CN107164360B - 海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞及其应用。本发明构建的海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞首次实现环糊精介质及细胞的同时循环利用，在提高甾体底物溶解度的同时，达到促溶介质和催化细胞的重复使用，循环8次后甾体底物转化率仍在90％以上，具有很好的应用价值和推广前景。

Description

海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞及其应用

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞及其应用。

背景技术：

甾体化合物作为仅次于抗生素的第二大类药物，其在生命体内具有调控各种物质代谢及生理作用的功能。甾体药物的工业化生产主要是改造天然甾体化合物的结构，与传统化学方法合成相比，微生物转化的方法可以形成多种甾体药物活性中间体且产物纯度高。环糊精作为增溶剂能增加疏水性甾体的溶解度，其特殊空腔结构可以包结甾体底物，从而提高甾体化合物的生物利用度和产率。然而环糊精的价格较高制约了其在生物催化领域中的大范围应用，采用合适的方法扩大环糊精在生物转化反应中的应用是亟待解决的重要问题。

通过接枝技术将环糊精固载到壳聚糖、海藻酸钠等高分子载体上，可以把β-环糊精从溶于水的粉体材料制备成不溶于水的高分子材料，克服环糊精难回收的缺陷，使其能够循环利用，降低工业使用的成本。接枝后的环糊精仍保留独特的空腔结构及其它优良性质，同时还拥有了高分子载体良好的机械性能、稳定性等特征，这大大拓宽了环糊精的应用空间，提升了它的应用价值。海藻酸钠是一种天然聚阴离子多糖高分子化合物，由G、M两个单元构成，遇水后表面具有粘性，会使得溶液也具有粘性。其安全无毒，成本低，生物可降解性以及生物相容性良好，具备药用辅料所需的性质，遇到Ca²⁺、Zn²⁺等阳离子时，会发生化学反应形成凝胶球，针对这种性质，可用作药物的缓释和控释材料，以及用于固定性质不稳定物质，提高稳定性，同时还可用于固定微生物、细胞、酶等，实现循环利用。目前海藻酸钠的应用主要涉及到农药、食品、生物医药等领域，也被逐渐延伸到重金属污染的救治方面。

中国专利CN 105754984-A公布了海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法以及用途，公开了海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法，解决了现有技术中并没有适用于二氯喹啉酸降解用假单胞菌的固定化方式的问题。本发明包括将具有假单胞菌的载体培养基和海藻酸钠混合后，滴入浓度为1～4％的氯化钙中静置2～4h制成的颗粒剂；所述海藻酸钠的质量浓度为2～6％；所述载体培养基包括吸附载体和无机盐液体培养基；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3:1,该吸附载体由重量比为1:1～2:1的玉米芯、竹炭和油枯组成。本发明通过有效提高菌体的降解效率；且本发明固定化菌剂的降解率远远高于空白小球物理吸附效率和游离菌株的生物降解效率之和，能有效达到相互促进的效果。

海藻酸钠作为天然高分子载体，分子中含有-COOH和-OH两种亲水基团，具有较强的亲水性，并且可以环氧氯丙烷为交联剂与环糊精进行接枝，形成的环糊精-海藻酸钠接枝物可以固定化细胞，实现环糊精和细胞的共循环。目前关于以海藻酸钠作为载体，以天然高分子材料接枝环糊精的形式作为促溶剂运用于难溶化合物的生物转化，并对环糊精及细胞进行共循环利用的技术尚未可见。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种甾体生物催化反应中环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，具体如下：

在甾体生物催化反应中，以环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠作催化剂，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，使用反应溶液洗涤1-8次后，重新用于甾体生物催化反应，从而实现环糊精介质及细胞循环利用；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水等，pH7.0-pH7.6；

所述洗涤细胞胶珠的反应溶液的用量为每克细胞胶珠10-100mL；

所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠的制备方法如下：

(1)海藻酸钠接枝环糊精

按海藻酸钠和环糊精按摩尔比1:0.2-1:1.5称取海藻酸钠和环糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸钠45-55倍(质量体积比)的蒸馏水，30-70℃水浴中搅拌使之完全溶解；

