CN104830922B - L‑鸟氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L‑鸟氨酸酶法转化制备方法。该制备方法采用含有精氨酸的料液或精氨酸粗品或精氨酸盐粗品为底物配制酶转化液，加入具有精氨酸酶活性的菌体细胞或酶粗提液，在25～55℃、pH 7～11条件下进行酶促反应，利用等电点结晶和离子交换相结合的方法分离制备转化产物L‑鸟氨酸盐酸盐。该方法以廉价的L‑精氨酸料液为底物酶法合成了附加值较高的L‑鸟氨酸盐酸盐，具有原料来源广，酶促转化效率高，操作简便，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法。
二、背景技术
L-鸟氨酸(L-Ornithine)是一种非蛋白氨基酸，主要存在于肉类、鱼类、奶酪中，也是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，在人体内主要以游离态存在于肝脏。L-鸟氨酸最主要的生理功能是参与尿素循环，有着强大的氨解毒功能，因此被广泛应用于治疗肝性脑病、肝炎以及保护肝脏方面的药物研发，如L-鸟氨酸-L-天冬氨酸，L-鸟氨酸苯乙酸等。此外，L-鸟氨酸还有很多其他生物功能，如刺激生长激素分泌、改善睡眠、缓解疲劳，还能用作食品添加剂改善食品风味。随着人们对L-鸟氨酸认识的加深，其生理功效将会进一步引起世人关注。
根据文献报道，L-鸟氨酸的制备方法主要有化学法、发酵法和酶转化法。
1、化学法
George(US 3168558)利用丙烯醛、氰化氢、氨气、CO2为原料合成L-鸟氨酸，但效果不理想，主要表现为反应步骤多、产品为消旋的DL-鸟氨酸。Nesmeyanov(Russ Chem B,1957(4):459-466；J Org Chem,1963,28(7):1942-1943)分别以1,1,5-三氯-1-戊烯或2,5-二氯戊酸为起始反应物生产鸟氨酸，减少了反应步骤，但产物仍然为DL-鸟氨酸。化学法合成鸟氨酸反应步骤多、收率低，且得到的是消旋体，需要拆分，不适宜大规模生产L-鸟氨酸产品。
Rivard(J Am Chem Soc,1955,77(5):1260-1261)利用Ba(OH)2水解L-精氨酸，经水解、除盐和干燥后，得到L-鸟氨酸盐酸盐，水解过程中存在消旋现象，产品光学纯度不高。刘爱福(CN 1594282 A)将水解工艺优化调整，解决了水解过程中L-鸟氨酸消旋，产品总收率达到80％，但碱水解L-精氨酸法存在产品回收率低，催化剂难以重复利用的缺点。
2、发酵法
发酵法因原料低廉受到研究者的青睐，近年来取得了很大进展，主要表现在生产菌株的选育和生产工艺的改造方面。
日本研究人员早在20世纪50年代就利用紫外、氰化物等传统的诱变技术，获得了谷氨酸棒杆菌瓜氨酸缺陷型突变株，成功积累了L-鸟氨酸。到了20世纪90年代，Tsuchida(US 5188947)发现给予霉酚酸等抗性标记后，L-鸟氨酸质量浓度可提高到40～55g/L。万红贵(CN 101955901A)公开了利用Corynebacterium glutamicum CGMCC No.3663发酵制备L-鸟氨酸的方法，发酵液中L-鸟氨酸积累达到35～45g/L。
但发酵法也有不足之处，菌种的不稳定性、发酵工艺参数控制、发酵液中L-鸟氨酸的分离提取等过程都存在亟待解决的问题。
3、酶转化法
酶法转化因具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分离等优点而日益受到重视，是低成本生产L-鸟氨酸的有效方法。
Makryaleas(US 5405761)研究了精氨酸酶(EC 3.5.3.1)制备L-鸟氨酸的工艺，在pH 8.0～10.0时转化率可达99％。王雷(CN 101348808 A)利用从牛肝中提取的牛肝酶液和从黄豆中提取脲酶双酶耦合转化L-精氨酸制备L-鸟氨酸，产品收率80～85％。高智慧(CN102286602 A)利用重组表达的精氨酸酶基因工程菌酶法拆分DL-精氨酸制备D-精氨酸和L-鸟氨酸，产品L-鸟氨酸盐酸盐纯度95％以上。张鹏(CN 1908177 A)在粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786发酵液中加入精氨酸底物酶法转化制备L-鸟氨酸，产物含量达到90～112g/L。焦庆才(CN 1661026 A)采用固定化细胞酶法水解L-精氨酸，底物转化率95％以上，L-鸟氨酸得率80％以上。张奇(CN 102286563 A)利用纤维素载体固定化重组表达的精氨酸酶，用交联剂交联后酶法转化底物L-精氨酸，前10次使用底物转化率90％以上。
综上所述，酶法制备L-鸟氨酸的方法中以精氨酸酶水解法最接近工业化应用，但反应底物L-精氨酸成本相对较高。鉴于L-鸟氨酸发酵技术的发展，目前以高纯度L-精氨酸为原料酶法制备L-鸟氨酸的工业化技术难以长期与L-鸟氨酸发酵法生产技术相竞争，因此寻找来源丰富、成本低廉的L-精氨酸工业原料并实现酶法生产L-鸟氨酸关键技术的突破是本发明的根本目的。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本酶法制备L-鸟氨酸的方法。本发明利用含有精氨酸的料液或精氨酸粗品或精氨酸盐粗品为底物配制酶转化液，加入具有精氨酸酶活性的菌体细胞或粗酶液，催化水解制得L-鸟氨酸。
本发的明技术方案：
(1)将具有精氨酸酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活精氨酸酶；
(2)含有精氨酸的发酵液或含有精氨酸的离子交换洗脱液或精氨酸粗品或精氨酸盐粗品加水配制的底物溶液，用氨水或无机酸调pH 7～11，加入精氨酸酶细胞或酶粗提液，再加入表面活性剂，在25～55℃条件下进行酶促反应，转化反应结束后利用等电点结晶和离子交换相结合的方法分离制备转化产物L-鸟氨酸盐酸盐。
上述步骤(1)所述的精氨酸酶来源于粪肠球菌或产碱杆菌或芽孢杆菌或栖息微球菌。培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L。
上述步骤(2)所述的精氨酸发酵液中含有精氨酸质量浓度为10～150g/L；
含有精氨酸的离子交换洗脱液中精氨酸质量浓度为10～150g/L；精氨酸粗品或精氨酸盐粗品中精氨酸重量比含量为50％～95％，配制的粗品底物水溶液质量浓度为50～200g/L。所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或TritonX-100或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其终浓度为0.1～1.0g/L。
本发明与现有技术相比其有益效果是：
目前，我国L-精氨酸生产主要来源于角蛋白水解提取法和发酵法，生产过程中L-精氨酸的分离精制和浓缩结晶及干燥工序增加了成品L-精氨酸的成本，而酶法转化对底物L-精氨酸的纯度要求不高，因此利用发酵法生产L-精氨酸的发酵液或离子交换分离的粗提液以及L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐的粗品为原料酶法制备L-鸟氨酸可大大降低生产成本。本发明以含精氨酸的料液或L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐粗品加水配制的溶液为底物，利用精氨酸酶催化水解制备L-鸟氨酸，解决了精氨酸酶酶法水解制备L-鸟氨酸工艺的廉价原料问题，使生产成本大幅度降低，具有重大突出效果和工业化价值。
