CN107236779A - 一种真菌催化甾体生物转化的方法 - Google Patents

一种真菌催化甾体生物转化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种真菌催化甾体生物转化的方法。本发明构建的海藻酸钠接枝环糊精固定化细胞首次实现环糊精介质、真菌细胞及反应溶液的循环利用，在提高甾体催化反应效率的同时降低生产成本、减少环境污染，达到用绿色方法进行生物转化的目的，具有很好的应用价值和推广前景。

Description

一种真菌催化甾体生物转化的方法
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种真菌催化甾体生物转化的方法。
背景技术：
甾体化合物作为仅次于抗生素的第二大类药物，其在生命体内具有调控各种物质代谢及生理作用的功能。甾体的工业化生产主要是改造天然甾体化合物的结构，与传统化学方法合成相比，微生物转化的方法可以形成多种甾体活性中间体且产物纯度高。环糊精作为增溶剂能增加疏水性甾体的溶解度，其特殊空腔结构可以包结甾体底物，从而提高甾体化合物的生物利用度和产率。但是环糊精的价格较高，制约了其在生物催化领域中的大范围应用；同时微生物转化过程中大量反应溶液的使用造成浪费，并且污染环境，如Tris-HCl缓冲液，PBS缓冲液等。采用合适的方法扩大环糊精在生物转化反应中的应用以及减少反应溶液的浪费、降低环境污染是亟待解决的重要问题。
通过接枝技术将环糊精固载到壳聚糖、海藻酸钠等高分子载体上，可以把β-环糊精从溶于水的粉体材料制备成不溶于水的高分子材料，克服环糊精难回收的缺陷，使其能够循环利用，降低工业使用的成本。接枝后的环糊精仍保留独特的空腔结构及其它优良性质，同时还拥有了高分子载体良好的机械性能、稳定性等特征，这大大拓宽了环糊精的应用空间，提升了它的应用价值。通过将转化液过滤，有机溶剂萃取后除去产物，所得的含有缓冲液的萃余相进行回收，可以有效实现反应溶液的重复利用，实现清洁生产，节约成本。
中国专利CN 105754984-A公布了海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法以及用途，公开了海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法，解决了现有技术中并没有适用于二氯喹啉酸降解用假单胞菌的固定化方式的问题。本发明包括将具有假单胞菌的载体培养基和海藻酸钠混合后，滴入浓度为1～4％的氯化钙中静置2～4h制成的颗粒剂；所述海藻酸钠的质量浓度为2～6％；所述载体培养基包括吸附载体和无机盐液体培养基；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3:1，该吸附载体由重量比为1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯组成。本发明通过有效提高菌体的降解效率；且本发明固定化菌剂的降解率远远高于空白小球物理吸附效率和游离菌株的生物降解效率之和,能有效达到相互促进的效果。
海藻酸钠作为天然高分子载体，分子中含有-COOH和-OH两种亲水基团，具有较强的亲水性，并且可以环氧氯丙烷为交联剂与环糊精进行接枝，形成的环糊精-海藻酸钠接枝物可以固定化细胞。将转化液进行过滤，滤液经离心过滤、有机溶剂萃取后，所得的含有反应溶液的萃余相除去残留有机溶剂后，将其和环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠重新投入甾体生物催化反应，实现环糊精、真菌细胞和反应溶液的共循环。目前关于以海藻酸钠作为载体，以天然高分子材料接枝环糊精的形式作为促溶剂运用于难溶化合物的生物转化，并对环糊精、真菌细胞和反应溶液进行共循环利用的技术尚未可见。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种真菌催化甾体生物转化的方法，具体如下：在真菌催化的甾体生物转化反应中，以环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠作催化剂，反应结束后进行过滤，分别得滤液和过滤物，滤液经离心、有机溶剂萃取后，所得的含有反应溶液的萃余相除去残留有机溶剂后备用，过滤物使用反应溶液洗涤1-6次后，重新用于甾体生物催化反应，从而实现环糊精介质、真菌细胞和反应溶液的循环利用；
所述滤液的处理方法具体如下：
(1)滤液经5000r/min离心10min后得二次滤液；
(2)按照有机溶剂与二次滤液体积比为1-10:1加入有机溶剂萃取，收集萃余相；
所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷；
(3)萃余相30-45℃真空旋蒸除去残留有机溶剂后，将回收的反应溶液重新用于甾体生物催化反应；
所述的回收的反应溶液可循环利用6次以上；
所述的真菌可以是赭曲霉、雅致小克银汉霉、黑根霉、绿僵菌等甾体催化反应常用真菌菌株；
所述反应溶液为Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、生理盐水，pH5.0-pH7.0；
所述洗涤过滤物的反应溶液的用量为每克细胞胶珠10-100mL；
所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠的制备方法如下：
(1)海藻酸钠接枝环糊精
按海藻酸钠和环糊精按摩尔比1:0.5-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，并加入海藻酸钠质量30倍(V：m)的蒸馏水，70℃水浴中搅拌使之完全溶解；
按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.1:30加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，之后反应0.5-2h；
(2)固定化细胞胶珠的制备
待步骤(1)的反应液冷却后，调节反应液的pH至5.0-6.0，加入终浓度为50-100g/L的真菌菌体静息细胞，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡0.5-2h，过滤，用反应溶液洗涤1-6次，即得环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠。
所述的环糊精，具体为羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺酸基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精或甲基-γ-环糊精等；
