CN102432753B - 一种埃博霉素b分子印迹聚合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种埃博霉素B分子印迹聚合物的制备方法，属于化学工程技术领域。具体制备方法为：将模版分子(埃博霉素B)、功能单体、交联剂、引发剂按照一定的摩尔比溶解到致孔剂中，致孔剂可以为甲醇和乙腈的混合液。反应结束后，将所得产物研磨，过筛，可以得到粒径大小约为40～60μm的粒子。将所得粒子乙酸∶甲醇(1∶9～3∶7(v∶v))混合溶液中进行充分洗涤，以脱除模版分子，冷冻干燥得到埃博霉素B分子印迹聚合物。本发明制备得到的埃博霉素B分子印迹聚合物可以特异性有选择性地吸附埃博霉素B，在液体发酵法生产埃博霉素B中具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物化学工程技术领域的一种制备方法，具体涉及的是一种埃博霉素B分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术
埃博霉素B(Epothilone B)是粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一种聚酮次级代谢产物，它与临床上广泛应用的抗肿瘤化疗药物紫杉醇(paclitaxel)具有相同的稳定微管活性，且对紫杉醇耐药的肿瘤细胞具有活性。
埃博霉素的发现可以追溯到上世纪八十年代德国国家生物技术研究中心(GBF)的微生物学家对土壤中粘细菌的大量研究工作。1987年他们在寻找抗真菌药物时发现了一株粘细菌(Sorangium cellulosum So ce90)能产生一类具有微弱抗真菌活性的大环内酯类化合物，命名为埃博霉素A和B。当时这个化合物并没有引起研究人员的重视。1995年默克实验室的研究人员发现了埃博霉素具有和紫杉醇类似的促微管聚合活性。从此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更简单的结构，对紫杉醇抗性肿瘤细胞的高活性以及可以通过微生物发酵制备而迅速成为继紫杉醇之后发现的促微管聚合化合物中最令人兴奋的研究热点。目前诺华、施贵宝、默克、罗氏等大型跨国制药公司都在埃博霉素药物的临床研究上投入了大量的人力物力，施贵宝公司已有一个埃博霉素产品(Ixabepilone，商品名Ixempra，“伊沙匹隆”)上市，预期不久将有更多品种埃博霉素药物上市。
目前埃博霉素生产成本很高，其中有两个重要原因。第一是埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大程度导致埃博霉素发酵产量很难提高，这方面的困难虽然已经依靠在发酵液中添加大孔吸附树脂XAD-16得到一定的缓减，但树脂对发酵液中营养物质的非特异性吸附为埃博霉素的产量提高又带来许多新的困难。第二个导致埃博霉素生产成本高的原因是发酵结束后产物中存在大量埃博霉素同系物，导致目标产物(例如：埃博霉素B)分离纯化成本非常高。因此开发能特异性吸附特定埃博霉素类化合物的吸附剂用于它的发酵生产和分离提取中将极大降低埃博霉素药物的生产成本。
分子印迹聚合物就是一种对特定分子具有专一识别性能的高分子材料，目前国内外还未见关于埃博霉素分子印迹聚合物的研究报道。分子印迹技术(Molecularly imprinted technology，MIT)是受人们对抗原-抗体、酶-底物专一性识别的启发而产生的。20世纪40年代，诺贝尔奖获得者Pauling提出了以抗原为模板来合成抗体的设想，并试图用锁-匙理论来解释免疫体系[14]。尽管这一设想被后来的实的，但却是对分子印迹技术最初的描述，并且其中两点正确的假设为分子印迹技术的建立奠定了基础：假定生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合位点；假定生物体所释放的物质与外来物质在空间上相互匹配。本专利公布了一种埃博霉素B特异性吸附剂的制备技术，本发明可为埃博霉素药物的生产成本降低奠定基础。
发明内容
