CN103724656B - 一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，属于分子印迹技术领域，包括以下步骤：1）将埃博霉素B与埃博霉素D按照混匀后，得到模板分子，向模板分子中加入功能单体和交联剂，混匀形成混合物；将该混合物加入致孔剂中，在超声条件下混匀后，在室温下静置，然后加入引发剂，混匀得到混合液；2）将混合液于40～60℃下聚合反应，得到块状聚合物，然后经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降数次，干燥，得到聚合物粒子，将聚合物粒子索式萃取数次后干燥，得到埃博霉素分子印迹聚合物。本发明制备的埃博霉素分子印迹聚合物对埃博霉素具有更高的亲和力，吸附效果更好，具有广阔的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明属于分子印迹技术领域，具体涉及一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法。
背景技术
埃博霉素(epothilone)是由粘细菌纤维堆囊菌（Sorangiumcellulosum）产生的一类大环内酯类化合物，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，其组分可以分为EpothiloneA、B、C、D等。研究表明它不仅与紫彬醇具有相同的稳定微管活性，而且具有比紫彬醇更好的水溶性，是目前抗肿瘤药物的一个研究热点。
目前埃博霉素的生产还存在很多缺陷：一方面是在发酵过程中，埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大程度导致埃博霉素发酵产量很难提高，这方面的困难虽然已经依靠在发酵液中添加大孔吸附树脂XAD-16得到一定的缓减，但树脂对发酵液中营养物质的非特异性吸附为埃博霉素的产量提高又带来许多新的困难；另一方面是其分离提取过程步骤十分繁琐，分离效率低，使用有机溶剂较多，选择性低和成本较高。因此开发能特异性吸附埃博霉素类化合物的吸附剂用于它的发酵生产和分离提取中将极大降低埃博霉素药物的生产成本，这将尤为重要。
分子印迹技术是为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(通常称为模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。它的制备过程是先用功能单体和模板分子以共价键或非共价键的形式形成复合物，再加入交联剂，引发剂和有机溶剂，在一定的条件下聚合，使之生成聚合物，最后通过洗脱的方法，将模板分子从聚合物中除去，这样就在聚合物上留下了和模板分子在空间结构，结合点位完全匹配的三维空穴，这些孔穴对模板分子呈现预定的选择性和高度的识别性。分子印迹聚合物（MIP）对待定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的作用，可将目标分子从混合溶液中分离出来，并且具有抗恶劣环境，高度的选择性、稳定性和长的使用寿命等优点。
将分子印迹技术应用到埃博霉素的发酵生产以及分离提取中，可以降低生产成本，简化分离提取步骤，具有重大的意义。但是目前国内外学者发表的有关埃博霉素分子印迹聚合物的文章较少，而且大多数都是采用单一模板分子，这样合成的聚合物没有高的亲和力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，采用该方法制备得到的分子印迹聚合物对埃博霉素具有更高的亲和力，吸附效果更好。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将埃博霉素B与埃博霉素D按照摩尔比（0.5～2）:（1～2）混匀后，得到模板分子，向模板分子中加入功能单体，得到配合物，再向配合物中加入交联剂，混匀形成混合物；将该混合物加入致孔剂中，在超声条件下混匀后，在室温下静置1～3h，然后加入引发剂，充分混匀，得到混合液；
其中，所述的功能单体为单体丙烯酸、甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯；
所述的混合物中模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1:（2～6）:（10～30）；
所述致孔剂的用量为15～20mL/1mmol模板分子，引发剂的用量为10～15mg/1mmol模板分子；
2）在氮气保护的条件下，将混合液于40～60℃下，聚合反应20～40h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降数次，然后经干燥，得到聚合物粒子；
4）将聚合物粒子在乙酸:甲醇的体积比为（2～3）:（6～8）的混合液中，索式萃取数次，再用甲醇洗脱数次后，干燥，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
步骤1）所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
步骤1）所述的致孔剂为乙腈、氯仿、异丙醇或四氯化碳。
步骤1）所述的引发剂为偶氮二异丁腈。
步骤1）所述的超声处理是在超声频率为20000～60000Hz下，处理5～10min。
步骤2）所述的氮气保护是在混合液中通入5～10min的氮气后密封，通氮气的流速是2～3mL/min。
步骤3）所述用丙酮沉降的次数为2～4次；所述的干燥采用冷冻干燥。
步骤3）得到的聚合物粒子的粒径为30～50μm。
