CN109402106B - 一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙烯醇‑纤维素固定克雷伯氏菌的方法及其应用。本发明将少量预处理的纤维素，即再生纤维素添加到聚乙烯醇与菌体的包埋液中，通过改变聚乙烯醇与饱和硼酸的反应环境，利用纤维素去除多余的亲水羟基，让固定化颗粒的内部结构更加稳定，能够很好的改善固定化颗粒粘连、溶胀等问题；同时，在添加再生纤维素后，固定化颗粒的机械强度得到进一步提升，内部结构也更加致密稳定。本发明在细菌包埋体内部添加再生纤维素溶液，构成一种新的包埋体，改变聚乙烯醇与饱和硼酸的交联状况，实现了快速交联，同时能够在发酵培养基中进行发酵，生产1,3‑丙二醇。

Description

一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法及其应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

与传统的游离细胞发酵相比，固定化细胞发酵有利于细胞的重复使用，可以节省细胞的培养时间，缓解产物对细胞的反馈抑制，同时由于将微生物固定于一定载体内，细胞不易随发酵液流失，还可以有效提高发酵罐内的细胞浓度，提高发酵效率。传统的聚乙烯醇-硼酸交联细菌包埋方法是一种操作简单且成本低廉的固定方法，通过这种方法生产的固定化颗粒，机械强度高，生物相容性好，广泛应用于水处理领域。但是，在生物发酵过程中，固定化颗粒的吸水性很强，使用过程中会出现相互粘连，体积膨胀以及溶解在发酵培养基中的现象。固定化颗粒的这些问题是由于聚乙烯醇与饱和硼酸发生交联反应时，硼酸中的3个羟基只有2个参加了该反应，所以在固定化颗粒中就会保留亲水基团羟基，而造成这些问题的主要原因是聚乙烯醇中的羟基未与饱和硼酸完全反应。

目前，针对这一缺点，很多研究学者通过添加活性炭，琼脂，高岭土，海藻酸钠等物质来进行改性，这些添加剂对于解决溶胀问题有一定的作用。中国专利文献CN103194437A公开了一种聚乙烯醇-硼酸二次交联完成细菌固定化的方法，利用二次交联调pH的方法解决聚乙烯醇-硼酸法所制备的颗粒相互粘连，体积膨胀，水稳定性降低和细菌保护等问题，虽然经过硼酸强化后的聚乙烯醇在使用过程中，粘连、水溶膨胀性都大大降低，但是仍无法满足固定化颗粒用于生物发酵的要求。中国专利文献CN101519675A提供了一种改进的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，将聚乙烯醇和海藻酸钠于沸水浴加热共溶于水，与米根霉孢子悬液混合，将混合液滴入含有3-5％氯化钙的饱和硼酸溶液中，同时不停搅拌，使颗粒成球形，好的固定化颗粒于低温下硬化，然后用磷酸二氢钠溶液浸泡处理，然后用水洗涤除去颗粒内生成的海藻酸钙，得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵。该方法是对常规的聚乙烯醇-硼酸固定化米根霉方法的改进，但是还是会存在固定化颗粒黏连、溶胀等问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，该方法能改善固定化颗粒粘连、溶胀等问题，所得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的内部结构致密稳定、机械强度好。同时，能够在发酵培养基中进行发酵，用于生产1,3-丙二醇。

本发明还提供了按照上述方法得到的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵生产1,3-丙二醇中的应用。

术语说明：

常温：具有本领域公知的含义，一般在25±2℃；

克雷伯氏菌：为革兰氏阴性菌，为较短粗的杆菌，大小0.5～0.8×1～2um，能够用于发酵生产1.3-丙二醇。本发明使用的克雷伯氏菌种为Klebsiella pneumoniae，可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买。

本发明的技术方案如下：

一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，步骤如下：

(1)聚乙烯醇-纤维素包埋液的制备

将克雷伯氏菌液加入质量分数为8～12％的聚乙烯醇溶液中，所述克雷伯氏菌液的加量是聚乙烯醇溶液体积的8～10％，搅拌均匀得混合溶液；取纤维素原料经纤维素预处理得再生纤维素溶液，加入上述混合溶液中，所述再生纤维素溶液的加量为所述混合溶液质量的3～7％，混合均匀得聚乙烯醇-纤维素包埋液；

