CN107022584B - 一种固定化枯草芽孢杆菌将l-丙氨酸转化为d-丙氨酸的方法 - Google Patents

一种固定化枯草芽孢杆菌将l-丙氨酸转化为d-丙氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法。一种固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法，包括如下步骤：细胞悬液的制备、微生物细胞的固定化、固定化细胞转化L‑丙氨酸、固定化细胞的重复利用性和D‑丙氨酸的提取。本发明的固定化枯草芽孢杆菌将L‑丙氨酸转化为D‑丙氨酸的方法得到D‑丙氨酸回收率高，纯度高。

Description

一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法。
背景技术
丙氨酸(ALa)是构成人体蛋白质的20种基本氨基酸之一，是生命体的重要组成部分，根据其分子结构的手性和旋光性可分为L-丙氨酸和D-丙氨酸。D-丙氨酸是一种重要的有机手性源，在制药行业和食品生产行业都有广泛应用，例如生产新型抗生素、维生素B6及新型甜味剂阿力甜等。随着D-丙氨酸在食品、制药行业上的应用发展，市场上对D-丙氨酸的需求量也随之增长。目前，D-丙氨酸的生产制备方法主要有微生物发酵法、化学不对称合成法及氨基酰化酶拆分法，微生物发酵法生产周期长，发酵液成分复杂，产物含量低，分离纯化过程复杂，化学不对称合成法工艺复杂，所需要的手性助剂来源有限且价格昂贵，氨基酰化酶拆分法所需要的酶制剂成本高，制约了D-丙氨酸的大规模化生产。
固定化技术是现代生物技术及其工业化环节中的一种核心技术。日本的千佃一郎在1960年开始研究固定化氨基酰化酶，并在1969年将其首次运用到工业化生产中，这在国际上是个突破。细胞固定化技术是指利用各种理化方法将游离细胞定位在有限的空间内并使其保持活力和可以反复利用的一种技术。固定化细胞有许多优点，能够长期保持细胞活力，可以反复利用，反应完成后，还易与产物分离，极大的提高了工业生产效率。
枯草芽孢杆菌内含有丙氨酸消旋酶，因此，能够将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，从而达到积累生产D-丙氨酸的目的。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明提供一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，该方法采用包埋法，将枯草芽孢杆菌包埋在聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体中，经优化后，用于转化L-丙氨酸生产D-丙氨酸。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)细胞悬液的制备：将枯草芽孢杆菌种子液按体积比1-1.5％的接种量接种到发酵培养基中，于发酵罐中发酵培养16-30h；发酵完毕后，离心得菌体，用去离子水清洗2次后，并用9g/L的氯化钠溶液重悬菌体；
(2)微生物细胞的固定化：称取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠，加热水溶解，得到聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为6-11％和0.5-3.0％，放入灭菌锅中121℃灭菌20min；待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配制的菌悬液，细胞浓度为0.1-5％，混匀后，用蠕动泵从15cm高处滴入含有0.5-3％氯化钙和1-3.5％硼酸的交联剂中，置于4℃冰箱中固化2-12h，固定化菌体直径为2.5-5.5mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗3-4次；
(3)固定化细胞转化L-丙氨酸：在发酵罐中依次加入固定化细胞，转化液和底物L-丙氨酸，进行转化反应；
(4)固定化细胞的重复利用性：固定化细胞在上述条件下进行反复转化，40-60h转化1批次，每批次结束后，用蒸馏水清洗小球，开始下1次反应；
(5)D-丙氨酸的提取：用纱布过滤出固定化细胞，将反应混合液离心取上清，调pH至2.0-5.0，将其通入732强酸型阳离子交换树脂中；先用无菌水冲洗，再用1-3M氨水洗脱D-丙氨酸，收集洗脱液，用活性炭脱色，真空加热浓缩至D-丙氨酸结晶析出，用70％甲醇冲洗D-丙氨酸晶体，干燥，得D-丙氨酸成品。
作为优选，步骤(1)中所述的发酵培养基的组成为：蔗糖3％、酵母膏0.5％、L-丙氨酸0.4％、KH2PO4 0.2％、Mg2SO4.7H2O 0.09％、CaCl2 0.02％，pH＝6.5。
作为优选，步骤(1)中发酵培养的条件为30℃，通气量1.0vvm，转速600rmp，pH6.5。
作为优选，步骤(3)中转化液的组成为：KH2PO4 0.51％、K2HPO4 0.22％、MgSO47H2O0.2％和CaCl2 0.01％，pH＝6.0。
作为优选，步骤(3)中所述的固定化细胞的浓度为200-400g/L，所述的底物L-丙氨酸的浓度为100-200g/L。
作为优选，步骤(3)中反应的条件为：温度30℃，转速400r/min、通气量1.0vvm，pH＝6。
作为优选，步骤(3)中所述的转化反应的时间为40-60h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法首次采用固定化细胞枯草芽孢杆菌生产D-丙氨酸，以聚乙烯醇和海藻酸钠作为载体，所获得的固定化细胞稳定性好，传质效率高，连续使用1个月后，仍具有较高的活力。
(2)本发明同游离细胞相比，固定化细胞易从反应液中分离出来，对底物的利用率高，产物浓度高且易于分离纯化，降低了生产成本。
(3)本发明的方法实现了菌体的重复利用，减少了菌体的培养次数，降低了菌体培养过程中的能源消耗，从而降低了生产成本。
(4)本发明的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，经检测，D-丙氨酸回收率为92.5％，化学纯度为99.1％，光学纯度为99.5％。
附图说明
图1为固定化细胞枯草芽孢杆菌反复转化L-丙氨酸活性随次数的变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：
(1)细胞悬液的制备
将枯草芽孢杆菌种子液按1％的接种量接种到发酵培养基中，(培养基组成为：蔗糖3％、酵母膏0.5％、L-丙氨酸0.4％、KH2PO4 0.2％、Mg2SO4.7H2O 0.09％、CaCl2 0.02％、pH＝6.5)于5L发酵罐中发酵培养24h，培养条件为30℃，通气量1.0vvm，转速600rmp，pH6.5。发酵完毕后，离心得菌体，用去离子水清洗2次后，并用9g/L的氯化钠溶液重悬菌体。
(2)微生物细胞的固定化
称取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠，加热水溶解，聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为8％和2.5％，放入灭菌锅中121℃灭菌20min。待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配制的菌悬液，混匀后，用蠕动泵从15cm高处滴入含有2％氯化钙和3％硼酸的交联剂中，4℃冰箱中固化6h，固定化菌体直径约为3mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗3-4次，以清除过量的钙离子和没有固定的细胞。
(3)固定化细胞转化L-丙氨酸
将500g固定化菌体和200gL-丙氨酸悬浮于2L转化液中，(转化液组成：KH2PO40.51％、K2HPO4 0.22％、MgSO47H2O 0.2％、CaCl2 0.01％、pH＝6.0)反应混合液加入到5L机械搅拌式发酵罐中。反应条件为：温度30℃，转速400r/min、通气量1.0vvm，pH＝6.0,转化时间为60h。
(4)固定化细胞的重复利用性
固定化细胞在上述条件下进行反复转化，60h转化1批次，每批次结束后，用蒸馏水清洗小球，开始下一次反应。
结果如图1所示，在最开始的转化过程中，酶活性随转化次数的升高而增大，并在第3次转化过程中出现最高活性，可能是因为开始时细胞要适应微环境并且在小球内生长。随后，随着转化次数的增加，固定化细胞的转化活力会逐渐下降。
(5)D-丙氨酸的提取
用纱布过滤出固定化细胞，将反应混合液离心取上清，调pH至4.0，通入732强酸型阳离子交换树脂中。先用无菌水冲洗，再用2M氨水洗脱D-丙氨酸，收集洗脱液，用活性炭脱色，真空加热浓缩至D-丙氨酸结晶析出，用70％甲醇冲洗D-丙氨酸晶体并干燥得成品。
经检测，D-丙氨酸的回收率为92.5％，得到D-丙氨酸的化学纯度为99.1％，光学纯度为99.5％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (7)

