CN114231517A - 一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法及其产品和应用，通过海藻酸钠、羧甲基纤维素与氯化钙溶液交联成海藻酸钙凝胶（Ga‑SA）实现细胞的固定化培养，将细胞固定于内部网状多孔材料Ga‑SA中，再利用3D细胞悬浮培养技术，在流动液体环境下，使得悬浮包埋于Ga‑SA中的细胞通过凝胶材料表面孔径与外界液体培养基产生基质交换，同时细胞产生的外泌体（EVs）分泌物亦通过孔径排入材料外部培养液中，在满足细胞生长所需的营养物不断更替补充的同时EVs也不断富集，再经静置条件重力的作用下Ga‑SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离。本发明材料制取成本低、操作简单、产物提取高效等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备及其产品和应用，属于生物领域。
技术背景
外泌体（EVs）是细胞分泌的粒径在30-150nm范围的小膜泡，其内包含了复杂 RNA和蛋白质，表面还含有多种细胞结合位点能被细胞捕获，因此EVs在载药细胞治疗中具有很大的应用前景。然而，由于EVs在细胞分泌后，会分散在培养基中，EVs与细胞的分离提纯尤为困难，特别在分离悬浮细胞生产的EVs。
现有的分离收集方法有超滤、超速离心等，均存在产品或仪器昂贵，不利于大规模分离制取。
发明内容
本发明目的在于提供一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法。
本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的大规模生产外泌体的细胞固定化材料产品。
本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，通过材料海藻酸钠（SA）、羧甲基纤维素（CMC）与氯化钙溶液交联成海藻酸钙凝胶（Ga-SA），实现细胞的固定化培养，包括如下步骤：
首先，在100 mL产纯水中加入SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入氯化钙CaCl2溶液中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
本发明提供了一种大规模生产EVs的方案，在生产EVs的同时即可实现与细胞的分离、纯化、收集。
所述海藻酸钠浓度为1%~5%。
所述羧甲基纤维素（CMC）浓度为0.5%~1%。
氯化钙溶液（CaCl2）浓度为1%~4%。
所述固定细胞为悬浮、贴壁生长各种干细胞、癌细胞，
所述固定细胞为MGC-803细胞。
本发明提供一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料，根据上述任一所述方法制备得到，得到的Ga-SA粒径在1-10 mm。
本发明提供一种细胞固定化材料用于大规模生产外泌体的应用，细胞被固定在Ga-SA，而细胞产生的外泌体（EVs）分泌物同培养基可以自由通过凝胶材料表面孔径。
所述外泌体（EVs），通过静置操作使得Ga-SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离、获取。
细胞被牢牢固定于内部网状多孔的Ca-SA中，每3天更换50%培养基，操作时静置使得Ga-SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离，收集上层清液，即可实现EVs的持续获取。
本发明利用细胞固定化技术将细胞固定于内部网状多孔材料海藻酸钙凝胶（Ga-SA）中，再利用3D细胞悬浮培养技术，在流动液体环境下，使得悬浮包埋于Ga-SA中的细胞通过凝胶材料表面孔径与外界液体培养基产生基质交换，同时，细胞产生的外泌体（EVs）分泌物亦通过孔径排入材料外部培养液中，因此在满足细胞自身生长所需的营养物不断更替补充的同时，产物EVs也源源不断富集，再经静置条件重力的作用下Ga-SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离，实现上清液EVs的大规模获取。与现有技术相比，本发明产品具有材料制取成本低、操作简单、产物提取高效等特点。
本发明提供了一种大规模生产EVs的方案，材料利用细胞包埋技术，在生产EVs的同时即可实现与细胞的分离、纯化、收集，且包埋凝胶材料具有制作简单、成本低等优点，便于产品的普及，具备显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为MGC-803单独培养图；
图2为包埋于Ga-SA凝胶中的MGC-803细胞经DAPI染色后图。
具体实施方式
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
实施例1
一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料，通过海藻酸钠（SA）、羧甲基纤维素（CMC）与氯化钙溶液交联成海藻酸钙凝胶（Ga-SA）实现细胞的固定化培养，按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入1 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的如图1所示MGC-803细胞胰酶消化、离心、重悬后，按照10*5浓度接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000mL 1% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。如图2所示，细胞被牢牢固定于内部网状多孔的Ca-SA中。
每3天更换50%培养基，操作时静置使得Ga-SA沉降在容器底部，即可实现MGC-803细胞与外泌体EVs的分离，收集上层清液，即可实现EVs的持续获取。
实施例2
