CN105420335A - 丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种经半纤维素处理的丝瓜络接枝环糊精后再醋酸可的松生物催化中的循环利用技术。具体为：在以醋酸可的松为底物的催化反应体系中，以接枝丝瓜络的环糊精为促溶剂，反应结束后，将接枝环糊精的丝瓜络取出，使用缓冲液洗涤丝瓜络2-5次并烘干后，重新用于醋酸可的松的生物催化，从而实现环糊精介质的循环利用，所述丝瓜络预先经半纤维素酶酶解。该方法可以实现环糊精介质循环利用，在循环6次后底物醋酸可的松转化率仍可以达到90％以上，达到提高甾体等醋酸可的松催化反应效率的同时降低生产成本的目的，具有很好的应用价值和推广前景。

Description

丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种经半纤维素酶处理的丝瓜络接枝环糊精后在醋酸可的松生物催化中的循环利用技术。

背景技术：

甾体底物的低水溶性使得甾体底物与酶的有效接触非常困难，严重制约着甾体转化反应的速度和产率，环糊精外环亲水，内环亲脂的特殊结构使其能作为超分子主体化合物包结疏水性底物，从而提高底物的溶解度。环糊精与客体形成的包结物能对微生物具有较好的生物相容性，这种性质推动其在醋酸可的松的微生物转化领域得到广泛的研究。随着环糊精及其衍生物在生物转化领域的应用，环糊精在生物转化方面的作用已相当明显，应用也逐渐成熟，逐步走向工业生产阶段。但是，环糊精的价格相对较高限制其在生物催化技术中的应用。在环糊精体系中，如何实现环糊精介质的循环利用，是环糊精类介质在工业应用中亟待解决的重要科学和技术问题。

双金玲等在《纤维素固载β-环糊精的研究进展》(《纤维素科学与技术》2007年12月，15(4))中指出，将环糊精与高分子机制连接起来，形成固化环糊精材料，既保留了环糊精的独特性质，又具有高分子材料的特征如良好的机械性能、稳定性和化学可调性，这给环糊精的应用提供了更广阔的空间。而纤维素作为自然界中储量最丰富的天然高分子具有很多优势，将纤维素和环糊精这两种环境友好材料通过适当的方法结合起来，制备出特殊性能的材料，将在环境保护、食品、包装、医疗、日化等领域发挥重要的作用。而目前，纤维素固载环糊精已经在纤维纺织工业、污水处理、医疗保健、空气净化等方面。

中国专利CN102352557A公布了一种环糊精固载醋酸纤维素的方法及应用。所述方法包括以下步骤：a、醋酸纤维素改性整理液的配制；b、浸轧工艺；c、烘培工艺；d、水洗除杂；e、干燥。利用本方法制备出的环糊精接枝固载醋酸纤维素可应用于卷烟滤嘴材料上，可降低卷烟主流烟气中苯及苯系物、挥发性酚类化合物、多环芳烃以及重金属等有害成分，或提高卷烟醋酸纤维丝束的染色稳定性和可染性，或延长卷烟滤嘴留香以及香气的缓释。本发明采用柠檬酸作为交联剂，首次将环糊精接枝于醋酸纤维素上，采用的柠檬酸为常用的食品添加剂，具有更好的安全性；对于卷烟生产厂家而言，采用具有选择性减害效果的改性醋酸纤维滤嘴，不需要另购置昂贵的复合成型机，可降低成本，具有显著的经济效益。

丝瓜络作为植物载体，不仅可以增加细胞的稳定性，还能保持菌体的活性。其结构中含有半纤维素、木质素和大量的纤维素，不仅价廉易得，还有增加细胞稳定性、保持菌体活性的作用。采用生物酶代替传统的化学方法，利用半纤维素酶对丝瓜络纤维中的半纤维素进行充分溶解，同时使缠绕在半纤维素上的木质素随之降解，最终去除木质素，使纤维素纤维呈单纤维分离状态暴露于天然丝瓜络表面，能充分利用纤维素与环糊精进行接枝，形成固载环糊精的高分子材料，这样既可以保留环糊精的独特性质，又具有高分子材料的特性，如良好的机械性能、化学可调性和稳定性。这给环糊精的应用提供了更广阔的空间。