步骤4）所述的索氏萃取次数为3～5次，每次8～12小时；甲醇洗脱次数为1～2次。
步骤4）所述的干燥是在40～50℃下真空干燥过夜。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明以埃博霉素B与埃博霉素D的混合物作为模板分子，将其与功能单体在反应混合溶液中通过化学键或氢键结合形成配合物；然后加入合适的交联剂进行共聚形成聚合物，交联剂的加入保证了制备的聚合物具有一定的硬度和稳定的聚合位点，提高了其结合能力；最后洗去模板分子，得到具有与模板分子相匹配的埃博霉素分子印迹聚合物。其中采用热引发聚合制备分子印迹聚合物的方式，更有利于模板分子-功能单体复合物的稳定性，并且得到的聚合物具有一定层次孔径分布的特点，从而对埃博霉素分子有良好的选择性和识别特性；该法制备的埃博霉素分子印迹聚合物也可用于填充固相萃取柱，能快速高效地富集埃博霉素分子；此外，制备的埃博霉素分子印迹聚合物还可重复利用，将埃博霉素分子洗脱之后又可以重新进行埃博霉素的吸附，大大降低了实验成本。本发明的优点在于：制备过程简单，可操作性强，制备成本低廉；所得聚合物具有较高的选择性能，富集程度较高，因此，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将1.0mmol埃博霉素B与1.0mmol埃博霉素D混合，得到模板分子，向模板分子中加入4mmol功能单体丙烯酸（AA）使之形成主客体配合物，再加入20mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），将上述混合物溶解于40mL致孔剂乙腈中，在超声频率为60000Hz下，超声处理5min使其混合均匀，于室温下静置1h，然后加入20mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀得到混合液；
2）向混合液中按2mL/min的流速通入5min的N2后，迅速密封，于40℃水浴振荡器中反应40h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降3次，然后经冷冻干燥，得到粒径在30～50μm的聚合物粒子；
4）采用索氏萃取的方法，用100mL甲醇和乙酸的混合液对聚合物粒子进行洗脱，去除模板分子直到洗脱液中不含模板分子为止，混合液中乙酸：甲醇的体积比=2:8，索氏萃取的条件为萃取3次，每次8小时，最后用甲醇洗脱1次去除乙酸分子，然后于40℃真空干燥过夜，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
实施例2
采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将1.5mmol埃博霉素B与1.0mmol埃博霉素D混合，得到模板分子，向模板分子中加入5mmol功能单体甲基丙烯酸（MAA）使之形成主客体配合物，再加入25mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），将上述混合物溶解于50mL致孔剂乙腈中，在超声频率为30000Hz下，超声处理8min使其混合均匀，于室温下静置1h，然后加入25mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀得到混合液；
2）向混合液中按2mL/min的流速通入8min的N2后，迅速密封，于50℃水浴振荡器中反应30h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降3次，然后经冷冻干燥，得到粒径在30～50μm的聚合物粒子；
4）采用索氏萃取的方法，用100mL甲醇和乙酸的混合液对聚合物粒子进行洗脱，去除模板分子直到洗脱液中不含模板分子为止，混合液中乙酸：甲醇的体积比=2:8，索氏萃取的条件为萃取4次，每次8小时，最后用甲醇洗脱1次去除乙酸分子，然后于40℃真空干燥过夜，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
实施例3
采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将2.0mmol埃博霉素B与1.0mmol埃博霉素D混合，得到模板分子，向模板分子中加入6mmol功能单体甲基丙烯酸甲酯（MA）使之形成主客体配合物，再加入30mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），将上述混合物溶解于50mL致孔剂异丙醇中，在超声频率为30000Hz下，超声处理8min使其混合均匀，于室温下静置1h，然后加入36mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀得到混合液；
2）向混合液中按3mL/min的流速通入8min的N2后，迅速密封，于50℃水浴振荡器中反应30h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降4次，然后经冷冻干燥，得到粒径在30～50μm的聚合物粒子；
4）采用索氏萃取的方法，用100mL甲醇和乙酸的混合液对聚合物粒子进行洗脱，去除模板分子直到洗脱液中不含模板分子为止，混合液中乙酸：甲醇的体积比=3:6，索氏萃取的条件为萃取4次，每次10小时，最后用甲醇洗脱2次去除乙酸分子，然后于50℃真空干燥过夜，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
实施例4