(2)一次交联

将步骤(1)得到的聚乙烯醇-纤维素包埋液滴入饱和硼酸水溶液中进行第一次交联，第一次交联时间为1～2h，过滤得清液和一次交联产物；

(3)二次交联

取步骤(2)清液调节pH为6.5～7.0，加入到步骤(2)的一次交联产物中，搅拌均匀后静置，进行第二次交联，第二次交联时间为8～12h，过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗3～4次，即得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述聚乙烯醇溶液是将聚乙烯醇加热溶于水中，并冷却至30～37℃，其中聚乙烯醇重均分子量为3.5-17万。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述克雷伯氏菌液按照本领域常规方法培养得到，调整其OD₆₀₀为2～3。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述克雷伯氏菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC 1.10612、CGMCC 1.10617或CGMCC 1.12040。

根据本发明优选的，步骤(1)中所述纤维素预处理的步骤为：于20-30℃温度下，取纤维素原料分散于含尿素的碱性溶液中得分散系；其中，所述碱性溶液中NaOH、尿素、去离子水的质量比为5～9：10～15：75～83，纤维素原料质量为所述碱性溶液质量的3～5％；将得到的分散系经冷冻、解冻后搅拌均匀，离心取上清，得再生纤维素溶液。

进一步优选的，所述纤维素原料为粉状纤维素，其中α-纤维素的含量≥95％。

进一步优选的，所述碱性溶液中NaOH、尿素、去离子水的质量比为7：12：81。

进一步优选的，所述冷冻为在-20～-15℃静置20～30h。

进一步优选的，所述离心的条件为：7000～10000rpm离心5～15min。

根据本发明优选的，步骤(2)中聚乙烯醇-纤维素包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：4～6。

根据本发明优选的，步骤(3)中所述清液调节pH为7.0。

根据本发明优选的，步骤(2)、步骤(3)中所述交联均在常温下进行。

本发明还提供一种按照上述方法得到的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

按照上述方法得到的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵生产1,3-丙二醇中的应用。

根据本发明优选的，上述应用，包括上述聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，还包括聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵生产1,3-丙二醇中的应用，步骤如下：

i)发酵培养基的配制

发酵培养基：甘油50.0g；(NH₄)₂SO₄ 6.6g；NaH₂PO₄ 1.38g；Na₂SO₄ 0.28g；KCl0.75g；MgCl₂·6H₂O 0.26g；CaCl₂·2H₂O 0.29g；酵母浸粉1.0g；柠檬酸0.42g；微量元素溶液5mL；蒸馏水1L；

其中，微量元素溶液：CuCl₂·2H₂O 0.17g；MnCl₂·4H₂O 2.0g；ZnCl₂·6H₂O 0.68g；H₃BO₃ 0.06g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g；CoCl₂·6H₂O 0.47g；FeCl₃·6H₂O 5.4g；蒸馏水1L；

培养基用KOH溶液调节pH至7.0，121℃灭菌20min待用；

ii)厌氧发酵

取步骤i)配制好的发酵培养基100mL，置于100mL厌氧发酵瓶中，将制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒加入厌氧发酵瓶，加量为厌氧发酵瓶体积的3/4，以上操作均在超净台中完成；然后将其放入37℃的恒温培养箱中进行第一批次发酵，发酵时间为3～4d；

iii)半连续发酵

步骤ii)第一批次发酵结束后，取出发酵液，再取100mL步骤i)配制的发酵培养基倒入该含有聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的厌氧发酵瓶中，进行第二批次发酵，发酵条件与步骤ii)相同；并按照上述操作依次进行半连续发酵。根据对不同批次发酵液中1.3-丙二醇的含量进行检测，发现均有1.3-丙二醇产生。