本发明提供了一种埃博霉素B分子印迹聚合物的制备方法。该聚合物可以选择性地从发酵液中吸附埃博霉素B，从而实现埃博霉素B的分离纯化，降低使用现有吸附剂的生产成本，提高专一性选择吸附能力。该分子印迹聚合物可以用于液体发酵生产埃博霉素B，在发酵液中直接起到分离纯化埃博霉素B的作用，也可以用于从发酵液中分离提取埃博霉素B和痕量埃博霉素B的检测。
本发明中埃博霉素B分子印迹聚合物是通过以下的技术方案实现的，包括具体步骤如下：
(1)将模版分子埃博霉素B，功能单体，交联剂按照摩尔比1∶4∶20混合均匀，溶解于5ml体积比为4∶1的乙腈和甲醇溶液中，搅拌均匀，加入引发剂偶氮二异丁氰5.0mg；
(2)通氮排氧20～30min，氮气保护条件下封管，45℃水浴中聚合12-16小时，再在60℃水浴中聚合12-16小时得到反应产物；
(3)将得到的产物聚合物破碎、研磨、过筛得到粒径40～60μm的聚合物颗粒；
(4)将聚合物颗粒于体积比1∶9～3∶7乙酸和甲醇混合溶液中索氏萃取数次去除模板分子，冷冻干燥至恒重，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。
所制备的埃博霉素B分子印迹聚合物为具有多孔结构形态的疏松聚合物；
去除模版分子埃博霉素B的方法为索氏萃取法。
索氏萃取5次以上，每次萃取时间为6～8小时，最后需用甲醇再次萃取2次以上。
本发明制备的埃博霉素B分子印迹聚合物具有疏松的表面结构，可以增加分子印迹聚合物对模版分子埃博霉素B的特异性吸附。通过实验测得该分子印迹聚合物对埃博霉素B的平衡吸附时间为10h，平衡吸附量为40～60mg/g。制备的埃博霉素B分子印迹聚合物可以作为液体发酵生产埃博霉素B的固体吸附剂，特异性吸附富集埃博霉素B，实现连续液体发酵生产埃博霉素B。
附图说明
图1本发明制备的埃博霉素B分子印迹聚合物表面的扫描电镜图
图2本发明制备的埃博霉素B分子印迹聚合物的吸附动力学曲线
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不局限下述的实施例中。
实施例1
将模板分子埃博霉素B 1.0mmol；功能单体甲基丙烯酸4mmol、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol和溶剂乙腈∶甲醇(4∶1(v/v))5ml混合均匀，室温条件下静置1小时，加入引发剂偶氮二异丁腈10mg。装料后，超声波振动除气10min，随后通氮气排氧30min，在通氮条件下封管，于45℃水浴中聚合12小时，再在60℃水浴中聚合12小时，得到块状聚合物。
反应结束后，将所得到的埃博霉素B分子印迹聚合物破碎、研磨、过筛。丙酮沉降3次，冷冻干燥，得到粒径在40-60μm的聚合物粒子。
将上述40-60μm的聚合物粒子通过索氏萃取器萃取72小时，以除去模版分子埃博霉素B。此时的索氏萃取液为乙酸∶甲醇＝1∶9(v/v)混合溶液200ml。最后再用甲醇萃取2次，去除残余的乙酸。
将除去模版分子埃博霉素B的分子印迹聚合物冷冻干燥，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。得到的埃博霉素B分子印迹聚合物的表面为疏松结构，见附图1扫描电镜图片。埃博霉素B分子印迹聚合物的吸附动力学曲线见附图2。
实施例2
将模板分子埃博霉素B 1.0mmol；功能单体甲基丙烯酸4mmol、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯20mmol和溶剂乙腈∶甲醇(4∶1(v/v))4ml混合均匀，室温条件下静置1小时，加入引发剂偶氮二异丁腈10mg。装料后，超声波振动除气10min，随后通氮气排氧30min，在通氮条件下封管，于45℃水浴中聚合12小时，再在60℃水浴中聚合12小时，得到块状聚合物。
反应结束后，将所得到的埃博霉素B分子印迹聚合物破碎、研磨、过筛。丙酮沉降3次，冷冻干燥，得到粒径在40-60μm的聚合物粒子。
将上述40-60μm的聚合物粒子通过索氏萃取器萃取72小时，以除去模版分子埃博霉素B。此时的索氏萃取液为乙酸∶甲醇＝2∶8(v/v)混合溶液200ml。最后再用甲醇抽提2次，去除残余的乙酸。
