CN109735559B - 一种γ-氨基丁酸的生物制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种γ‑氨基丁酸的生物制备方法，其步骤为1)、用能表达谷氨酸脱羧酶的E.coli工程菌株制备谷氨酸脱羧酶全细胞菌体；2)、用味精和浓盐酸制备L‑谷氨酸；3)、L‑谷氨酸作底物溶于水中，加入谷氨酸脱羧酶全细胞菌体和磷酸吡哆醛，搅拌反应，制备γ‑氨基丁酸。本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，以味精代替高纯度谷氨酸，γ‑氨基丁酸纯度高达97.7％，原料成本降低；用于催化的全细胞可由微生物发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取蒸发浓缩与自然析晶的方法分离产物，成本低、工艺环保，适于产业化生产γ‑氨基丁酸。

Description

一种γ-氨基丁酸的生物制备方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种γ-氨基丁酸的生物制备方法。

背景技术

γ-氨基丁酸是是哺乳动物中枢神经中的一种重要神经抑制性介质，介导了40％以上的神经抑制性信号。γ-氨基丁酸在人体内发挥着极其重要的生理功能，如促进脑的活化，镇静、抗惊厥，抗癫痫，促进睡眠，延缓脑衰老，补充人体抑制性神经递质，降血压，同时还能抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能等。此外，γ-氨基丁酸可以作为工业上合成N-甲基吡咯烷酮、生物塑料及尼龙等含氮化学制品的环保型前体物质。因而在食品制药、化工、农业等领域具有十分重要的作用。

γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物合成法和植物富集法。其中植物富集法产量较低；化学合成法反应剧烈、成本高昂、环境污染严重、安全性差；微生物合成法因酶催化方法效率高，专一性强而得到广泛的应用。在微生物合成法制备γ-氨基丁酸的研究中，主要采用谷氨酸脱羧酶法。

谷氨酸脱羧酶能专一、不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸钠裂解为γ-氨基丁酸和CO₂。但是谷氨酸脱羧酶需要在酸性环境下才能保持活性，引入高浓度的缓冲液将使γ-氨基丁酸的纯化复杂化。通常情况下，高纯度的L-谷氨酸价格比较昂贵。谷氨酸钠价格较低，但转化率低。因此，有必要进一步开发一种高效，低成本，且易于产业化大生产的酶催化制备γ-氨基丁酸的新方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种改进的γ-氨基丁酸的生物制备方法，该方法高效、成本低、且易于工业化生产。

为解决以上技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，以味精为原料，使味精与浓盐酸反应成为谷氨酸，再以此谷氨酸在水中、在谷氨酸脱羧酶全细胞的催化作用下，搅拌反应得到γ-氨基丁酸。

本发明的具体制备方法为：

1)Gad-pET28a载体的构建

根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的Gad基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增Gad基因，凝胶电泳条带约为2000bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；将PCR产物进行纯化，连接到pET28a载体上，得到重组质粒Gad-pET28a，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明谷氨酸脱羧酶基因成功插入至载体pET28a；

所述引物F序列(5’-3’)为atgcaccatcatcatcatcatatggataagaagcaagtaacgga；

所述引物R序列(5’-3’)为ctcgagaattgtgagcgctttagtgatcgctgagatatttcaggga；

2)、制备谷氨酸脱羧酶全细胞

将1)中构建的重组质粒Gad-Pet28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到能表达谷氨酸脱羧酶的Gad-Pet28a大肠杆菌工程菌株。将工程菌株接种到含有50mg/L的卡那霉素的SOB液体培养基中，接种比例为10％，接种后于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.6时，转接至含有2L SOB培养基的5L发酵罐中继续培养，反应前期发酵温度为37℃，后期产酶温度为25℃，搅拌转速为400rpm，通气比及罐压分别为2VVM(立方米/(立方米*分钟))和0.05MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，在温度4℃、转速6000rpm、时间5min条件下，离心收集谷氨酸脱羧酶全细胞，备用，湿菌体质量达到60g/L。；

所述SOB液体培养基(Super Optimal Broth)构成如下：在950mL去离子水中加入胰化蛋白胨20g、酵母提取物5g、NaCl 0.5g，摇动容器使溶质完全溶解，加10mL 250mmol/LKCl溶液，用5mol/L KOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌30min；该溶液在使用前，加入5mL灭菌的2M MgCl₂溶液。

3、用味精制备L-谷氨酸

将10～30g味精溶解于50～100mL水中，加入10～20mL浓盐酸，使味精转变成L-谷氨酸，并从水中析出并过滤，将过滤得到的L-谷氨酸用水多次冲洗，至洗下的液体pH大于3时停止冲洗，收集L-谷氨酸，干燥后备用。

4、制备γ-氨基丁酸

500mL反应体系制备化合物γ-氨基丁酸：在1L的反应釜中加入500mL水，加入谷氨酸脱羧酶全细胞10～70g/L，加入终浓度0.1～1mM的磷酸吡哆醛，分三次加入L-谷氨酸100～800g/L；

第一次加入1/3的L-谷氨酸，在35～40℃、220rpm的条件下反应7小时，用薄层层析检测反应的终点进展，转化率超过98％，停止反应。当底物反应完再补加1/3的L-谷氨酸，依次重复完成，再加入剩余的L-谷氨酸完全反应后，离心收集上清液。

5、γ-氨基丁酸结晶纯化

将步骤4离心收集的上清液80℃加热上清液40min后，离心分离变性蛋白。再80℃蒸发上清液，待浓缩液体积为原体积的三分之一时，盛在干净无水的容器中，放置室温，缓慢降温，再置于4℃结晶10～15小时，然后抽滤干燥得到γ-氨基丁酸晶体。