所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可在不补加环糊精及微生物细胞的条件下循环使用6次以上；
所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可通过活化延长循环利用的次数，所述的活化方法具体如下：
(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠20-40g，投入到50mL发酵培养基进行活化，150-200r/min，28℃的摇床下振荡培养18-24h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定1-2h，反应溶液洗涤收集胶珠1-6次，置于4℃冰箱中保存备用。
有益效果：
(1)本发明首次实现环糊精介质、真菌细胞及反应溶液的循环利用，在提高甾体催化反应效率的同时降低生产成本、减少环境污染，达到用绿色方法进行生物转化的目的，具有很好的应用价值和推广前景。
(2)本发明可以提高甾体底物生物催化初始转化速率，提高最终转化率。
(3)本发明所述的环糊精循环利用工艺方法简单便捷，便于实现，成本节约。
具体实施方式：
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠及其在17α羟基黄体酮羟基化反应中的应用
微生物菌种采用赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC41473，它能实现甾体化合物的C11位羟基化，将17α羟基黄体酮转化为11，17α二羟基黄体酮；
斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖15，玉米浆40，蚕蛹粉2，硫酸铵1.5，pH4.5；
赭曲霉静息细胞的制备：
赭曲霉经斜面活化后制备赭曲霉孢子悬浮液，并将其接入发酵培养基(50mL培养基/250mL三角瓶)中，使得三角瓶中的孢子的终浓度为106个/mL，28℃，200r/min培养18h后加入终浓度为0.1g/L的底物进行诱导，继续培养6h后，将发酵液过滤，并用pH 7.0的Tris-HCl缓冲液洗涤三遍后收集菌体；
环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠的制备：
准确称取海藻酸钠1.0g(约5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:0.5的羟丙基-β-环糊精于100mL三角瓶中，加入约30mL蒸馏水，70℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，2h后停止反应。待反应液冷却后，调节反应液的pH至5.5，加入3g菌体静息细胞。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡2h，过滤，用Tris-HCl洗涤4次。
生物转化：
称取0.06g的17α羟基黄体酮于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH7.0)，实验组加入40g上述步骤制备的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，对照组加入不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，控制加入的菌体与实验组等量，28℃、200r/min转化18h，HPLC法测定底物转化率；
环糊精、真菌细胞及反应溶液的循环利用工艺：
将环糊精与海藻酸钠接枝固定细胞后用于上述17α羟基黄体酮的羟基化反应，反应结束后过滤收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.0)洗涤3次，反应溶液的用量为每次每克细胞胶珠50ml。滤液5000r/min离心10min得二次滤液，加入两倍于二次滤液量的乙酸乙酯，萃取三次，萃余相45℃真空旋蒸除去残留的乙酸乙酯，将其和过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，重新投入甾体生物催化反应，进行循环利用，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
结果表明，对照组的初次转化率为80％，接枝羟丙基-β-环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠的初次转化率是96％，循环利用6次后，17α羟基黄体酮的最终转化率仍高达92％，见表1。循环使用6次后对环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠进行活化，活化方法具体如下：
(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠20g，投入到50mL发酵培养基进行活化，150r/min，28℃的摇床下振荡培养18h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用Tris-HCl将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定1h，反应溶液洗涤收集胶珠3次，置于4℃冰箱中保存并继续循环使用3次，结果见表1。
表1
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9
转化率 96％ 94％ 93％ 92％ 91％ 92％ 95％ 92％ 93％
实施例2：
除以下内容外，其他同实施例1。
环糊精-海藻酸钠固定化细胞的制备：
准确称取海藻酸钠1.0g(约5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:1.5的羧甲基-β-环糊精于100mL三角瓶中，加入约30mL蒸馏水，70℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，1.5h后停止反应。待反应液冷却后，加入3g菌体静息细胞。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡1.5h，过滤，用生理盐水洗涤3次备用。
生物转化：
称取0.06g的17α羟基黄体酮于100mL三角瓶中，加入20mL的生理盐水，实验组加入40g上述步骤制备的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，对照组加入不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，控制加入的菌体与实验组等量，28℃、200r/min转化18h，HPLC法测定底物转化率；
