CN112080490A - 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用 - Google Patents

环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112080490A
CN112080490A CN202011078499.XA CN202011078499A CN112080490A CN 112080490 A CN112080490 A CN 112080490A CN 202011078499 A CN202011078499 A CN 202011078499A CN 112080490 A CN112080490 A CN 112080490A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cyclodextrin
graft
beads
immobilized cell
beta
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011078499.XA
Other languages
English (en)
Inventor
申雁冰
王敏
郭俊超
李梦涵
谢培培
骆健美
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202011078499.XA priority Critical patent/CN112080490A/zh
Publication of CN112080490A publication Critical patent/CN112080490A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及环糊精接枝物‑细菌固定化细胞多孔胶珠、制备及其在生物转化中的应用。所述多孔胶珠是将海藻酸钠、环糊精‑羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和氧化石墨烯按照一定比例在水中混合均匀后滴入金属离子溶液中成球而制成的。该胶珠具有较高的的机械强度，利于其重复使用，而且能够高效循环利用环糊精，减少环糊精和细胞损失，便于循环过程中的分离；孔径小且规则，孔隙数量多的胶珠，孔隙率更高，比表面积大，传质阻力小，不仅利于环糊精、细胞与底物快速接触，提高了转化速率，缩短了反应周期；并且对细胞中的酶活性起到一定的促进作用，呈现出良好的细胞相容性。

Description

环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用
技术领域：
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠、制备及其在生物转化中的应用。
背景技术：
甾体化合物作为仅次于抗生素的第二大类药物，其在生命体内具有调控各种物质代谢及生理作用的功能。与传统化学合成方法相比，微生物转化的方法可以形成多种甾体药物活性中间体且产物纯度高。环糊精作为增溶剂能增加疏水性甾体的溶解度，其特殊空腔结构可以包结甾体底物，从而提高甾体化合物的生物利用度和产率。然而环糊精的价格较高，制约了其在生物催化领域中的大规模应用。通过化学接枝技术将环糊精固载到高分子载体上，可以把环糊精从溶于水的粉体材料制备成不溶于水的高分子材料，克服环糊精难回收的缺陷，使其能够循环利用，降低工业使用的成本，但接枝率低且部分材料对细胞有害，所以找到无害的接枝载体且采用合适的方法提高环糊精固载量是亟待解决的重要问题。
羧甲基纤维素是以天然纤维素为初始原料，经碱化、醚化反应后生成的一种具有醚结构的纤维素基衍生物，它是一种阴离子型纤维素醚，很容易在水溶液中进行接枝聚合，得到广泛关注。它可作为稳定剂、分散剂、粘合剂、乳化剂、增稠剂、悬浮剂、上浆剂，因此在食品、医药、日化、石油、造纸、纺织、建筑等领域生产中得到广泛应用。
海藻酸钠(SA)是一种由(1,4)-β-D-甘露糖醛酸(M)和(1,4)-α-L-古罗糖醛酸(G)两种结构单元不规则连接而成的线型天然高分子，具有生物相容性好、安全无毒、价格低廉等优点，其结构中的古罗糖醛酸可交联二价或三价金属离子(如Ca2+、Ba2+)，形成具有强度又有弹性的凝胶，针对这种性质，可用于固定性质不稳定物质，提高稳定性，同时可用于固定微生物、细胞、酶等，实现循环利用。但形成的海藻酸钠水凝胶存在力学强度较差，稳定性差，难重复利用，浓度过大时不利于成球问题。
石墨烯(GO)是一种由碳原子紧密堆积成单层二维结构的炭质新材料，氧化石墨烯是石墨烯的一种重要的衍生物，具有很好的纳米片层结构，比表面积较大，表面有大量的羟基和环氧基及边缘处的羰基和羧基，使氧化石墨烯具有很好的亲水性，易与聚合物之间形成化学键或氢键，从而使其在提高聚合物复合材料的各性能方面具有更大的潜力。
申请人发现，如果将易于接枝聚合的羧甲基纤维素与环糊精接枝形成粉末状的环糊精-羧甲基纤维素接枝物，同时利用氧化石墨烯与海藻酸钠复合对接枝物和细菌静息细胞进行包埋固定成凝胶球可以实现环糊精和细胞的高效共循环。目前关于以利用氧化石墨烯与海藻酸钠共混作为载体对环糊精接枝物粉末和细菌静息细胞固定化应用于难溶化合物的生物转化的技术尚未可见。
发明内容：
为了实现上述目的，本发明将提供一种环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，所述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠是将海藻酸钠、环糊精-羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和氧化石墨烯按照一定比例混合均匀后滴入金属离子溶液中成球而制成的。