但是目前关于以丝瓜络作为载体，以纤维素固载环糊精的形式作为促溶剂运用于难溶化合物的生物转化，并对环糊精进行循环利用的技术尚未可见。

发明内容：

本发明提供一种醋酸可的松生物催化中环糊精介质的循环利用方法，具体如下：在醋酸可的松的生物催化体系中，以接枝丝瓜络的环糊精为促溶剂，所述丝瓜络预先经半纤维素酶酶解，反应结束后，将接枝环糊精的丝瓜络取出，使用缓冲液洗涤丝瓜络2-5次，50℃-80℃烘干后重新用于醋酸可的松的生物催化，从而实现环糊精介质的循环利用，；

所述半纤维素酶酶解的方法具体如下：

取市售丝瓜络，每克丝瓜络加水50mL，半纤维素酶的用量为0.01-0.20g/mL，调节pH为5-7，30-90℃条件下水浴震荡反应1-5h后，抽滤烘干，称重备用；所述接枝环糊精的丝瓜络可在不补加环糊精的条件下循环使用6次以上；

所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，pH7.2；

所述缓冲液的用量为每次每克丝瓜络60-100ml；

所述接枝丝瓜络的环糊精的制备方法如下：

(1)环氧化：将半纤维素酶酶解后的丝瓜络置于蒸馏水中，并按丝瓜络干重与环氧氯丙烷按重量比为1:6-1:20加入环氧氯丙烷、以及丝瓜络干重2倍的10mol/LNaOH溶液进行环氧化，在45-60℃下反应3-6h；

(2)接枝：将环氧化丝瓜络先后用蒸馏水和丙酮清洗、烘干后投入到其重量40-70倍的浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液中，再加入环氧化丝瓜络干重0.9-2.0倍的环糊精，在40-60℃下进行接枝反应3-6h；

(3)洗涤：反应完毕后用蒸馏水洗涤丝瓜络至洗出液为中性，烘干即得接枝丝瓜络的环糊精；

所述的环糊精为α-环糊精、γ-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、磺酸基-β-环糊精等水溶性的环糊精。

有益效果：

(1)本发明可以实现环糊精介质循环利用，在循环8次后底物醋酸可的松转化率仍可以达到90％以上，达到提高甾体等醋酸可的松催化反应效率的同时降低生产成本的目的，具有很好的应用价值和推广前景；

(2)本发明所提供的技术能够提高环糊精的接枝率由0.0629g/g丝瓜络增至0.356g/g丝瓜络；

(3)本发明所述的环糊精循环利用工艺方法简单便捷，便于实现，成本节约。

具体实施方式：

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：化合物醋酸可的松的C_1,2位脱氢反应

微生物菌种采用简单节杆菌ArthrobactersimplexTCCC11037，它能实现甾体化合物的C_1，2位脱氢转化，将醋酸可的松(CA)转化为醋酸泼尼松；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，琼脂20，pH7.2

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH7.2

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆15，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH7.2

简单节杆菌菌体制备：

微生物在32℃，160r/min，30/250mL装量条件下活化培养18h，取活化种子以1:20比例在装量为30/250mL条件下培养20h，将发酵培养获得的细胞5000r/min离心后用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三遍，重悬于pH7.2的PBS缓冲液中的简单节杆菌静息细胞菌悬液；

半纤维素酶处理丝瓜络：

称取1g市售丝瓜络，加入50mL水，半纤维素酶用量为0.20g/mL，pH为5.0，在40℃恒温水浴震荡器震荡反应5h后，用循环水式多用真空泵进行抽滤，最后在80℃的烘箱内烘干，称重。