将环糊精与海藻酸钠接枝后用于上述17α羟基黄体酮的生物催化反应，反应结束后收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用生理盐水洗涤4次，反应溶液的用量为每次每克细胞胶珠80ml，滤液5000r/min离心10min得二次滤液，加入三倍于二次滤液量的二氯甲烷，萃取三次，萃余相30℃真空旋蒸除去残留的二氯甲烷。将其和过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，重新投入甾体生物催化反应，进行循环利用，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
结果表明，接枝羧甲基-β-环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠首次用于17α羟基黄体酮生物催化的初始转化速率是对照组的1.1倍，循环利用7次后，17α羟基黄体酮的最终转化率为91％，见表2。循环使用7次后对环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠进行活化，活化方法具体如下：
(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠40g，投入到50mL发酵培养基进行活化，200r/min，28℃的摇床下振荡培养24h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用生理盐水将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠6次，置于4℃冰箱中保存并继续循环使用3次，结果见表2。
表2
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 93％ 92％ 95％ 91％ 90％ 90％ 91％ 95％ 94％ 90％
实施例3：
除以下内容外，其他同实施例1。
环糊精接枝海藻酸钠固定化细胞：
准确称取海藻酸钠1.0g(约5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:1的甲基-β-环糊精于100mL三角瓶中，加入约30mL蒸馏水，70℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约1.5h后停止反应。待反应液冷却后，加入3g菌体静息细胞。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡2h，过滤，用乙酸-乙酸钠(pH5.5)洗涤2次。
生物转化：
称取0.06g的17α羟基黄体酮于100mL三角瓶中，加入20mL的乙酸-乙酸钠(pH5.5)，再加入30g环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，对照组加入不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，28℃、200r/min转化18h，HPLC法测定底物转化率；
将环糊精与海藻酸钠接枝后用于上述17α羟基黄体酮的生物催化反应，反应结束后收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用乙酸-乙酸钠(pH5.5)洗涤2次，反应溶液的用量为每次每克细胞胶珠100ml，滤液5000r/min离心10min得二次滤液，加入7倍于二次滤液量的三氯甲烷，萃取三次，萃余相35℃真空旋蒸除去残留的三氯甲烷。将其和过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，重新投入甾体生物催化反应，进行循环利用，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
结果表明，接枝甲基-β-环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠首次用于17α羟基黄体酮生物催化的初始转化速率是对照组的1.4倍，循环利用7次后，17α羟基黄体酮的最终转化率为92％，见表3。
表3
循环次数 1 2 3 4 5 6 7
转化率 91％ 93％ 93％ 94％ 91％ 94％ 92％
实施例4：环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠及其在17α羟基黄体酮羟基化反应中的应用
微生物菌种采用雅致小克银汉霉(Cunningpamycetes elegans)CICC 40250，它能实现甾体化合物的C11位羟基化，将17α羟基黄体酮转化为11，17α二羟基黄体酮；
斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20；
发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨5，氯化钠5，磷酸氢二钾0.5，pH6.5；
雅致小克银汉霉静息细胞的制备：
雅致小克银汉霉经斜面活化后，制备孢子悬浮液，并接入发酵培养基(50mL培养基/250mL三角瓶)中，使得三角瓶中的孢子的终浓度为106个/mL，28℃，150r/min培养24h后，将发酵液过滤后用pH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液洗涤三遍后收集菌体；
环糊精-海藻酸钠固定化细胞的制备：
准确称取海藻酸钠1.0g(约5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:1.2的羟丙基-β-环糊精于100mL三角瓶中，加入约30mL蒸馏水，70℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约1h后停止反应。待反应液冷却后，调节反应溶液的pH至5.0，加入2.5g菌体静息细胞。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡2h，过滤，用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)洗涤4次。
生物转化：
称取0.06g的17α羟基黄体酮于100mL三角瓶中，加入20mL的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)，实验组加入30g上述步骤制备的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，对照组加入不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，控制加入的菌体与实验组等量，28℃、150r/min转化14h，HPLC法测定底物转化率；