具体地，上述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠(以下简称β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠)的制备方法如下：
(1)石墨置于硫酸和磷酸体系中，加入高锰酸钾，在超声辅助的情况下制备了氧化石墨烯；
进一步地，超声功率200-800W，超声的时间为2-5h；
(2)取少量氧化石墨烯粉末加入装有适量水的烧杯中，超声分散，将一定量的环糊精-羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和海藻酸钠加到超声分散均匀的氧化石墨烯水溶液中，一定反应温度下搅拌一段时间，静置脱泡；
进一步地，氧化石墨烯占水的0.1％-1％(m:v)；
进一步地，所述海藻酸钠：环糊精-羧甲基纤维素接枝物：氧化石墨烯：细菌静息细胞(离心后湿重)的重量比为1：1-10：0.1-1：1-5；
进一步地，细菌静息细胞湿菌体的离心收集条件为5000rpm，4℃离心10min；
进一步地，反应温度为10-30℃，搅拌时间为0.5-3h；搅拌速度为50-300rpm；
进一步地，环糊精-羧甲基纤维素接枝物的制备方法如下：将环糊精与羧甲基纤维素按质量比1:0.5-5称取，加入2％-15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解；按环氧氯丙烷与氢氧化钠溶液体积比为0.2-1:5加入环氧氯丙烷，20-30℃搅拌1-2h，直至成凝胶状，停止搅拌，升高温度至50-70℃保持2-6h；产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无环糊精；在30-80℃下干燥至恒重，研磨成粉末；
进一步地,所述环糊精和羧甲基纤维素的质量总和在氢氧化钠溶液中的浓度为0.12-0.3g/ml；
(3)用注射器将步骤(2)混合溶液滴入到含有金属阳离子的溶液中，固定一段时间，用反应溶液洗涤，即得β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠；
进一步地，所述金属阳离子选自Ba2+，Ca2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Mn2+，Fe2+中的一种或几种的任意组合；所述金属阳离子浓度为0.1-0.5mol/L；
进一步地，固定时间为1-6h；
进一步地，所述反应溶液为Tris-HCl缓冲液、生理盐水或去离子水。
本发明还提供上述β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠在甾体药物生物催化过程中的应用；
所述应用具体为，在甾体药物生物催化过程中，将所述胶珠作为促溶剂和生物催化剂，按照胶珠质量与反应体系1:1-3(m:v)添加到反应体系中，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠，使用反应溶液洗涤1-10次后，重新用于甾体药物生物催化反应，从而实现环糊精介质和细菌静息细胞的循环利用。
所述细胞多孔胶珠可循环15次左右；
所述反应溶液为Tris-HCl缓冲溶液、生理盐水或去离子水等，pH7.0-pH7.6；
进一步地，所述的环糊精为β-环糊精，HP-β-环糊精,RM-β-环糊精或SBE-β-环糊精；
所述细胞多孔胶珠可通过活化延长循环利用的次数，所述的活化方法具体如下：将催化效率降低的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于金属阳离子溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠，置于4℃冰箱中保存备用。
有益效果：
(1)本发明首次将环糊精-羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和氧化石墨烯与海藻酸钠复合，制备出一种孔径小且规则，孔隙数量多的胶珠，孔隙率更高，比表面积大，传质阻力小，不仅利于环糊精、细胞与底物快速接触，提高了转化速率，缩短了反应周期，而且通过固载，解决了环糊精和细胞的循环利用问题；
并且与现有技术不同的是，由于氧化石墨烯能够与CMC、海藻酸钠形成氢键作用，形成的孔径小且规则，在提高胶珠孔隙率的同时，减小胶珠溶胀，提高其循环利用次数；加入氧化石墨烯后，胶珠的硬度增加，可以抵抗摇瓶的旋转剪切力，利于循环，增加循环次数。
(2)本发明首次实现利用氧化石墨烯改性后的海藻酸钠胶珠固载环糊精-羧甲基纤维素接枝物和细菌静息细胞，实现环糊精介质和细胞的循环应用，在提高甾体催化效率的同时，降低生产成本、减少环境污染，具有很好的应用价值和推广前景。
(3)本发明提供的环糊精接枝物细胞多孔胶珠，对细胞中的酶活性(脱氢酶)起到一定的促进作用，呈现出良好的细胞相容性。经环糊精接枝物多孔胶珠β-CD-CMC-GO固定的简单节杆菌静息细胞其脱氢酶活力呈现增长，酶活力较游离态的对照组能够增加19.1％左右。
(4)本发明所述的环糊精和细菌静息细胞循环利用工艺方法简单便捷，便于实现成本节约。
附图说明：
图1不同种类细胞胶珠的溶胀度；
图2不同种类细胞胶珠的硬度；
图3不同种类细胞胶珠扫描电镜图
其中，(a)β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠表面结构，(b)β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠表面结构，(c)β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠内部结构,(d)β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠内部结构；