本发明的技术特点及有益效果：

1.本发明以纤维素为原料制备再生纤维素，纤维素是地球上数量最丰富、最低廉的高分子材料，本发明将少量预处理的纤维素，即再生纤维素添加到聚乙烯醇与菌体的包埋液中，通过改变聚乙烯醇与饱和硼酸的反应环境，利用纤维素去除多余的亲水羟基，让固定化颗粒的内部结构更加稳定，能够很好的改善固定化颗粒粘连、溶胀等问题；同时，在添加再生纤维素后，固定化颗粒的机械强度得到进一步提升，内部结构也更加致密稳定。

2.本发明在细菌包埋体内部添加再生纤维素溶液，构成一种新的包埋体，改变聚乙烯醇与饱和硼酸的交联状况，9～14h即可完成交联，相比于现有技术中9～50h的交联相比，实现了快速交联，还减少固定化颗粒的亲水羟基，避免了固定化颗粒之间的交联，有效减少固定化颗粒在水中的粘连和体积膨胀，同时能够在发酵培养基中进行发酵，生产1,3-丙二醇。

3.本发明中的菌体在聚乙烯醇和纤维素的共同包埋下，缩短了菌体在饱和硼酸水溶液中的作用时间，大大减少了固定化过程对于菌体的伤害。

4.本发明将再生纤维素溶液加入到聚乙烯醇溶液中，利用二次交联的方法所制备的固定化颗粒机械强度更好，韧性更强，水稳定性更高，使用寿命更长，将其应用于发酵生产可以大大减少发酵时间，增加1.3-丙二醇产量，该法操作简单且成本低廉，有利于工业化生产，具有较好的社会、经济效益，利于推广。

附图说明

图1为固定化克雷伯氏菌颗粒扫描电子显微镜图；

图中，a为聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒外观(×300)，b为聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒内部结构图(×5000)，c为聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒内部结构图(×5000)；

图2为实施例1和对比例的固定化克雷伯氏菌颗粒第一批次发酵后的外观图；

图中，a为对比例制备的聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒，b为实施例1制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒；

图3为实施例2和实施例3的固定化克雷伯氏菌颗粒第一批次发酵后的外观图；

图中，a为实施例2制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒，b为实施例3制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

具体实施方式

下一步结合实例要求对本发明作进一步具体描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。

若无特殊说明，实施例中涉及的药品为普通市售产品。

纤维素原料购自酷尔化学试剂公司；

实施例中的克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，为中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC 1.10612。

实施例1

一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，步骤如下：

a)纤维素预处理

于25℃温度下，称取NaOH、尿素溶于去离子水中，得碱性溶液，其中NaOH、尿素、去离子水的质量比为7:12:81，再取α-纤维素含量≥95％的纤维素原料粉末经烘干后分散于上述碱性溶液中得分散系，纤维素原料质量为碱性溶液质量的5％，将上述分散系置于-20℃冷冻24h加速溶解，解冻后搅拌均匀，8000rpm离心10min，取上清即得再生纤维素溶液，-4℃保存备用；

b)聚乙烯醇、再生纤维素与菌液混合

称取聚乙烯醇(重均分子量为75000)加热溶解于水中，冷却至37℃，得聚乙烯醇溶液，其质量分数为12％；按照常规方法培养得克雷伯氏菌培养液，离心收集菌体，经磷酸缓冲液(NaH₂PO₄ 0.02M，Na₂HPO₄ 0.02M，pH 7.0)洗涤后重悬，调整菌液的OD₆₀₀为2.5，将克雷伯氏菌液加入聚乙烯醇溶液中，加量为聚乙烯醇溶液体积的10％，搅拌均匀得混合溶液；再加入步骤a)处理得到的再生纤维素溶液，加量为混合溶液质量的5％，混合均匀后即得聚乙烯醇-纤维素包埋液；

c)一次交联

将步骤b)得到的聚乙烯醇-纤维素包埋液倒入去掉针头的针筒中，滴入在常温下磁力搅拌的饱和硼酸水溶液中，所述聚乙烯醇-纤维素包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：5，进行第一次交联，第一次交联时间为1h，交联完成后过滤得清液和一次交联产物；

d)二次交联

取步骤c)清液调节pH为7.0，将调节pH后的清液加入到步骤c)一次交联产物中，搅拌均匀后常温静置，进行第二次交联，第二次交联时间为8h，第二次交联结束后过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗4次，即得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