按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.05-1:50加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.05-1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，滴加时间10min，之后反应1.5-6.5h；

(2)固定化细胞胶珠的制备

待步骤(1)的反应液冷却后，加入终浓度为1-30g/L的菌体静息细胞，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡1-6h，过滤，用反应溶液洗涤1-8次，即得环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水等，pH7.0-pH7.6

所述的环糊精为天然环糊精，具体为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精；

所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可在不补加环糊精及微生物细胞的条件下循环使用8次以上；

所述环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可通过活化延长循环利用的次数，所述的活化方法具体如下：

(1)将催化效率降低的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠10g,投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；

所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；

(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠1-8次，置于4℃冰箱中保存备用；

活化后环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可再次循环利用3-5次。

有益效果：

(1)本发明首次实现环糊精介质及细胞的同时循环利用，在循环8次后甾体底物转化率仍在90％以上，达到提高甾体催化反应效率的同时降低生产成本的目的，具有很好的应用价值和推广前景。

(2)本发明可以提高甾体底物生物催化初始转化速率，提高最终转化率。

(3)本发明所述的环糊精循环利用工艺方法简单便捷，便于实现，成本节约。

具体实施方式：

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

微生物菌种采用简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037，它能实现甾体化合物的C₁，₂位脱氢转化，将醋酸可的松(CA)转化为醋酸泼尼松；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，琼脂20，pH 7.2；

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH 7.2；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆15，蛋白胨5，磷酸氢二钾2.5，pH 7.2；

简单节杆菌静息细胞的制备：

TCCC 11037在32℃，160r/min，30/250mL种子培养基装量条件下培养18h后，按5％接种量接种于装有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，32℃，160r/min条件下培养20h，将发酵培养获得的细胞5000r/min离心后用pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤三遍，重悬于pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中得简单节杆菌静息细胞菌悬液；

环糊精接枝海藻酸钠固定化细胞的制备：

准确称取海藻酸钠0.99g(5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:0.7的β-环糊精于100mL三角瓶中，加入约50mL蒸馏水，60℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.3mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，反应2.5h。待反应液冷却后，加入菌体静息细胞悬液，使得菌体浓度为10g/L。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.5mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡2h，过滤，用pH 7.2的Tris-HCl洗涤3次备用。

生物转化：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，实验组加入10g上述步骤制备的环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠(接枝的β-环糊精量为0.115g)，对照组加入不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，控制加入的菌体与实验组等量，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率；

环糊精及细胞的循环利用工艺：

将环糊精与海藻酸钠接枝固定细胞后用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，用量为每次每克细胞胶珠50ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；

循环利用5次后，转化率降至90％，将环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠进行活化，步骤如下：

将回收的每10g环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；

培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用pH 7.2的Tris-HCl缓冲液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl₂溶液中再次固定2h，洗涤收集胶珠，再次用于CA的生物催化反应；

结果表明，对照组的初次转化率为86％，接枝β-环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠的初次转化率是95％，初始转化速率是对照组(1.1×10^-2g/L min^-1)的1.3倍，循环利用8次后，CA的最终转化率为90％，见表1。

表1

循环次数	1	2	3	4	5	6	7	8
									转化率	95％	93％	91％	90％	90％	92％	92％	90％

实施案例2：环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

除以下内容外，其他同实施例1。

环糊精接枝海藻酸钠固定化细胞：

准确称取海藻酸钠0.99g(5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:1.5的α-环糊精于100mL三角瓶中，加入约50mL蒸馏水，70℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入1mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约6h后停止反应。待反应液冷却后，加入菌体静息细胞悬液，使得菌体浓度为30g/L。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.25mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡6h，过滤，用生理盐水(pH7.5)洗涤2次。

生物转化：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，再加入10g环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠(接枝的α-环糊精量为0.072g)，对照组加入等菌体量不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率；

将环糊精与海藻酸钠接枝后用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用生理盐水(pH 7.5)洗涤2次，用量为每次每克细胞胶珠100ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变。