(1)本发明利用精氨酸酶催化水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸，酶法转化效率高，摩尔转化率达到99％以上。
(2)本发明采用发酵法生产L-精氨酸的发酵液或离子交换分离的粗提液以及L-精氨酸粗品或L-精氨酸盐的粗品为原料，充分利用了工业生产过程物料，省去了精氨酸的分离、精制及干燥工序，降低了酶法生产L-鸟氨酸的原料成本，实施效果突出，具有良好的经济效益和社会效益。
(3)酶促反应生成的L-鸟氨酸可利用等电点结晶和离子交换相结合的方法分离制备，得到L-鸟氨酸盐酸盐。
(4)酶法制备L-鸟氨酸具有转化反应条件温和，酶立体选择性强，成本低，工艺流程简单、设备投资少等优点，适合工业化大规模生产。
四、具体实施方式
实施例一
L-鸟氨酸酶法转化制备方法由以下步骤构成：
(1)将具有精氨酸酶活性的菌株粪肠球菌或产碱杆菌或芽孢杆菌或栖息微球菌在培养基中培养，培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L，产生高酶活精氨酸酶；
(2)将含有精氨酸质量浓度为10～150g/L的精氨酸发酵液，或含有精氨酸质量浓度为10～150g/L的精氨酸离子交换洗脱液，或精氨酸重量比含量为50％～95％的精氨酸粗品或精氨酸盐粗品，加水配制成底物溶液，配制的粗品底物水溶液质量浓度为50～200g/L，用氨水或无机酸调pH7～11，加入精氨酸酶细胞或酶粗提液，再加入表面活性剂吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100或聚乙二醇辛基苯基醚，其终浓度为0.1～1.0g/L，在25～55℃条件下进行酶促反应，转化反应结束后利用等电点结晶和离子交换相结合的方法分离制备转化产物L-鸟氨酸盐酸盐。
实施例二
1.将粪肠球菌ATCC 8043在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：玉米浆2.0％，蛋白质水解物0.5％，牛肉膏1％，麦芽糖1.0％，乳糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.5％，MgSO4·7H2O 0.03％，pH 7.2。37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿细胞18g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含150g/L L-精氨酸的精氨酸发酵液，pH 9.0，再加入1.0g/L TritonX-100，40℃酶促反应18h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐119.4g，收率83％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐8.6g。
实施例三
1.将粪肠球菌CGMCC NO.1786在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：玉米浆0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，牛肉膏2％，葡萄糖1％，麦芽糖0.5％，pH7.2。37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿细胞15g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含100g/L L-精氨酸的精氨酸发酵液，pH 9.0，再加入0.1g/L吐温80，40℃酶促反应15h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为75.1g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐81.5g，收率85％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐4.7g。
实施例四
1.将粪肠球菌ATCC 8043在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：玉米浆1.0％，蛋白质水解物0.5％，牛肉膏2％，麦芽糖1.0％，乳糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.5％，MgSO4·7H2O 0.03％，pH 7.2。37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿细胞16g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含70g/L L-精氨酸的精氨酸发酵液，pH 10.0，再加入0.5g/L TritonX-100，45℃酶促反应12h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为52.6g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐56.4g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐3.8g。
实施例五
1.将粪产碱杆菌ATCC 21400在如下500ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，蔗糖0.5％，果糖1.0％，NaCl 0.5％，KH2PO40.3％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O0.05％，pH 7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞7g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含10g/L L-精氨酸的精氨酸发酵液，pH 7.0，再加入0.5g/L CTAB，35℃酶促反应6h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为7.51g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐8.15g，收率85％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
实施例六
1.将粪产碱杆菌ATCC 21400在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨2.0％，牛肉膏1.5％，蔗糖0.5％，果糖1.0％，NaCl 0.5％，KH2PO40.3％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O0.05％，pH 7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞15g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含150g/L L-精氨酸的精氨酸离子交换洗脱液，pH 9.0，再加入0.5g/L CTAB，45℃酶促反应18h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐122.2g，收率85％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐5.8g。
实施例七
1.将芽孢杆菌Rummeliibacillus pycnus CCTCC NO:M 2011466在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：豆饼水解液3％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，乳糖1.0％，蔗糖0.5％，麦芽糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.03％，pH 7.2。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞17g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含100g/L L-精氨酸的精氨酸离子交换洗脱液，pH 11.0，再加入0.5g/L OP，55℃酶促反应20h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为75.1g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐81.5g，收率85％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐3.8g。
实施例八1.将粪肠球菌CGMCC NO.1786在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨1.0％，酵母膏1.0％，牛肉膏0.5％，乳糖0.5％，葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，KH2PO40.2％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，pH 7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞14g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含50g/L L-精氨酸的精氨酸离子交换洗脱液，pH 9.0，再加入0.5g/L OP，45℃酶促反应10h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为37.6g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐40.3g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐2.7g。
实施例九
1.将芽孢杆菌Bacillus thuringiensis CGMCC No.3212在如下500ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨1.0％，酵母膏0.8％，玉米浆1％，果糖0.5％，蔗糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH 7.2。37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿细胞8g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液为含10g/L L-精氨酸的精氨酸离子交换洗脱液，pH 9.0，再加入0.5g/L吐温-80，25℃酶促反应18h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为7.52g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐8.1g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
实施例十
1.将栖息微球菌在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨1.0％，牛肉膏0.3％，玉米浆2％，果糖0.5％，麦芽糖1.0％，NaCl 0.5％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，pH7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞18g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液由重量比含量50％的精氨酸粗品加水配制而成，其中含50g/L的L-精氨酸，pH 8.0，再加入1.0g/L OP，45℃酶促反应10h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为37.6g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐40.8g，收率85％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐2.1g。
实施例十一
1.将粪产碱杆菌ATCC 21400在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：玉米浆2％，NaCl0.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，乳糖0.5％，pH 7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞16g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液由重量比含量80％的精氨酸粗品加水配制而成，其中含100g/L的L-精氨酸，pH 9.0，再加入0.5g/L CTAB，40℃酶促反应16h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为75.1g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐80.5g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐4.8g。
实施例十二
1.将粪肠球菌ATCC 8043在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：豆饼水解液3％，酵母膏1％，果糖1％，乳糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.04％，MgSO4·7H2O 0.03％，pH 7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞17g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液由重量比含量90％的精氨酸盐粗品加水配制而成，其中含150g/L的L-精氨酸，pH 9.0，再加入0.5g/L TritonX-100，40℃酶促反应22h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐120.8g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐7.0g。
实施例十三
1.将粪肠球菌CGMCC NO.1786在如下1000ml培养基(g/ml)中培养：蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖1％，蔗糖0.5％，NaCl 0.5％，KH2PO40.04％，MgSO4·7H2O 0.03％，pH 7.0。37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿细胞15g。
2.将湿菌体加入到1000ml转化液中，转化液由重量比含量95％的精氨酸盐粗品加水配制而成，其中含200g/L的L-精氨酸，pH 9.0，再加入0.5g/L TritonX-100，45℃酶促反应26h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为150.3g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％。
3.将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐161g，收率84％，比旋光(c＝4，6mol/L盐酸)。
4.结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐9.5g。
Claims (4)
1.一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法，其特征是该方法由以下步骤构成：
(1)将粪肠球菌ATCC 8043在如下1000mL质量体积比为g/mL的培养基中培养：玉米浆2.0％，蛋白质水解物0.5％，牛肉膏1％，麦芽糖1.0％，乳糖0.5％，NaCl 0.5％，磷酸二氢钾0.5％，七水硫酸镁0.03％，pH 7.2，37℃振荡培养16h，4000r/min离心15min得湿菌体18g；
(2)将湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液为含150g/L L-精氨酸的精氨酸发酵液，pH 9.0，再加入1.0g/L TritonX-100，40℃酶促反应18h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％；
(3)将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐119.4g，收率83％，比旋光c＝4，6mol/L盐酸；
(4)结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐8.6g。
2.一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法，其特征是该方法由以下步骤构成：
(1)将粪产碱杆菌ATCC 21400在如下1000mL质量体积比为g/mL的培养基中培养：蛋白胨2.0％，牛肉膏1.5％，蔗糖0.5％，果糖1.0％，NaCl 0.5％，磷酸二氢钾0.3％，磷酸氢二钾0.1％，七水硫酸镁0.05％，pH 7.2，37℃振荡培养15h，4000r/min离心15min得湿菌体15g；
(2)将湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液为含150g/L L-精氨酸的精氨酸离子交换洗脱液，pH 9.0，再加入0.5g/L CTAB，45℃酶促反应18h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％；
(3)将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐122.2g，收率85％，比旋光c＝4，6mol/L盐酸；
(4)结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐5.8g。
3.一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法，其特征是该方法由以下步骤构成：
(1)将粪肠球菌ATCC 8043在如下1000mL质量体积比为g/mL的培养基中培养：豆饼水解液3％，酵母膏1％，果糖1％，乳糖0.5％，NaCl 0.5％，磷酸二氢钾0.04％，七水硫酸镁0.03％，pH 7.0，37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿菌体17g；
(2)将湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液由重量比含量90％的精氨酸盐粗品加水配制而成，其中含150g/L的L-精氨酸，pH 9.0，再加入0.5g/L TritonX-100，40℃酶促反应22h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为112.7g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％；
(3)将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐120.8g，收率84％，比旋光c＝4，6mol/L盐酸；
(4)结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐7.0g。
4.一种L-鸟氨酸酶法转化制备方法，其特征是该方法由以下步骤构成：
(1)将粪肠球菌CGMCC NO.1786在如下1000mL质量体积比为g/mL的培养基中培养：蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖1％，蔗糖0.5％，NaCl 0.5％，磷酸二氢钾0.04％，七水硫酸镁0.03％，pH 7.0，37℃振荡培养18h，4000r/min离心15min得湿菌体15g；
(2)将湿菌体加入到1000mL转化液中，转化液由重量比含量95％的精氨酸盐粗品加水配制而成，其中含200g/L的L-精氨酸，pH 9.0，再加入0.5g/L TritonX-100，45℃酶促反应26h，反应结束后取样检测转化液中L-鸟氨酸质量浓度为150.3g/L，对L-精氨酸摩尔转化率为99％；
(3)将转化液离心去除菌体，上清液用6mol/L盐酸中和至pH 6.0，升温至80℃，活性炭脱色、真空抽滤，滤液浓缩至有少量晶体析出，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐161g，收率84％，比旋光c＝4，6mol/L盐酸；
(4)结晶母液回收乙醇后用蒸馏水适当稀释上阳离子交换柱，L-鸟氨酸被吸附，用1mol/L盐酸解吸，流出液用氢氧化钠中和至pH 6.0，活性炭脱色、真空浓缩至有晶体析出，加入3倍体积的无水乙醇，冷却结晶，抽滤、用少量乙醇洗涤晶体，干燥后得L-鸟氨酸盐酸盐9.5g。
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