实施例2

一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，步骤如下：

a)纤维素预处理

于23℃温度下，称取NaOH、尿素溶于去离子水中，得碱性溶液，其中NaOH、尿素、去离子水的质量比为7:12:81，再取α-纤维素含量≥95％的纤维素原料粉末经烘干后分散于上述碱性溶液中得分散系，纤维素原料质量为碱性溶液质量的5％，将上述分散系置于-20℃冷冻24h加速溶解，解冻后搅拌均匀，8000rpm离心10min，取上清即得再生纤维素溶液，-4℃保存备用；

b)聚乙烯醇、再生纤维素与菌液混合

称取聚乙烯醇(重均分子量为75000)加热溶解于水中，冷却至37℃，得聚乙烯醇溶液，其质量分数为12％；按照常规方法培养得克雷伯氏菌培养液，离心收集菌体，经磷酸缓冲液(NaH₂PO₄ 0.02M，Na₂HPO₄ 0.02M，pH 7.0)洗涤后重悬，调整菌液的OD₆₀₀为2.3，将克雷伯氏菌液加入聚乙烯醇溶液，加量为聚乙烯醇溶液体积的10％，搅拌均匀得混合溶液；再加入步骤a)处理得到的再生纤维素溶液，加量为混合溶液质量的6％，混合均匀后即得聚乙烯醇-纤维素包埋液；

c)一次交联

将步骤b)得到的聚乙烯醇-纤维素包埋液倒入去掉针头的针筒中，滴入在常温下磁力搅拌的饱和硼酸水溶液中，所述聚乙烯醇-纤维素包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：5，进行第一次交联，第一次交联时间为1h，交联完成后过滤得清液和一次交联产物；

d)二次交联

取步骤c)清液调节pH为6.5，将调节pH后的清液加入到步骤c)一次交联产物中，搅拌均匀后常温静置，进行第二次交联，第二次交联时间为10h，第二次交联结束后过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗3次，即得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

实施例3

一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，步骤如下：

a)纤维素预处理

于23℃温度下，称取NaOH、尿素溶于去离子水中，得碱性溶液，其中NaOH、尿素、去离子水的质量比为7:12:81，再取α-纤维素含量≥95％的纤维素原料粉末经烘干后分散于上述碱性溶液中得分散系，纤维素原料质量为碱性溶液质量的5％，将上述分散系置于-20℃冷冻24h加速溶解，解冻后搅拌均匀，8000rpm离心10min，取上清即得再生纤维素溶液，-4℃保存备用；

b)聚乙烯醇、再生纤维素与菌液混合

称取聚乙烯醇(重均分子量为75000)加热溶解于水中，冷却至37℃，得聚乙烯醇溶液，其质量分数为12％；按照常规方法培养得克雷伯氏菌培养液，离心收集菌体，经磷酸缓冲液(NaH₂PO₄ 0.02M，Na₂HPO₄ 0.02M，pH 7.0)洗涤后重悬，调整菌液的OD₆₀₀为2.3，将克雷伯氏菌液加入聚乙烯醇溶液，加量为聚乙烯醇溶液体积的10％，搅拌均匀得混合溶液；再加入步骤a)处理得到的再生纤维素溶液，加量为混合溶液质量的7％，混合均匀后即得聚乙烯醇-纤维素包埋液；

c)一次交联

将步骤b)得到的聚乙烯醇-纤维素包埋液倒入去掉针头的针筒中，滴入在常温下磁力搅拌的饱和硼酸水溶液中，所述聚乙烯醇-纤维素包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：5，进行第一次交联，第一次交联时间为1h，交联完成后过滤得清液和一次交联产物；

d)二次交联

取步骤c)清液调节pH为6.5，将调节pH后的清液加入到步骤c)一次交联产物中，搅拌均匀后常温静置，进行第二次交联，第二次交联时间为10h，第二次交联结束后过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗3次，即得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