采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将1.0mmol埃博霉素B与1.5mmol埃博霉素D混合，得到模板分子，向模板分子中加入10mmol功能单体甲基丙烯酸甲酯（MA）使之形成主客体配合物，再加入25mmol交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA），将上述混合物溶解于50mL致孔剂氯仿中，在超声频率为20000Hz下，超声处理10min使其混合均匀，于室温下静置2h，然后加入25mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀得到混合液；
2）向混合液中按3mL/min的流速通入10min的N2后，迅速密封，于55℃水浴振荡器中反应25h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降2次，然后经冷冻干燥，得到粒径在30～50μm的聚合物粒子；
4）采用索氏萃取的方法，用100mL甲醇和乙酸的混合液对聚合物粒子进行洗脱，去除模板分子直到洗脱液中不含模板分子为止，混合液中乙酸：甲醇的体积比=3:7，索氏萃取的条件为萃取5次，每次10小时，最后用甲醇洗脱2次去除乙酸分子，然后于45℃真空干燥过夜，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
实施例5
采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，包括以下步骤：
1）将1.0mmol埃博霉素B与2mmol埃博霉素D混合，得到模板分子，向模板分子中加入18mmol功能单体甲基丙烯酸甲酯（MA）使之形成主客体配合物，再加入90mmol交联剂三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM），将上述混合物溶解于45mL致孔剂四氯化碳中，在超声频率为20000Hz下，超声处理10min使其混合均匀，于室温下静置3h，然后加入45mg引发剂偶氮二异丁腈，混匀得到混合液；
2）向混合液中按2mL/min的流速通入10min的N2后，迅速密封，于60℃水浴振荡器中反应20h，得到块状聚合物；
3）将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降3次，然后经冷冻干燥，得到粒径在30～50μm的聚合物粒子；
4）采用索氏萃取的方法，用100mL甲醇和乙酸的混合液对聚合物粒子进行洗脱，去除模板分子直到洗脱液中不含模板分子为止，混合液中乙酸：甲醇的体积比=2:7，索氏萃取的条件为萃取5次，每次12小时，最后用甲醇洗脱2次去除乙酸分子，然后于50℃真空干燥过夜，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
Claims (6)
1.一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将埃博霉素B与埃博霉素D按照摩尔比(0.5～2):(1～2)混匀后，得到模板分子，向模板分子中加入功能单体，得到配合物，再向配合物中加入交联剂，混匀形成混合物；将该混合物加入致孔剂中，在超声频率为20000～60000Hz下，处理5～10min后，在室温下静置1～3h，然后加入引发剂，充分混匀，得到混合液；
其中，所述的功能单体为单体丙烯酸、甲基丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯；
所述的混合物中模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1:(2～6):(10～30)；
所述致孔剂的用量为15～20mL/1mmol模板分子，引发剂的用量为10～15mg/1mmol模板分子；
所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯或三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；
所述的致孔剂为乙腈、氯仿、异丙醇或四氯化碳；
所述的引发剂为偶氮二异丁腈；
2)在氮气保护的条件下，将混合液于40～60℃下，聚合反应20～40h，得到块状聚合物；
3)将块状聚合物经破碎、研磨、过筛后，用丙酮沉降数次，然后经干燥，得到聚合物粒子；
4)将聚合物粒子在乙酸:甲醇的体积比为(2～3):(6～8)的混合液中，索式萃取数次，再用甲醇洗脱数次后，干燥，得到埃博霉素分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，步骤2)所述的氮气保护是在混合液中通入5～10min的氮气后密封，通氮气的流速是2～3mL/min。
3.根据权利要求1所述的一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，步骤3)所述用丙酮沉降的次数为2～4次；所述的干燥采用冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，步骤3)得到的聚合物粒子的粒径为30～50μm。
5.根据权利要求1所述的一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，步骤4)所述的索氏萃取次数为3～5次，每次8～12小时；甲醇洗脱次数为1～2次。
6.根据权利要求1所述的一种采用混合模板制备埃博霉素分子印迹聚合物的方法，其特征在于，步骤4)所述的干燥是在40～50℃下真空干燥过夜。
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