图4不同种类细胞胶珠对细菌脱氢酶酶活性的影响；
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
以下将结合具体实施例对本发明所述的技术方案作进一步的说明。
实施例1胶珠性能测定
(1)胶珠制备
SA(海藻酸钠)细菌固定化细胞胶珠的制备方法，准确称取2g的海藻酸钠和3g(5000rpm，4℃离心10min收集的菌体湿重，以下细胞均采用相同方法收集)的简单节杆菌静息细胞缓慢加入100mL去离子水中，在搅拌的条件下形成均匀溶液，然后利用注射器加入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h时间，最后去离子水洗涤收集SA细菌固定化细胞胶珠。
β-CD和CMC接枝物的制备方法如下：将β-环糊精与羧甲基纤维素按质量比1:1各称取5g，加入50mL 7％的氢氧化钠溶液中，30℃搅拌溶解；按环氧氯丙烷与氢氧化钠溶液体积比为1:6.25加入环氧氯丙烷，30℃搅拌1h，直至成凝胶状，停止搅拌，升高温度至60℃保持6h；产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无环糊精；在55℃下干燥至恒重，研磨成粉末(接枝率达到60±2.5μmol/g)。
β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠的制备方法，准确称取2g海藻酸钠、3g的简单节杆菌静息细胞和10gβ-CD-CMC接枝物缓慢加入100mL去离子水中，25℃，100rpm搅拌1h，形成均匀溶液，然后利用注射器注入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h，最后去离子水洗涤收集β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠。
β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的制备方法，准确称取0.2g氧化石墨烯加入100mL去离子水中，超声30min,准确称取2g海藻酸钠、3g的简单节杆菌静息细胞和10gβ-CD-CMC接枝物缓慢加入上述溶液中，25℃，100rpm搅拌1h，形成均匀溶液，静置脱泡，然后利用注射器加入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h，最后去离子水洗涤收集β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠。
(2)溶胀度
将干燥的环糊精接枝物细胞胶珠(W1)浸泡在Tris-HCl缓冲液(pH 7.2)中，测定环糊精接枝物胶珠的溶胀率(SR)。直到溶胀达到平衡，然后过滤分离，用滤纸吸附取出表面水，记录重量为(W2)。记录数据，用公式计算SR。
Figure BDA0002717316590000051
其中W1为环糊精接枝物细胞胶珠的干重，W2为在Tris-HCl缓冲液中溶胀的环糊精接枝物细胞胶珠的重量。
结果如图1所示，图1为不同种类胶珠的溶胀度数据，图中SA beads为纯海藻酸钠-细菌固定化细胞胶珠，β-CD-CMC为不加氧化石墨烯的环糊精接枝物-细菌固定化细胞胶珠，β-CD-CMC-GO为加入氧化石墨烯的环糊精接枝物-细菌固定化细胞胶珠。测试结果为SAbeads的溶胀度为95％±1.2，β-CD-CMC的膨胀度为90％±1.4，β-CD-CMC-GO的溶胀度为69％±1.1。
(3)硬度
用质构分析仪测定了环糊精接枝物胶珠的硬度。详细测试条件:测试前速度3mm/s，测试速度1mm/s，测试后速度1mm/s，压缩度50％，触发力5g，每次选择4颗测试珠，每组测试珠并行测试3次。
结果如图2所示，添加GO后，胶珠的硬度明显上升，溶胀度降低，这两者之前呈现反比关系。GO的加入起到降低胶珠溶胀度，增加胶珠机械强度的作用，从而增加胶珠循环利用次数。
测试结果：SA beads的硬度为643±12g，β-CD-CMC的硬度为651±9g，β-CD-CMC-GO的硬度为747±12g。
(4)扫描电镜
从图3看出，加入GO后，表面和内部均呈现粗糙多孔结构，可能是由于氧化石墨烯与海藻酸钠、羧甲基纤维素钠之前存在氢键作用，形成孔径小且规则，孔隙数量多，孔隙率高，比表面积大的胶珠。这种结构可以减少传质阻力，利于底物进出，进而促进胶珠中的环糊精、细胞与底物接触，加速底物溶解，从而加快初始转化速率，缩短反应周期。并且为固定细胞提供有力条件，减少胶珠中的细胞在循环过程中逸出的机会，从而达到更好地循环转化效果。
(5)对菌体酶活性的影响
对细菌(简单节杆菌)脱氢酶(C1,2位脱氢酶)活性的影响
称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，实验组加入加入10g的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠(实验组)，对照组是9.72g(控制胶珠中环糊精与菌体的量与实验组相同)的β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠、8.75g的纯SA细菌固定化细胞胶珠(控制胶珠中菌体的量与实验组相同)，以及不加任何胶珠(控制菌体的量与实验组相同)的游离细胞空白组。将上述实验组、空白对照组置于34℃、180rpm的摇床中转化30min，HPLC法测试底物初始转化转化速率；以底物初始转化速率的大小反应脱氢酶活力的高低，底物初始转化速率越大，表明细胞的脱氢酶活力越高。