对比例

一种聚乙烯醇固定克雷伯氏菌的方法，与实施例1不同的是，不添加纤维素进行固定化，步骤如下：

1)聚乙烯醇与菌液混合

称取聚乙烯醇(重均分子量为75000)加热溶解于水中，冷却至37℃，得聚乙烯醇溶液，其质量分数为12％；按照常规方法培养得克雷伯氏菌培养液，离心收集菌体，经磷酸缓冲液(NaH₂PO₄ 0.02M，Na₂HPO₄ 0.02M，pH 7.0)洗涤后重悬，调整菌液的OD₆₀₀为2.5，将克雷伯氏菌液加入聚乙烯醇溶液，加量为聚乙烯醇溶液体积的10％，搅拌均匀即得聚乙烯醇包埋液。

2)一次交联

将步骤1)得到的聚乙烯醇包埋液倒入去掉针头的针筒中，滴入在常温下磁力搅拌的饱和硼酸水溶液中，所述聚乙烯醇包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：5，进行第一次交联，第一次交联时间为1h，交联完成后过滤得清液和一次交联产物；

3)二次交联

取步骤2)清液调节pH为7.0，将调节pH后的清液加入到步骤2)一次交联产物中，搅拌均匀后常温静置，进行第二次交联，第二次交联时间为8h，第二次交联结束后过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗4次，即得聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒。

实验例1

取实施例1和对比例制备的固定化克雷伯氏菌颗粒，对两者的致密性、机械强度、韧性及溶胀情况进行检测与对比。

致密性：将两种固定化克雷伯氏菌颗粒在室温下进行干燥处理，干燥后采用扫描电镜观察其结构及内部空间结构，结果如图1所示，聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒微球的内部结构相比聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒微球更加稳定且致密。

机械强度：利用挤压法，取等量的固定化克雷伯氏菌颗粒放入针管中，进行挤压，聚乙烯醇-纤维素固定化颗粒和聚乙烯醇固定化颗粒在相等时间内挤压到相同体积处时，聚乙烯醇-纤维素固定化颗粒的用力情况要明显，因此确定聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的机械强度高于聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒的机械强度。

韧性：利用挤压法，取等量的固定化克雷伯氏菌颗粒放入针管中，进行挤压，看固定化克雷伯氏菌颗粒的恢复情况，经过比较，聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒的形状受压后只能恢复原有形状的1/4，但是聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的形状受压后能恢复其原有形状的3/4，韧性较好。

溶胀情况：分别取等量(W₁)的固定化克雷伯氏菌颗粒，将其浸泡于0.9％的生理盐水中，分别在浸泡15min,30min,45min,60min,75min,90min时取出微球，擦干微球表面的水分，再进行称重(W₂)，按照以下公式计算溶胀率：

测得在60min时两种固定化克雷伯氏菌颗粒的溶胀率达到峰值，聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒的溶胀率为101％，聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的溶胀率为125.6％，说明聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵过程中，固定化颗粒的孔隙增加，达到释放产物的效果也会更好。

实验例2

取实施例1和对比例制备的固定化克雷伯氏菌颗粒发酵生产1,3-丙二醇，步骤如下：

i)发酵培养基的配制

发酵培养基：甘油50.0g；(NH₄)₂SO₄ 6.6g；NaH₂PO₄ 1.38g；Na₂SO₄ 0.28g；KCl0.75g；MgCl₂·6H₂O 0.26g；CaCl₂·2H₂O 0.29g；酵母浸粉1.0g；柠檬酸0.42g；微量元素溶液5mL；蒸馏水1L；

其中，微量元素溶液：CuCl₂·2H₂O 0.17g；MnCl₂·4H₂O 2.0g；ZnCl₂·6H₂O 0.68g；H₃BO₃ 0.06g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g；CoCl₂·6H₂O 0.47g；FeCl₃·6H₂O 5.4g；蒸馏水1L；

