∶1；

3)、将上述抽提液减压浓缩，再用溶剂重结晶，得石杉碱甲。

2.根据权利要求1所述的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，其特征是：所述步骤2)中的石杉碱甲分子烙印聚合物的制备方法为：

在作为溶剂的致孔剂中，将作为模板分子的石杉碱甲、功能单体、交联剂和引发剂混合均匀后进行聚合反应，得到聚合物；所述石杉碱甲、功能单体、交联剂和引发剂的质量比为：1∶10～20∶15～25∶0.02～0.08；所述聚合反应的温度为50～80℃，反应时间为4～15小时；

所述聚合物先研磨成粉体，再用溶剂抽提掉粉体状聚合物中残余的石杉碱甲，得到石杉碱甲分子烙印聚合物。

3.根据权利要求2所述的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，其特征是：

所述致孔剂为四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲苯、二氯甲烷或氯仿；

所述功能单体为甲基丙烯酸、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物或丙烯酰胺；

所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或乙烯基衍生物；

所述引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。

4.根据权利要求1、2或3所述的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，其特征是所述步骤1)中的脱色处理为：

先调节浓缩提取液为pH1～2，然后加入活性炭脱色5～15分钟；所述活性炭与千层塔的质量比为5～10％。

5.根据权利要求4所述的分子烙印技术分离纯化石杉碱甲的方法，其特征是所述步骤3)中的用于重结晶的溶剂为乙醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷或甲醇。