1.一种固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）细胞悬液的制备：将枯草芽孢杆菌种子液按体积比1-1.5%的接种量接种到发酵培养基中，于发酵罐中发酵培养16-30h；发酵完毕后，离心得菌体，用去离子水清洗2次后，并用9g/L的氯化钠溶液重悬菌体；
（2）微生物细胞的固定化：称取一定量的聚乙烯醇和海藻酸钠，加热水溶解，得到聚乙烯醇和海藻酸钠的最终浓度分别为6-11%和0.5-3.0%，放入灭菌锅中121℃灭菌20min；待混合液冷却至室温时，立即加入用生理盐水配制的菌悬液，细胞浓度为0.1-5%，混匀后，用蠕动泵从15cm高处滴入含有0.5-3%氯化钙和1-3.5%硼酸的交联剂中，置于4℃冰箱中固化2-12h，固定化菌体直径为2.5-5.5mm，用筛子过滤并用无菌蒸馏水反复冲洗3-4次；
（3）固定化细胞转化L-丙氨酸：在发酵罐中依次加入固定化细胞，转化液和底物L-丙氨酸，进行转化反应；
（4）固定化细胞的重复利用性：将固定化细胞按步骤（3）的方法反复分批转化，40-60h转化1批次，每批次结束后，用蒸馏水清洗小球，开始下1次反应；
（5）D-丙氨酸的提取：用纱布过滤出固定化细胞，将反应混合液离心取上清，调pH至2.0-5.0，将其通入732强酸型阳离子交换树脂中；先用无菌水冲洗，再用1-3M氨水洗脱D-丙氨酸，收集洗脱液，用活性炭脱色，真空加热浓缩至D-丙氨酸结晶析出，用70%甲醇冲洗D-丙氨酸晶体，干燥，得D-丙氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的发酵培养基的组成为：蔗糖3%、酵母膏0.5%、L-丙氨酸 0.4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.09%、CaCl2 0.02%，pH=6.5。
3.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（1）中发酵培养的条件为30℃，通气量1.0vvm，转速600rpm，pH6.5。
4.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中转化液的组成为：KH2PO4 0.51%、K2HPO4 0.22%、MgSO4·7H2O 0.2%和CaCl2 0.01%，pH=6.0。
5.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的固定化细胞的浓度为200-400g/L；所述的底物L-丙氨酸的浓度为100-200g/L。
6.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中反应的条件为：温度30℃，转速400r/min、通气量1.0vvm，pH =6。
7.根据权利要求1所述的固定化枯草芽孢杆菌将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的转化反应的时间为40-60h。
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