培养基用2.5mol/L的KOH溶液调节pH至7.0，121℃灭菌20min待用；

ii)厌氧发酵

取步骤i)配制好的发酵培养基100mL，置于100mL厌氧发酵瓶中，将实施例1和对比例制备的固定化克雷伯氏菌颗粒分别加入厌氧发酵瓶，加量为厌氧发酵瓶体积的3/4，以上操作均在超净台中完成，然后将其放入37℃的恒温培养箱中进行第一批次的发酵，发酵时间为3d；

iii)半连续发酵

第一批次发酵结束后，取出发酵液，再取100mL步骤i)配制的发酵培养基分别倒入该含有不同固定化克雷伯氏菌颗粒的厌氧发酵瓶中，进行第二批次的发酵，操作方式与步骤ii)相同；按照上述操作方法依次进行6批次发酵。

第一批次发酵结束后两种固定化克雷伯氏菌颗粒状态如图2所示，可以看出对比例制备的聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒发生了严重的粘连和溶胀，而实施例1制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒仍然保持较完整的颗粒状态。

根据发酵结果比较：在第一批次发酵的过程中，对比例制备的聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵培养基中发生了粘连且粘连较为严重，而实施例1制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵过程中，几乎未有粘连情况发生；通过半连续发酵工艺，在6个批次的发酵液中，聚乙烯醇固定化克雷伯氏菌颗粒生产1.3-丙二醇的平均产量为40.28g/L，最高产量为第二批次，为45.01g/L；聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒生产1.3-丙二醇的平均产量为52.25g/L，最高产量为第二批次，为62.72g/L。

实验例3

取实施例2和实施例3制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒发酵生产1,3-丙二醇，步骤如下：

i)发酵培养基的配制

发酵培养基：甘油50.0g；(NH₄)₂SO₄ 6.6g；NaH₂PO₄ 1.38g；Na₂SO₄ 0.28；KCl 0.75；MgCl₂·6H₂O 0.26g；CaCl₂·2H₂O 0.29g；酵母浸粉1.0g；柠檬酸0.42g；微量元素溶液5mL；蒸馏水1L；

其中，微量元素溶液：CuCl₂·2H₂O 0.17g；MnCl₂·4H₂O 2.0g；ZnCl₂·6H₂O 0.68g；H₃BO₃ 0.06g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g；CoCl₂·6H₂O 0.47g；FeCl₃·6H₂O 5.4g；蒸馏水1L；

培养基用2.5mol/L的KOH溶液调节pH至7.0，121℃灭菌20min待用；

ii)厌氧发酵

取步骤i)配制好的发酵培养基100mL，置于100mL厌氧发酵瓶中，将实施例2和实施例3制备的固定化克雷伯氏菌颗粒分别加入厌氧发酵瓶，加量为厌氧发酵瓶体积的3/4，以上操作均在超净台中完成，然后将其放入37℃的恒温培养箱中进行第一批次的发酵，发酵时间为3d；

iii)半连续发酵

第一批次发酵结束后，取出发酵液，再取100mL步骤i)配制的发酵培养基分别倒入该含有不同固定化克雷伯氏菌颗粒的厌氧发酵瓶中，进行第二批次的发酵，操作方式与步骤ii)相同；按照上述操作方法依次进行6批次发酵。

第一批次发酵结束后两种固定化克雷伯氏菌颗粒状态如图3所示，两种聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒仍然保持较完整的颗粒状态。

根据发酵结果比较：在第一批次发酵的过程中，两种聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵过程中，几乎未有粘连情况发生；通过半连续发酵工艺，在6个批次的发酵液中，实施例2中聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒生产1.3-丙二醇的平均产量为48.85g/L，最高产量为第二批次，为52.66g/L；实施例3中聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒生产1.3-丙二醇的平均产量为44.36g/L，最高产量为第二批次，为49.35g/L。

Claims (9)