结果如图4所示，在添加等量菌体的条件下，β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初始转化速率是对照组纯SA细菌固定化细胞胶珠(0.65×10-2g/L min-1)的2.97倍，是空白对照组(1.62×10-2g/L min-1)的1.19倍，是对照组接枝等量环糊精的β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠(1.25×10-2g/L min-1)的1.54倍，表明在β-CD-CMC-GO的作用下，细胞脱氢酶活性提高19.1％左右。
另外，有研究表明，单独的β-CD对脱氢酶活性有降低作用(高倩.环糊精结构对简单节杆菌特性的影响[D].天津科技大学,2017.)，本发明提供的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠不仅解决了β-CD带来的细胞毒性问题，而且提高了酶活性。
实施例2:β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠制备及其在醋酸可的松C1,2位脱氢反应中的应用
1、β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的制备：
静息细胞制备：
微生物菌种采用简单节杆菌(Arthrobacter simplex)TCCC 11037，它能实现甾体化合物的C1,2位脱氢转化，将醋酸可的松(CA)转化为醋酸泼尼松；
斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏10，琼脂20，pH7.2；
种子(发酵)培养基(g/L)：葡萄糖10，玉米浆10，蛋白胨5，磷酸二氢钾2.5，pH7.2；
简单节杆菌静息细胞的制备：
TCCC 11037在32℃，160r/min，30/250mL种子培养基条件下培养18h后，按5％接种量接种于装有120mL发酵培养基的500mL摇瓶中，32℃，110r/min条件下培养20h，将发酵培养获得的细胞5000r/min离心后用pH 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，重悬于pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中得简单节杆菌静息细胞菌悬液；使用时5000rpm，4℃离心10min收集湿菌体。
制备β-环糊精-羧甲基纤维素接枝物，5g羧甲基纤维素溶解于50mL 7％NaOH溶液中，加入5gβ-环糊精,待β-环糊精与羧甲基纤维素全部溶解后加入8mL环氧氯丙烷，然后20℃继续搅拌2h，直至成凝胶状，停止搅拌，将其放到60℃下6h。反应结束后产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无β-环糊精。然后放入烘箱中50度烘干研磨成粉末得到β-环糊精-羧甲基纤维素接枝物。
准确称取0.2g氧化石墨烯加入100mL去离子水中，超声30min，准确称取2g海藻酸钠、3g的简单节杆菌静息细胞和5gβ-CD-CMC接枝物缓慢加入上述溶液中，25℃，100rpm搅拌1h形成均匀溶液，静置脱泡，在磁力搅拌下，利用注射器加入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h，获得直径为3-5mm的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存。
2、生物转化
生物转化体系
称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，实验组加入10g上述步骤制备的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠(接枝的β-环糊精量为0.1912g)，对照组是接枝等量环糊精/菌体的β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA细菌固定化细胞胶珠(β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和SA细菌固定化细胞胶珠的制备参见实施例1)，34℃、180r/min转化10h，HPLC法测试底物转化率；
环糊精和细胞的循环利用工艺；
将β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，用量为每次每克胶珠50mL，洗涤后重新用于醋酸可的松生物催化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
每循环10次后，将细胞多孔胶珠进行活化，步骤如下：
将回收的β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；
培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用Tris-HCl(pH 7.2)将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定2h，洗涤收集胶珠，再次用于CA的生物催化反应；
结果表明：纯SA细菌固定化细胞胶珠对照组的初次转化率为81％，β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为94％，β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA细菌固定化细胞胶珠在循环利用过程中机械强度差，在循环5次后再次固定，其机械强度仍抵抗不了摇床的剪切力，导致十次后两种胶珠破裂，无法再次循环。β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为95％，循环10次后进行再固定，仍能继续使用5次，其循环次数能达到15次。β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初始转化速率是对照组纯SA细菌固定化细胞胶珠(0.65×10-2g/L min-1)的2.97倍，是对照组接枝等量环糊精的β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠(1.25×10-2g/L min-1)的1.54倍，循环利用15次，CA的最终转化率为91％，见表1-3。