环糊精与丝瓜络的接枝：

称取1g用酶处理后的丝瓜络，放入250ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，加入与丝瓜络重量比1:20的环氧氯丙烷，再加入与丝瓜络重量比1:2的10mol/LNaOH溶液，45℃恒温反应3h，反应完毕后取出，水洗至不含环氧氯丙烷为止，再用丙酮清洗两遍，50℃烘干备用；将制备的环氧化丝瓜络，放入10mol/L的NaOH与β-环糊精的混合溶液中，环氧化丝瓜络与NaOH的质量比为1:40，环氧化丝瓜络与β-环糊精的质量比为1:1.3，放入恒温水浴锅中，40℃振荡反应3h。停止震荡，并向烧杯中加入适量蒸馏水洗涤，抽滤至洗出液为中性，50℃烘干备用；结果表明酶处理每克丝瓜络接枝β-环糊精的量由0.0629克增至0.356克；

生物转化：

取3mL静息细胞菌悬液，加入17mL的PBS(pH7.2)和0.06g的CA于100mL三角瓶中，再加入0.3g上述接枝环糊精的丝瓜络(接枝的β-环糊精量为0.076g)，对照组加入没有接枝丝瓜络的环糊精0.076g，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率；

环糊精的循环利用工艺：

将β-环糊精与丝瓜络接枝后用于CA的生物催化反应，反应结束后收集接枝β-环糊精的丝瓜络，将其用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤3次，缓冲液用量为每次每克丝瓜络80ml，于50℃烘箱中烘干，重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变。

结果表明，接枝β-环糊精的丝瓜络的初始转化速率是对照组(1.4g/Lmin-1)的1.9倍，且循环利用8次后，CA的最终转化率仍在90％以上，见表1。

表1接枝环糊精的丝瓜络循环利用过程中CA的最终转化率

实施例2：

除以下内容外，其他同实施例1。

半纤维素酶处理丝瓜络：

称取1g市售丝瓜络，加入50mL水，半纤维素酶用量为0.05g/mL，pH为6.5，在60℃恒温水浴震荡器震荡反应3h后，用循环水式多用真空泵进行抽滤，最后在80℃的烘箱内烘干，称重。

环糊精与丝瓜络的接枝：

称取1g用酶处理后的丝瓜络，放入250ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，加入与丝瓜络重量比1:6的环氧氯丙烷，再加入与丝瓜络重量比1:2的10mol/LNaOH溶液，50℃恒温反应6h，反应完毕后取出，水洗至不含环氧氯丙烷为止，再用丙酮清洗两遍，50℃烘干备用；将制备的环氧化丝瓜络，放入10mol/L的NaOH与羟丙基-β-环糊精的混合溶液中，环氧化丝瓜络与NaOH的质量比为1:70，环氧化丝瓜络与羟丙基-β-环糊精的质量比为1:1.1，放入恒温水浴锅中，45℃振荡反应3h。停止震荡，并向烧杯中加入适量蒸馏水洗涤，抽滤至洗出液为中性，50℃烘干备用。

生物转化：

取3mL静息细胞菌悬液，加入17mL的PBS(pH7.2)和0.06g的CA于100mL三角瓶中，再加入0.3g上述接枝环糊精的丝瓜络(接枝的羟丙基-β-环糊精量为0.096g)，对照组加入没有接枝丝瓜络的羟丙基-β-环糊精0.096g，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率。

反应结束后收集接枝羟丙基β-环糊精的丝瓜络，将其用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤2次，缓冲液用量为每次每克丝瓜络100ml，于60℃烘箱中烘干，重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变。结果表明，接枝羟丙基-β-环糊精的丝瓜络的初始转化速率是对照组(1.4g/Lmin-1)的2.1倍，且循环利用6次后，CA的最终转化率为91.5％，见表2。

表2接枝环糊精的丝瓜络循环利用过程中CA的最终转化率

实施例3：

除以下内容外，其他同实施例1。

半纤维素酶处理丝瓜络：

称取1g市售丝瓜络，加入50mL水，半纤维素酶用量为0.10g/mL，pH为7.0，在90℃恒温水浴震荡器震荡反应1h后，用循环水式多用真空泵进行抽滤，最后在80℃的烘箱内烘干，称重。