一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料，与实施例1步骤近似，按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入2 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度将MGC-803细胞接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000mL浓度为 1% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
每3天更换50%培养基，操作时静置使得Ga-SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离，收集上层清液，即可实现EVs的持续获取。
实施例3
一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料，与实施例1步骤近似，按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入1 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度将MGC-803细胞接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000mL浓度为4% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
每3天更换50%培养基，操作时静置使得Ga-SA沉降在容器底部，即可实现细胞与EVs的分离，收集上层清液，即可实现EVs的持续获取。
Claims (10)
1.一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于，通过海藻酸钠（SA）、羧甲基纤维素（CMC）与氯化钙溶液交联成海藻酸钙凝胶（Ga-SA）实现细胞的固定化培养，包括如下步骤：
首先，在100 mL纯水中加入浓度为1%~5%SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入浓度为0.5%~1%CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入浓度为1%~4%的氯化钙（CaCl2）溶液中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于配置的液体培养基中，其中所配培养基含80％-90％的RPMI-1640培养基、10％-20％的胎牛血清以及1％的双抗贮存液(青霉素+链霉素，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 μg/mL)，然后进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
2.根据权利要求1所述大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于，所述固定细胞为悬浮、贴壁生长各种干细胞、癌细胞。
3.根据权利要求2所述大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于所述固定细胞为MGC-803细胞。
4.根据权利要求1至3任一项所述大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入1 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的MGC-803细胞胰酶消化、离心、重悬后，按照10*5浓度接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000 mL1% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
5.根据权利要求1至3任一项所述大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入2 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度将MGC-803细胞接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000 mL浓度为 1% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
6.根据权利要求1至3任一项所述大规模生产外泌体的细胞固定化材料的制备方法，其特征在于按如下步骤制备：
首先，在100 mL纯水中加入1 g SA、在搅拌条件下60℃加热2 h，再加入0.5 g CMC继续加热搅拌1 h，自然冷却后，静置放置到气泡去除为止，得到CMC/SA溶液；
随后，将培养的待固定细胞消化、离心、重悬后，按照10*5浓度将MGC-803细胞接种到CMC/SA溶液中，得到待培养的接种母液；
最后，利用注射器，在200 rpm搅拌条件下，将接种母液垂直悬空缓慢滴加入1000 mL浓度为4% CaCl2中，浸泡30 min待反应物交联成Ca-SA凝胶后，将含包埋MGC-803细胞的凝胶颗粒接种于液体培养基中，进行3D悬浮培养，得到细胞固定化材料。
7.一种大规模生产外泌体的细胞固定化材料，其特征在于，根据权利要求1-6任一所述方法制备得到，得到的Ga-SA粒径在1-10 mm。
8.一种根据权利要求7所述细胞固定化材料用于大规模生产外泌体的应用，细胞被固定在Ga-SA，而细胞产生的外泌体（EVs）分泌物同培养基可以自由通过凝胶材料表面孔径。
9.根据权利要求8所述细胞固定化材料用于大规模生产外泌体的应用，其特征在于，所述外泌体（EVs），通过静置操作使得Ga-SA沉降在容器底部，实现细胞与EVs的分离、获取。
10.根据权利要求8或9所述细胞固定化材料用于大规模生产外泌体的应用，其特征在于，细胞被牢牢固定于内部网状多孔的Ca-SA中，每3天更换50%培养基，操作时静置使得Ga-SA沉降在容器底部，实现MGC-803细胞与外泌体EVs的分离，收集上层清液，持续获取EVs。
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