表1β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠
Figure BDA0002717316590000081
表2β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 94％ 93％ 92％ 91％ 92％ 91％ 90％ 90％ 90％ 89％
表3纯SA细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 81％ 80％ 81％ 80％ 81％ 79％ 80％ 80％ 79％ 78％
实施例3:HP-β-环糊精接枝物细菌固定化细胞胶珠制备及其在醋酸可的松C1,2位脱氢反应中的应用
除以下内容外，其他同实施例2。
1、HP-β-环糊精接枝物细菌固定化细胞胶珠(HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠)的制备：
制备羧甲基纤维素-HP-β-环糊精接枝物，5g羧甲基纤维素溶解于50mL 7％NaOH溶液中，加入7g HP-β-环糊精,待HP-β-环糊精与羧甲基纤维素全部溶解后加入8mL环氧氯丙烷，然后25℃继续搅拌1.5h，直至成凝胶状，停止搅拌，将其放到70℃下5h。反应结束后产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无HP-β-环糊精。然后放入烘箱中60度烘干研磨成粉末得到HP-β-环糊精-羧甲基纤维素接枝物。
准确称取0.2g氧化石墨烯加入100mL去离子水中，超声30min，准确称取2g海藻酸钠、3g的简单节杆菌静息细胞和6g HP-β-CD-CMC接枝物缓慢加入上述溶液中，25℃，200rpm搅拌2h形成均匀溶液，在磁力搅拌下，利用注射器加入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h，获得直径为3-5mm的细胞多孔胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存。
2、生物转化
称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，实验组加入8g上述步骤制备的HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠(接枝的HP-β-环糊精量为0.062g)，对照组是接枝等量HP-β-环糊精/菌体的HP-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA细菌固定化细胞胶珠，34℃、180r/min转化10h，HPLC法测试底物转化率；
环糊精和细胞的循环利用工艺；
将细胞多孔胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集细胞多孔胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，用量为每次每克细胞胶珠50mL，洗涤后重新用于醋酸可的松生物催化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
每循环10次后，将细胞多孔胶珠进行活化，步骤如下：
将回收的HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；
培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用Tris-HCl(pH 7.2)将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定2h，洗涤收集胶珠，再次用于CA的生物催化反应；
结果表明：纯SA细菌固定化细胞胶珠对照组的初次转化率为81％，HP-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为93％，HP-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA细菌固定化细胞胶珠在循环利用过程中机械强度差，在循环5次后再次固定，其机械强度仍抵抗不了摇床的剪切力，导致十次后两种胶珠破裂，无法再次循环。HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为95％，循环10次后进行再固定，仍能继续使用5次，其循环次数能达到15次。HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初始转化速率是对照组纯SA细菌固定化细胞胶珠(0.65×10-2g/L min-1)的2.7倍，是对照组接枝等量环糊精的HP-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠(1.15×10-2g/L min-1)的1.51倍，循环利用15次，CA的最终转化率为90％，见表4-6。
表4HP-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠
Figure BDA0002717316590000091
表5HP-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 93％ 92％ 93％ 92％ 91％ 90％ 91％ 90％ 90％ 89％