将除去模版分子埃博霉素B的分子印迹聚合物冷冻干燥，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。得到的埃博霉素B分子印迹聚合物的表面为疏松结构，见附图1扫描电镜图片。埃博霉素B分子印迹聚合物的吸附动力学曲线见附图2。
实施例3
将模板分子埃博霉素B 0.5mmol；功能单体甲基丙烯酸2mmol、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯10mmol和溶剂乙腈∶甲醇(4∶1(v/v))3ml混合均匀，室温条件下静置1小时，加入引发剂偶氮二异丁腈5.0mg。装料后，超声波振动除气5min，随后通氮气排氧20min，在通氮条件下封管，于45℃水浴中聚合12小时，再在60℃水浴中聚合12小时，得到块状聚合物。
反应结束后，将所得到的埃博霉素B分子印迹聚合物破碎、研磨、过筛。丙酮沉降3次，冷冻干燥，得到粒径在40-60μm的聚合物粒子。
将上述40-60μm的聚合物粒子通过索氏萃取器萃取48小时，以除去模版分子埃博霉素B。此时的索氏萃取液为乙酸∶甲醇＝2∶8(v/v)混合溶液200ml。最后再用甲醇抽提2次，去除残余的乙酸。
将除去模版分子埃博霉素B的分子印迹聚合物冷冻干燥，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。得到的埃博霉素B分子印迹聚合物的表面为疏松结构，见附图1扫描电镜图片。埃博霉素B分子印迹聚合物的吸附动力学曲线见附图2。
实施例4
将模板分子埃博霉素B 0.5mmol；功能单体甲基丙烯酸2mmol、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯10mmol和溶剂乙腈∶甲醇(4∶1(v/v))3ml混合均匀，室温条件下静置1小时，加入引发剂偶氮二异丁腈5.0mg。装料后，超声波振动除气5min，随后通氮气排氧20min，在通氮条件下封管，于45℃水浴中聚合12小时，再在60℃水浴中聚合12小时，得到块状聚合物。
反应结束后，将所得到的埃博霉素B分子印迹聚合物破碎、研磨、过筛。丙酮沉降3次，冷冻干燥，得到粒径在40-60μm的聚合物粒子。
将上述40-60μm的聚合物粒子通过索氏萃取器萃取48小时，以除去模版分子埃博霉素B。此时的索氏萃取液为乙酸∶甲醇＝3∶7(v/v)混合溶液200ml。最后再用甲醇抽提2次，去除残余的乙酸。
将除去模版分子埃博霉素B的分子印迹聚合物冷冻干燥，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。得到的埃博霉素B分子印迹聚合物的表面为疏松结构，见附图1扫描电镜图片。
Claims (3)
1.一种埃博霉素Ｂ分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：
（1）将模版分子埃博霉素B，功能单体，交联剂按照摩尔比1:4:20混合均匀，溶解于5ml体积比为4:1的乙腈和甲醇溶液中，搅拌均匀，加入引发剂偶氮二异丁腈5.0mg；所述功能单体为甲基丙烯酸；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；
（2）通氮排氧20～30min，氮气保护条件下封管，45℃水浴中聚合12-16小时，再在60℃水浴中聚合12-16小时得到反应产物；
（3）将得到的产物聚合物破碎、研磨、过筛得到粒径40～60μm的聚合物颗粒；
（4）将聚合物颗粒于体积比1:9～3:7乙酸和甲醇混合溶液中索氏萃取数次去除模板分子，冷冻干燥至恒重，得到埃博霉素B分子印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述的埃博霉素B分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所制备的埃博霉素B分子印迹聚合物为具有多孔结构形态的疏松聚合物。
3.根据权利要求1所述的埃博霉素B分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于,索氏萃取5次以上，每次萃取时间为6～8小时，最后需用甲醇再次萃取2次以上。
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