1.一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）聚乙烯醇-纤维素包埋液的制备

将克雷伯氏菌液加入质量分数为8~12%的聚乙烯醇溶液中，所述克雷伯氏菌液的加量是聚乙烯醇溶液体积的8~10 %，搅拌均匀得混合溶液；取纤维素原料经纤维素预处理得再生纤维素溶液，加入上述混合溶液中，所述再生纤维素溶液的加量为所述混合溶液质量的3~7%，混合均匀得聚乙烯醇-纤维素包埋液；

其中，所述纤维素预处理的步骤为：于20-30℃温度下，取纤维素原料分散于含尿素的碱性溶液中得分散系；其中，所述碱性溶液中NaOH、尿素、去离子水的质量比为5~9：10~15：75~83，纤维素原料质量为所述碱性溶液质量的3~5%；将得到的分散系经冷冻、解冻后搅拌均匀，离心取上清，得再生纤维素溶液；

（2）一次交联

将步骤（1）得到的聚乙烯醇-纤维素包埋液滴入饱和硼酸水溶液中进行第一次交联，第一次交联时间为1~2h，过滤得清液和一次交联产物；

（3）二次交联

取步骤（2）清液调节pH为6.5~7.0，加入到步骤（2）的一次交联产物中，搅拌均匀后静置，进行第二次交联，第二次交联时间为8~12h，过滤得二次交联产物，将二次交联产物用去离子水清洗3~4次，即得聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述聚乙烯醇溶液是将聚乙烯醇加热溶于水中，并冷却至30~37℃，其中聚乙烯醇重均分子量为3.5-17万。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述克雷伯氏菌液的OD₆₀₀为2～3；所述克雷伯氏菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC 1.10617。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素预处理的步骤满足以下条件中的一项或多项：

i. 所述纤维素原料为粉状纤维素，其中α-纤维素的含量≥95%；

ii. 所述碱性溶液中NaOH、尿素、去离子水的质量比为7：12：81；

iii. 所述冷冻为在-20~-15℃静置20~30h；

iv. 所述离心的条件为：7000~10000rpm离心5~15min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述聚乙烯醇-纤维素包埋液和饱和硼酸水溶液的体积比为1：4~6。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）、步骤（3）中所述交联均在常温下进行。

7.按照权利要求1所述的方法得到的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒。

8.权利要求7所述的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵生产1,3-丙二醇中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括权利要求1所述的一种聚乙烯醇-纤维素固定克雷伯氏菌的方法，还包括聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒在发酵生产1,3-丙二醇中的应用，步骤如下：

i）发酵培养基的配制

发酵培养基：甘油 50.0g；(NH₄)₂SO₄ 6.6g；NaH₂PO₄ 1.38g；Na₂SO₄ 0.28g；KCl 0.75g；

MgCl₂·6H₂O 0.26g；CaCl₂·2H₂O 0.29g；酵母浸粉 1.0g；柠檬酸 0.42g；微量元素溶液

5mL；蒸馏水 1L；

其中，微量元素溶液：CuCl₂·2H₂O 0.17g；MnCl₂·4H₂O 2.0g；ZnCl₂·6H₂O 0.68g；H₃BO₃0.06g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g；CoCl₂·6H₂O 0.47g；FeCl₃·6H₂O 5.4g；蒸馏水 1L；

培养基用KOH溶液调节pH至7.0，121℃灭菌20min待用；

ii）厌氧发酵

取步骤i）配制好的发酵培养基100mL，置于100mL厌氧发酵瓶中，将按照权利要求1所述的方法制备的聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒加入厌氧发酵瓶，加量为厌氧发酵瓶体积的3/4，以上操作均在超净台中完成；然后将其放入37℃的恒温培养箱中进行第一批次发酵，发酵时间为3~4d；

iii）半连续发酵

步骤ii）第一批次发酵结束后，取出发酵液，再取100mL步骤i）配制的发酵培养基倒入该含有聚乙烯醇-纤维素固定化克雷伯氏菌颗粒的厌氧发酵瓶中，进行第二批次发酵，发酵条件与步骤ii）相同；并按照上述操作依次进行半连续发酵。

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