表6纯SA细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 81％ 80％ 81％ 80％ 81％ 79％ 80％ 80％ 80％ 78％
实施例4:RM-β-环糊精接枝物细菌固定化细胞胶珠制备及其在醋酸可的松C1,2位脱氢反应中的应用
除以下内容外，其他同实施例2。
1、RM-β-环糊精接枝物-细菌固定化细胞胶珠(RM-β-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠)的制备：
制备羧甲基纤维素-RM-β-环糊精接枝物，5g羧甲基纤维素溶解于50mL 7％NaOH溶液中，加入9g RM-β-环糊精，待RM-β-环糊精与羧甲基纤维素全部溶解后加入8mL环氧氯丙烷，然后25℃继续搅拌2h，直至成凝胶状，停止搅拌，将其放到50℃下4h。反应结束后产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无RM-β-环糊精。然后放入烘箱中80℃烘干研磨成粉末得到RM-β-环糊精-羧甲基纤维素接枝物。
准确称取0.2g氧化石墨烯加入100mL去离子水中，超声30min，准确称取2g海藻酸钠、3g的简单节杆菌静息细胞和6.5g RM-β-CD-CMC接枝物缓慢加入上述溶液中，25℃，150rpm搅拌1h形成均匀溶液，静置脱泡，在磁力搅拌下，利用注射器加入0.25mol/L的CaCl2溶液中固定2h，获得直径为3-5mm的细胞多孔胶珠，用Tris-HCl缓冲液洗涤胶珠，重悬于上述缓冲液中，置于4℃冰箱中保存。
2、生物转化
称取0.06g的CA于100mL三角瓶中，加入20mL的Tris-HCl(pH 7.2)，实验组加入12g上述步骤制备的RM-β-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠(接枝的RM-β-环糊精量为0.1213g)，对照组是接枝等量RM-β-CD/菌体的RM-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA细菌固定化细胞胶珠，34℃、180r/min转化10h，HPLC法测试底物转化率；
环糊精和细胞的循环利用工艺；
将细胞多孔胶珠用于上述CA的生物催化反应，反应结束后收集细胞多孔胶珠，将其用Tris-HCl(pH 7.2)洗涤3次，用量为每次每克细胞胶珠50mL，洗涤后重新用于醋酸可的松生物催化，用量不变，HPLC法测定每次循环后的底物转化率；
每循环10次后，将细胞多孔胶珠进行活化，步骤如下：
将回收的RM-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；
培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用Tris-HCl(pH 7.2)将胶珠洗涤干净后，将其置于CaCl2溶液中再次固定2h，洗涤收集胶珠，再次用于CA的生物催化反应；
结果表明：纯SA细菌固定化细胞胶珠对照组的初次转化率为81％，RM-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为93％，RM-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠和纯SA-细菌固定化细胞胶珠在循环利用过程中机械强度差，在循环5次后再次固定，其机械强度仍抵抗不了摇床的剪切力，导致十次后两种胶珠破裂，无法再次循环。RM-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初次转化率为96％，循环10次后进行再固定，仍能继续使用5次，其循环次数能达到15次。RM-β-CD-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠的初始转化速率是对照组纯SA细菌固定化细胞胶珠(0.65×10-2g/L min-1)的2.84倍，是对照组接枝等量环糊精的RM-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠(1.35×10-2g/L min-1)的1.37倍，循环利用15次，CA的最终转化率为91％，见表7-9。
表7RM-β-CMC-GO细菌固定化细胞胶珠
Figure BDA0002717316590000111
表8RM-β-CD-CMC细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 93％ 93％ 92％ 91％ 91％ 92％ 91％ 90％ 91％ 89％
表9纯SA细菌固定化细胞胶珠
循环次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
转化率 81％ 80％ 81％ 80％ 81％ 79％ 80％ 79％ 79％ 78％
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权力要求为准。

Claims (12)

1.一种环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，特征在于，所述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠是将海藻酸钠、环糊精-羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和氧化石墨烯按比例在水中混合均匀后滴入金属离子溶液中成球而制成的。