环糊精与丝瓜络的接枝：

称取1g用酶处理后的丝瓜络，放入250ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，加入与丝瓜络重量比1:15的环氧氯丙烷，再加入与丝瓜络重量比1:2的10mol/LNaOH溶液，60℃恒温反应5h，反应完毕后取出，水洗至不含环氧氯丙烷为止，再用丙酮清洗两遍，50℃烘干备用；将制备的环氧化丝瓜络，放入10mol/L的NaOH与甲基-β-环糊精的混合溶液中，环氧化丝瓜络与NaOH的质量比为1:40，环氧化丝瓜络与甲基-β-环糊精的质量比为1:1.5，放入恒温水浴锅中，60℃振荡反应6h。停止震荡，并向烧杯中加入适量蒸馏水洗涤，抽滤至洗出液为中性，50℃烘干备用。

生物转化：

取3mL静息细胞菌悬液，加入17mL的PBS(pH7.2)和0.06g的CA于100mL三角瓶中，再加入0.3g上述接枝环糊精的丝瓜络(接枝的甲基-β-环糊精量为0.051g)，对照组加入没有接枝丝瓜络的甲基-β-环糊精0.051g，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率。

反应结束后收集接枝甲基-β-环糊精的丝瓜络，将其用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤5次，缓冲液用量为每次每克丝瓜络60ml，于80℃烘箱中烘干，重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变。

结果表明，接枝甲基-β-环糊精的丝瓜络的初始转化速率是对照组(1.4g/Lmin-1)的1倍，且循环利用6次后，CA的最终转化率为90.3％，见表3。

表3接枝环糊精的丝瓜络循环利用过程中CA的最终转化率

虽然上文已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，在以醋酸可的松为底物的催化反应体系中，以接枝丝瓜络的环糊精为促溶剂，所述丝瓜络预先经半纤维素酶酶解，反应结束后，将接枝环糊精的丝瓜络取出，使用缓冲液洗涤丝瓜络2-5次，50℃-80℃烘干后，重新用于醋酸可的松的生物催化，从而实现环糊精介质的循环利用；

所述半纤维素酶酶解的方法具体如下：

取市售丝瓜络，每g丝瓜络加水50mL，半纤维素酶的用量为0.01-0.20g/mL，调节pH为5-7，30-90℃条件下水浴震荡反应1-5h后，抽滤烘干，称重备用；

2.如权利要求1所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述接枝环糊精的丝瓜络可在不补加环糊精的条件下循环使用8次以上。

3.如权利要求1所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，pH7.2。

4.如权利要求1或3所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述缓冲液的用量为每次每克丝瓜络60-100ml。

5.如权利要求1所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述接枝丝瓜络的环糊精的制备方法如下：

(1)环氧化：将溶胀后的丝瓜络置于蒸馏水中，并按丝瓜络干重与环氧氯丙烷按重量比为1:6-1:20将加入环氧氯丙烷、以及丝瓜络干重2倍的10mol/LNaOH溶液进行环氧化，在45-60℃下反应3-6h；

(2)接枝：将环氧化丝瓜络先后用蒸馏水和丙酮清洗、烘干后投入到其重量40-70倍的浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液中，再加入环氧化丝瓜络干重0.9-2.0倍的环糊精，在40-60℃下进行接枝反应3-6h；

(3)洗涤：反应完毕后用蒸馏水洗涤丝瓜络至洗出液为中性，烘干即得接枝丝瓜络的环糊精。

6.如权利要求1所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述的环糊精为水溶性环糊精。

7.如权利要求6所述的丝瓜络接枝环糊精在醋酸可的松催化反应中的循环利用，其特征在于，所述水溶性环糊精为α-环糊精、γ-环糊精、β-环糊精、甲基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、磺酸基-β-环糊精。