所述谷氨酸脱羧酶全细胞的优选加入量为15～25g/L水。

本发明与已有技术相比具有如下优势：

本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，以味精代替高纯度谷氨酸，γ-氨基丁酸纯度高达97.7％，原料成本降低；用于催化的全细胞可由微生物高密度发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取蒸发浓缩与自然析晶的方法分离产物，成本低、工艺环保，适于产业化生产γ-氨基丁酸。

附图说明

图1γ-氨基丁酸的生物合成机制；GAD：谷氨酸脱羧酶。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。

实施例1用味精制备L-谷氨酸

将30g味精溶解于80mL水中，加入14mL浓盐酸，使味精转变成L-谷氨酸，并从水中析出，将过滤得到的L-谷氨酸用水多次冲洗，至洗下的液体pH大于3时停止冲洗，收集L-谷氨酸，干燥后用于反应。

实施例2制备谷氨酸脱羧酶全细胞

将Gad-pET28a重组大肠杆菌工程菌株接种到SOB液体培养基中，其中含有50mg/L的卡那霉素；接种后于37℃、200rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.6时，转接至含有2L SOB培养基的5L发酵罐中，接种比例为10％。反应前期发酵温度为37℃，后期产酶温度为25℃，搅拌转速为400rpm，通气比及罐压分别为2VVM(立方米/(立方米*分钟))和0.05MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，4℃离心(6000rpm，5min)收集静息细胞，湿菌体质量达到60g/L。

实施例3制备γ-氨基丁酸

500mL反应体系制备化合物γ-氨基丁酸：在1L的反应釜中加入500mL水，加入13g的谷氨酸脱羧酶全细胞，加入终浓度0.5mM的磷酸吡哆醛，一次加入L-谷氨酸100g，35～40℃、220rpm的条件下反应7小时，用薄层层析检测反应的终点进展，当底物反应完再补L-谷氨酸100g，依次重复，共加入L-谷氨酸350g并能完全反应后，离心收集上清。

实施例4 γ-氨基丁酸结晶纯化

待L-谷氨酸完全转化成γ-氨基丁酸后，反应的溶液经过高速离心分离菌体。80℃加热上层清液40min后，离心分离变性蛋白。80℃蒸发上层清液，待浓缩液体积为原体积的三分之一时，盛在干净无水的容器中，放置室温，缓慢降温，再置于4℃过夜，第二天抽滤得到γ-氨基丁酸晶体。

Claims (2)

1.一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于步骤为：

1）Gad-pET28a载体的构建

根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的Gad基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增Gad基因，凝胶电泳条带约为2000 bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；将PCR产物进行纯化，连接到pET28a载体上，得到重组质粒Gad-pET28a，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明谷氨酸脱羧酶基因成功插入至载体pET28a；

所述引物F序列（5’-3’）为atgcaccatcatcatcatcatatggataagaagcaagtaacgga；

所述引物R序列（5’-3’）为ctcgagaattgtgagcgctttagtgatcgctgagatatttcaggga；

2）、制备谷氨酸脱羧酶全细胞

将1）中构建的重组质粒Gad-Pet28a转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到能表达谷氨酸脱羧酶的Gad-Pet28a大肠杆菌工程菌株，将工程菌株接种到含有50 mg/L的卡那霉素的SOB液体培养基中，接种比例为10%，接种后于37 ℃、200 rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.6时，转接至含有2L SOB培养基的5L发酵罐中继续培养，反应前期发酵温度为37 ℃，后期产酶温度为25 ℃，搅拌转速为400 rpm，通气比及罐压分别为2 VVM（立方米/（立方米*分钟））和0.05 MPa；发酵过程中每1小时取样监测菌体量并测定酶活力，待菌体量、酶活力均保持稳定时停止发酵，在温度4 ℃、转速6000 rpm、时间5 min条件下，离心收集谷氨酸脱羧酶全细胞，备用；

3）、用味精制备L-谷氨酸

将10～30 g味精溶解于50～100mL水中，加入10～20 mL浓盐酸，使味精转变成L-谷氨酸，并从水中析出并过滤，将过滤得到的L-谷氨酸用水多次冲洗，至洗下的液体pH大于3时停止冲洗，收集L-谷氨酸，干燥后备用；

4）、制备γ-氨基丁酸

在1 L的反应釜中加入500 mL水，加入谷氨酸脱羧酶全细胞10~70 g/L，加入终浓度0.1~1 mM的磷酸吡哆醛，分三次加入L-谷氨酸100~800 g/L；

第一次加入1/3的L-谷氨酸，在35~40 ℃、220 rpm的条件下反应7小时，用薄层层析检测反应的终点进展，转化率超过98%，停止反应；当底物反应完

后再补加1/3的L-谷氨酸，依次重复完成，再加入剩余的L-谷氨酸，完全反应后，离心收集上清液；

5）、γ-氨基丁酸结晶纯化

将步骤3离心收集的冲洗液80 ℃加热40 min后，离心分离变性蛋白；再80℃蒸发分离后的上清液，待浓缩液体积为原体积的三分之一时，转盛在干净无水的容器中，放置室温，缓慢降温，再置于4 ℃结晶10~15小时，然后抽滤干燥得到γ-氨基丁酸晶体。

2.根据权利要求1所述的一种γ-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于步骤4中所述谷氨酸脱羧酶全细胞的加入量为15~25 g/L。

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