2.如权利要求1所述的一种环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，其特征在于，所述海藻酸钠：环糊精-羧甲基纤维素接枝物：氧化石墨烯：细菌静息细胞的重量比为1：1-10：0.1-1：1-53。
3.如权利要求2所述的一种环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，其特征在于，氧化石墨烯占水的0.1％-1％。
4.权利要求1-3任意一项所述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠的制备方法，特征在于，步骤如下：
(1)取氧化石墨烯粉末加入装有水的烧杯中，超声分散，将环糊精-羧甲基纤维素接枝物、细菌静息细胞和海藻酸钠加到超声分散均匀的氧化石墨烯水溶液中，搅拌反应，静置脱泡；
(2)用注射器将步骤(1)混合溶液滴入到含有金属阳离子的溶液中，固定后，用反应溶液洗涤，即得环糊精接枝物多孔胶珠。
5.如权利要求4所述的制备方法，特征在于，步骤(1)反应温度为10-30℃，搅拌时间为0.5-3h；搅拌速度为50-300rpm。
6.如权利要求4所述的制备方法，特征在于，环糊精-羧甲基纤维素接枝物的制备方法如下：按环糊精与羧甲基纤维素按质量比1:0.5-5称取，加入2％-15％的氢氧化钠溶液中，搅拌溶解；按环氧氯丙烷与氢氧化钠溶液体积比为0.2-1:5加入环氧氯丙烷，搅拌直至成凝胶状，停止搅拌，升高温度至50-70℃保持2-6h；产物用大量蒸馏水和乙醇交替洗涤，直至洗出液为中性，并且至洗出液中无环氧氯丙烷及无环糊精；干燥至恒重，研磨成粉末。
7.如权利要求6所述的制备方法，特征在于，所述环糊精和羧甲基纤维素的质量总和在氢氧化钠溶液中的浓度为0.12-0.3g/ml。
8.如权利要求4所述的制备方法，特征在于，所述金属阳离子选自Ba2+，Ca2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Mn2+，Fe2+中的一种或几种的任意组合；所述金属阳离子浓度为0.1-0.5mol/L；固定时间为1-6h。
9.权利要求1-3任意一项所述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠在甾体药物生物催化过程中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，具体为，在甾体药物生物催化过程中，将所述环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠作为促溶剂和生物催化剂，按照胶珠质量与反应体系体积1:1-3添加到反应体系中，反应结束后，进行过滤，滤液用于收集反应产物，过滤物即环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，使用反应溶液洗涤1-10次后，重新用于甾体药物生物催化反应，实现环糊精介质的循环利用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述多孔胶珠可通过再次固定延长循环利用的次数，所述的固定方法具体如下：将催化效率降低的多孔胶珠胶珠10g，投入到30mL发酵培养基进行活化，160r/min，32℃的摇床下振荡培养20h；
所述的发酵培养基为发酵培养菌体时使用的培养基；
培养结束后将发酵液过滤得到胶珠，用反应溶液将胶珠洗涤干净后，将其置于金属阳离子溶液中再次固定2h，反应溶液洗涤收集胶珠，置于4℃冰箱中保存备用。
12.如权利要求1所述的一种环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠，其特征在于，所述的环糊精为β-环糊精，HP-β-环糊精,RM-β-环糊精或SBE-β-环糊精。
CN202011078499.XA 2020-10-10 2020-10-10 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用 Pending CN112080490A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011078499.XA CN112080490A (zh) 2020-10-10 2020-10-10 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011078499.XA CN112080490A (zh) 2020-10-10 2020-10-10 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112080490A true CN112080490A (zh) 2020-12-15

Family

ID=73730152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011078499.XA Pending CN112080490A (zh) 2020-10-10 2020-10-10 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112080490A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231517A (zh) * 2021-12-06 2022-03-25 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法及其产品和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105384943A (zh) * 2015-11-05 2016-03-09 江苏大学 β-环糊精-纤维素-氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用