环糊精、真菌细胞及反应溶液的循环利用工艺：
将环糊精与海藻酸钠接枝固定细胞后用于上述17α羟基黄体酮的羟基化反应，反应结束后过滤收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)洗涤3次，乙酸-乙酸钠缓冲液的用量为每次每克细胞胶珠50ml。滤液5000r/min离心10min得二次滤液，加入五倍于二次滤液量的乙酸异丁酯，萃取三次，萃余相45℃真空旋蒸除去残留的乙酸异丁酯。将其和过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，重新投入甾体生物催化反应，进行循环利用，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
结果表明，对照组的初次转化率为76％，接枝羟丙基-β-环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠的初次转化率是95％，循环利用6次后，17α羟基黄体酮的最终转化率仍高达91％，见表4。循环使用6次后对环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠进行活化，活化方法具体如下：
(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠30g，投入到50mL发酵培养基进行活化，180r/min，28℃的摇床下振荡培养20h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用乙酸-乙酸钠缓冲液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定1.5h，反应溶液洗涤收集胶珠3次，置于4℃冰箱中保存并继续循环使用3次。
表4
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9
转化率 95％ 95％ 93％ 94％ 91％ 91％ 93％ 92％ 90％
虽然上文已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，具体如下：在真菌催化的甾体生物转化反应中，以环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠作催化剂，反应结束后进行过滤，分别得滤液和过滤物，滤液经离心、有机溶剂萃取后，所得的含有反应溶液的萃余相除去残留有机溶剂后备用，过滤物使用反应溶液洗涤1-6次后，重新用于甾体生物催化反应，从而实现环糊精介质、真菌细胞和反应溶液的循环利用。
2.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述的真菌是赭曲霉、雅致小克银汉霉、黑根霉或绿僵菌等。
3.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述反应溶液为Tris-HCl缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或生理盐水，pH5.0-pH7.0。
4.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述滤液的处理方法具体如下：
(1)滤液经离心后得二次滤液；
(2)按照有机溶剂与二次滤液体积比为1-10:1加入有机溶剂萃取，收集萃余相；
所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、二氯甲烷或三氯甲烷等；
(3)萃余相30-45℃真空旋蒸除去残留有机溶剂后，将回收的反应溶液重新用于甾体生物催化反应。
5.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，回收的反应溶液和细胞胶珠可循环利用6次以上。
6.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述的环糊精，具体为羟丙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺酸基-β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精或甲基-γ-环糊精等。
7.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可通过活化延长循环利用的次数，所述的活化方法具体如下：
(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠20-40g，投入到50mL发酵培养基中进行活化，150-200r/min，28℃的摇床下振荡培养18-24h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定1-2h，反应溶液洗涤收集胶珠1-6次，置于4℃冰箱中保存备用。
8.如权利要求1所述的一种真菌催化甾体生物转化的方法，其特征在于，所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠的制备方法如下：
(1)海藻酸钠接枝环糊精
按海藻酸钠和环糊精按摩尔比1:0.5-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，并加入海藻酸钠质量30倍的蒸馏水，水浴中搅拌使之完全溶解；
按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.1:30加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.1:10滴加NaOH溶液，之后反应0.5-2h；
(2)固定化细胞胶珠的制备
待步骤(1)的反应液冷却后，调节反应液的pH至5.0-6.0，加入终浓度为50-100g/L的真菌菌体静息细胞，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到CaCl2溶液中，将胶珠在CaCl2溶液中继续浸泡0.5-2h，过滤，用反应溶液洗涤1-6次，即得环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠。
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