结果表明，接枝α-环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠首次用于CA生物催化的初始转化速率是对照组(1.1×10^-2g/L min^-1)的1.2倍，且循环利用5次后对α-环糊精-海藻酸钠固定化细胞进行活化，活化方法同实施例1，活化后继续循环使用4次，CA的最终转化率为90％。

实施案例3：环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠及其在醋酸可的松C_1,2位脱氢反应中的应用

除以下内容外，其他同实施例1。

环糊精接枝海藻酸钠固定化细胞：

准确称取海藻酸钠0.99g(5.0mmol)，加入与之摩尔比为1:0.2的γ-环糊精于100mL三角瓶中，加入约50mL蒸馏水，30℃水浴中电动搅拌使之完全溶解，加入0.05mL的环氧氯丙烷，同时滴加10mL 0.5mol/L的NaOH溶液，约10min滴完，约1.5h后停止反应。待反应液冷却后，加入菌体静息细胞悬液，使得菌体浓度为1g/L。将混悬液搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.1mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡1h，过滤，用Tris-HCl(pH 7.5)洗涤2次。

生物转化：

称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.5)，再加入10g环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠(接枝的γ-环糊精量为0.058g)，对照组加入等菌体量不接枝环糊精的海藻酸钠固定化细胞胶珠，34℃、180r/min转化8h，HPLC法测定底物转化率；

将环糊精与海藻酸钠接枝后用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.5)洗涤2次，用量为每次每克细胞胶珠100ml，洗涤后重新用于醋酸可的松的生物转化，用量不变。

结果表明，接枝γ-环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠首次用于CA生物催化的初始转化速率是对照组(1.1×10^-2g/L min^-1)的1.1倍，且循环利用5次后对γ-环糊精-海藻酸钠固定化细胞进行活化，活化方法同实施例1，活化后继续循环使用3次，CA的最终转化率为91％。

虽然上文已经用一般性说明、具体实施方式及实验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，具体如下：在甾体生物催化反应中，以天然环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠作催化剂，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠，重新投入甾体生物催化反应，进行循环利用；

所述天然环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠的制备方法如下：

(1)海藻酸钠接枝天然环糊精

按海藻酸钠和天然环糊精按摩尔比1:0.2-1:1.5称取海藻酸钠和天然环糊精，加入三角瓶中，并加入海藻酸钠45-55倍的蒸馏水，30-70℃水浴中搅拌使之完全溶解；

按环氧氯丙烷与蒸馏水体积比0.05-1:50加入环氧氯丙烷，同时按环氧氯丙烷与NaOH溶液体积比0.05-1:10滴加0.5mol/L的NaOH溶液，之后反应1.5-6.5h；

(2)固定化细胞胶珠的制备

待步骤(1)的反应液冷却后，加入终浓度为1-30g/L的菌体静息细胞，搅拌均匀，在磁力搅拌下用注射器滴加到0.1-0.5mol/L的CaCl₂溶液中，将胶珠在CaCl₂溶液中继续浸泡1-6h，过滤，用反应溶液洗涤1-8次，即得环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠；

所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水，pH7.0-pH7.6。

2.如权利要求1所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，天然环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠循环利用的次数为8次以上。

3.如权利要求1所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，所述的天然环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

4.如权利要求1所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，所述天然环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠通过活化延长循环利用的次数，所述的活化方法具体如下：

(1)将催化效率降低的天然环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；

所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；

(2)培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl₂溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠1-8次，置于4℃冰箱中保存备用。

5.如权利要求4所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，活化后环糊精-海藻酸钠固定化细胞胶珠可再次循环利用3-5次。

6.如权利要求1所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，细胞胶珠使用反应溶液洗涤1-8次后，重新用于甾体生物催化反应，所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或纯水，pH7.0-pH7.6。

7.如权利要求6所述的一种甾体生物催化反应中天然环糊精介质及催化细胞循环利用的方法，其特征在于，所述洗涤细胞胶珠的反应溶液的用量为每克细胞胶珠10-100mL。