CN107022542A (zh) * 2017-06-15 2017-08-08 天津科技大学 海藻酸钠接枝衍生环糊精固定化细胞及其应用
CN108276589A (zh) * 2018-01-11 2018-07-13 浙江农林大学 一种改性环糊精聚合物水凝胶的制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105384943A (zh) * 2015-11-05 2016-03-09 江苏大学 β-环糊精-纤维素-氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用
CN107022542A (zh) * 2017-06-15 2017-08-08 天津科技大学 海藻酸钠接枝衍生环糊精固定化细胞及其应用
CN108276589A (zh) * 2018-01-11 2018-07-13 浙江农林大学 一种改性环糊精聚合物水凝胶的制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNJIE YUAN等: "Synthesis and characterization of β-cyclodextrin-carboxymethyl cellulose-graphene oxide composite materials and its application for removal of basic fuchsin", JOURNAL OF THE IRANIAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 14, pages 1 - 5 *
周婷婷;李楠;: "羧甲基纤维素/β-环糊精水凝胶的制备", 山东化工, no. 17 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231517A (zh) * 2021-12-06 2022-03-25 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法及其产品和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ullah et al. Synthesis, structure, and properties of bacterial cellulose
Liyaskina et al. Nanomaterials from bacterial cellulose for antimicrobial wound dressing
CN107753949B (zh) 黑磷纳米片、复合水凝胶及其制备方法与应用
CN107022542B (zh) 海藻酸钠接枝衍生环糊精固定化细胞及其应用
Kim et al. Bacterial cellulose-chitosan composite hydrogel beads for enzyme immobilization
CN106399422B (zh) 一种细菌纤维素的制备方法
Prabhu et al. Immobilization of carbonic anhydrase enriched microorganism on biopolymer based materials
US10538734B2 (en) Composition for embedded microbial culture
JP6441680B2 (ja) グラム陽性菌の微生物培養のためのマトリックス及び組成物
CN113501994B (zh) 一种柔韧性菌丝体材料及其制备方法
CN108273496B (zh) 一种基于细菌纤维素的仿生酶的制备方法及其应用
Zhang et al. A novel Poly (vinyl alcohol)/carboxymethyl cellulose/yeast double degradable hydrogel with yeast foaming and double degradable property
CN111672432A (zh) 用于酶固定化的氧化石墨烯/壳聚糖复合气凝胶的制备方法
CN112080490A (zh) 环糊精接枝物-细菌固定化细胞多孔胶珠及其应用
Al-Hassan et al. Non-porous magnetic supports for cell immobilization
CN109402106B (zh) 一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法及其应用
CN107164360B (zh) 海藻酸钠接枝天然环糊精固定化细胞及其应用
CN111303491B (zh) 细菌纤维素/聚合多巴胺复合纳米材料的制备方法
Choi et al. Properties of bacterial cellulose produced in a pilot-scale spherical type bubble column bioreactor
CN111606316B (zh) 一种过渡金属单原子碳材料的生物富集制备方法
CN112342210B (zh) 环糊精接枝物多孔胶珠及其在甾体转化中的应用
CN107236779B (zh) 一种真菌催化甾体生物转化的方法
CN109575322B (zh) 环糊精接枝物复合胶珠及其在生物转化中的应用
CN112080489A (zh) 环糊精接枝物-真菌固定化细胞多孔胶珠及其应用
CN106938841B (zh) 单分散羧基化胶体碳纳米颗粒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination