CN105886566A - 一种微生物酶法转化生产l-鸟氨酸的方法 - Google Patents

一种微生物酶法转化生产l-鸟氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物酶法转化生产L‑鸟氨酸的方法,包括以下步骤:(1)将具有L‑精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种;(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,进行转化反应得含鸟氨酸的转化液;(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂进行鸟氨酸分离纯化。本发明具有专一性强、转化效率高、反应条件温和、反应周期短、生产成本低的优点,工艺简单易行,适合工业化生产。

Description

一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种L-鸟氨酸的生产方法,特别涉及一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法。
背景技术
鸟氨酸是一种碱性氨基酸。虽在普通蛋白质中不能找到(不属于组成蛋白质的20种氨基酸),但存在于短杆菌酪肽、短杆菌肽S等的抗菌性肽中,另外从深山紫堇根中发现了δ-N-乙酰鸟氨酸。是由精氨酸为碱或精氨酸酶作用分解生成。作为尿素循环的一部分与尿素生成相关,胺甲酰磷酸与鸟氨酸化合生成瓜氨酸和磷酸,瓜氨酸再转化为精氨酸,精氨酸再裂解为尿素和鸟氨酸,其在代谢上具有重要的作用。在生物体内与精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互转变,可与α-酮酸、乙醛酸进行氨基转移,在鸟氨酸脱羟酶作用下脱羧而生成丁二胺,丁二胺能进一步合成至多胺。在鸟类中它与2分子的苯甲酸或苯乙酸等结合成鸟尿酸的形式起解毒作用。
L- 鸟氨酸的制备方法主要有化学法、发酵法和酶转化法。
1、化学法
化学法主要表现为反应步骤多、产品为消旋的 DL-鸟氨酸。化学法合成鸟氨酸反应步骤多、收率低,且得到的是消旋体,需要拆分,不适宜大规模生产 L- 鸟氨酸产品。
2、直接发酵法
直接发酵法因原料低廉受到研究者的青睐,近年来取得了很大进展,主要表现在生产菌株的选育和生产工艺的改造方面。20 世纪 90 年代,Tsuchida(US 5188947) 发现给予霉酚酸等抗性标记后,L- 鸟氨酸质量浓度可提高到 40~55g/L。直接发酵法的不足之处在于:菌种的不稳定性、发酵工艺参数控制、发酵液中 L- 鸟氨酸的分离提取等过程都存在亟待解决的问题。
3、酶转化法
酶法转化因具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分离等优点而日益受到重视,是低成本生产 L- 鸟氨酸的有效方法。
CN 1661026 A发明采用固定化细胞酶法水解L- 精氨酸,底物转化率 95%以上,L- 鸟氨酸得率 80%以上。CN 102286563 A发明利用纤维素载体固定化重组表达的精氨酸酶,用交联剂交联后酶法转化底物 L- 精氨酸,前 10 次使用底物转化率 90%以上。
酶法制备 L-鸟氨酸的方法中以精氨酸酶水解法最接近工业化应用,但反应底物 L-精氨酸成本相对较高。因此寻找来源丰富、成本低廉的 L-精氨酸工业原料并实现酶法生产 L- 鸟氨酸关键技术的突破是研究的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,具有专一性强、转化效率高、反应条件温和、反应周期短、生产成本低的优点,工艺简单易行,适合工业化生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,包括以下步骤:
(1)将具有L-精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种;
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;
(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;
(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,进行转化反应得含鸟氨酸的转化液;
(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂进行鸟氨酸分离纯化。强酸性阳离子交换树脂进行鸟氨酸分离纯化的洗脱过程为:先用去离子水洗脱上柱液上柱后的离子交换树脂,至流出液无盐分即停止洗脱;然后以0.1mol/L的氨水进行第一次洗脱,洗脱流速为2-5L/h,期间通过薄层层析法检测流出液中是否含有鸟氨酸,从鸟氨酸流出开始,氨水浓度从0.1mol/L至0.5mol/L,至每个氨水浓度无法洗出鸟氨酸再换下一个浓度,最后洗至薄层层析无鸟氨酸斑点即结束,收集含鸟氨酸的洗脱液。最终鸟氨酸的洗脱率为98.71%。在45-85℃下旋转蒸发,浓缩后,用无水乙醇结晶,烘干后得纯度为99%左右的鸟氨酸。洗脱液用量为树脂重量用量的2-3倍。
本发明首次采用枯草芽孢杆菌发酵培养以获得精氨酸酶,无需分离纯化精氨酸酶,直接使用含精氨酸酶的湿菌体进行转化反应,显著降低了生产成本。针对获得的含精氨酸酶的湿菌体设计特定的转化体系,控制转化条件,L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的摩尔转化率可达95-99.5%。本发明针对转化产物,设计了针对性的分离纯化工艺,大大提高了分离纯化的效果,简化了工艺。
作为优选,步骤(1)中斜面培养基组成为:蛋白胨5-20g/L、酵母膏5-25g/L、NaCl 1-15g/L、琼脂5-30g/L,糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配置;斜面培养条件:30-50℃下培养6-72h。
作为优选,步骤(2)中扩大培养的培养基组成为:L-Arg 2-20g/L,酵母膏10-50g/L,蛋白胨5-25g/L,葡萄糖10-50g/L,无机氮源1-10g/L、糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配制。
作为优选,步骤(2)中扩大培养的条件为:温度30-50℃、100-300rpm的振荡速度下,培养6-72h。
作为优选,步骤(3)中发酵培养基的组成为:L-Arg 2-20g/L,酵母膏10-50g/L,蛋白胨5-25g/L,葡萄糖10-50g/L,无机氮源1-10g/L、糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配制。
作为优选,步骤(3)中发酵培养的条件为:温度30-50℃、100-300rpm的振荡速度下,培养6-72h。
作为优选,步骤(4)中所述转化体系中各组分浓度为:精氨酸50-300g/L,缓冲液0.1-0.3mol/L,湿菌体5-50 g/L,催化剂0.02-0.2g/L。优选,所述缓冲液为碳酸盐缓冲液,所述湿菌体经0.1% 的生理盐水清洗后用于转化体系。本发明采用碳酸盐缓冲体系进行精氨酸转化,防止转化过程中PH值的急剧变化,保证转化效率。催化剂为硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、 十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基胺乙酸盐或正十四烷基硫酸钠。
作为优选,步骤(4)中转化反应的条件为:温度30-50℃、50-350rpm的振荡速度下,培养6h以上。在此转化条件下,L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的摩尔转化率可达95-99%。
作为优选,步骤(5)中强酸性阳离子交换树脂型号为001×4、001×7、DL08、DL10、DL16、D001、D002或D006。
作为优选,步骤(5)分离纯化后的鸟氨酸与盐酸、硫酸、醋酸、硝酸或碳酸反应后获得鸟氨酸盐酸盐、鸟氨酸硫酸盐、鸟氨酸醋酸盐、鸟氨酸硝酸盐或鸟氨酸碳酸盐。
本发明的有益效果是:具有专一性强、转化效率高、反应条件温和、反应周期短、生产成本低的优点,工艺简单易行,适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中,若非特指,所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域的常规方法。
实施例1:
一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,包括以下步骤:
(1)将具有L-精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌(市售,ATCC编号:6633)接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种,斜面培养基组成为:蛋白胨5g/L、酵母膏25g/L、NaCl 1g/L、琼脂5g/L,糊精20g/L、碳酸钙15g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁15g/L,调PH 10.0,去离子水配置;斜面培养条件:30℃下培养72h。
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;扩大培养的培养基组成为:L-Arg 2g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨25g/L,葡萄糖10g/L,硫酸铵10g/L、糊精20g/L、碳酸钙15g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1g/L,调PH 10.0,去离子水配制。扩大培养的条件为:温度30℃、100rpm的振荡速度下,培养72h。
(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;发酵培养基的组成为:L-Arg 2g/L,酵母膏10g/L,蛋白胨25g/L,葡萄糖10g/L,硫酸铵10g/L、糊精20g/L、碳酸钙15g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1g/L,调PH 10.0,去离子水配制。发酵培养的条件为:温度30℃、100rpm的振荡速度下,培养72h。
(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,转化体系中各组分浓度为:精氨酸50g/L,缓冲液0.1mol/L,湿菌体10g/L,催化剂(十六烷基三甲基溴化铵)0.02g/L;进行转化反应得含鸟氨酸的转化液。湿菌体经0.1% 的生理盐水清洗后用于转化体系。转化反应的条件为:温度30℃、50rpm的振荡速度下,培养72h。
(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂(市售,001×4阳离子交换树脂)进行鸟氨酸分离纯化。
实施例2:
一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,包括以下步骤:
(1)将具有L-精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌(市售,ATCC编号:6633)接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种,斜面培养基组成为:蛋白胨20g/L、酵母膏5g/L、NaCl 15g/L、琼脂30g/L,糊精5g/L、碳酸钙1g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁1g/L,调PH 5.0,去离子水配置;斜面培养条件:50℃下培养6h。
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;扩大培养的培养基组成为:L-Arg 20g/L,酵母膏50g/L,蛋白胨5g/L,葡萄糖50g/L,氯化铵1g/L、糊精5g/L、碳酸钙1g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁15g/L,调PH 5.0,去离子水配制。扩大培养的条件为:温度50℃、300rpm的振荡速度下,培养6h。
(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;发酵培养基的组成为:L-Arg 20g/L,酵母膏50g/L,蛋白胨5g/L,葡萄糖50g/L,氯化铵1g/L、糊精5g/L、碳酸钙1g/L、磷酸二氢钾15g/L、硫酸镁15g/L,调PH 5.0,去离子水配制。发酵培养的条件为:温度50℃、300rpm的振荡速度下,培养6h。
(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,转化体系中各组分浓度为:精氨酸300g/L,缓冲液0.3mol/L,湿菌体50g/L,催化剂(硬脂酸)0.2g/L;进行转化反应得含鸟氨酸的转化液。湿菌体经0.1% 的生理盐水清洗后用于转化体系。转化反应的条件为:温度50℃、350rpm的振荡速度下,培养6h。
(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂(市售,D001大孔阳离子交换树脂)进行鸟氨酸分离纯化。
实施例3:
一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,包括以下步骤:
(1)将具有L-精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌(市售,ATCC编号:6633)接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种,斜面培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母膏15g/L、NaCl 8g/L、琼脂15g/L,糊精10g/L、碳酸钙8g/L、磷酸二氢钾7g/L、硫酸镁8g/L,调PH 7.0,去离子水配置;斜面培养条件:35℃下培养48h。
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;扩大培养的培养基组成为:L-Arg 10g/L,酵母膏25g/L,蛋白胨15g/L,葡萄糖25g/L,硫酸铵5g/L、糊精10g/L、碳酸钙8g/L、磷酸二氢钾7g/L、硫酸镁8g/L,调PH 7.0,去离子水配制。扩大培养的条件为:温度35℃、180rpm的振荡速度下,培养48h。
(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;发酵培养基的组成为:L-Arg 10g/L,酵母膏25g/L,蛋白胨15g/L,葡萄糖25g/L,硫酸铵5g/L、糊精10g/L、碳酸钙8g/L、磷酸二氢钾7g/L、硫酸镁8g/L,调PH 7.0,去离子水配制。发酵培养的条件为:温度35℃、180rpm的振荡速度下,培养48h。
(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,转化体系中各组分浓度为:精氨酸150g/L,缓冲液0.2mol/L,湿菌体30g/L,催化剂(十二烷基苯磺酸钠)0.1g/L;进行转化反应得含鸟氨酸的转化液。湿菌体经0.1% 的生理盐水清洗后用于转化体系。转化反应的条件为:温度35℃、160rpm的振荡速度下,培养36h。
(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂(市售,DL10强酸阳离子交换树脂)进行鸟氨酸分离纯化。
本发明步骤(5)强酸性阳离子交换树脂进行鸟氨酸分离纯化的洗脱过程为:先用去离子水洗脱上柱液上柱后的离子交换树脂,至流出液无盐分即停止洗脱;然后以0.1mol/L的氨水进行第一次洗脱,洗脱流速为2-5L/h,期间通过薄层层析法检测流出液中是否含有鸟氨酸,从鸟氨酸流出开始,氨水浓度从0.1mol/L至0.5mol/L,至每个氨水浓度无法洗出鸟氨酸再换下一个浓度,最后洗至薄层层析无鸟氨酸斑点即结束,收集含鸟氨酸的洗脱液。最终鸟氨酸的洗脱率为98.71%。在45-95℃下旋转蒸发,浓缩后,用无水乙醇结晶,烘干后得纯度为99%左右的鸟氨酸。洗脱液用量为树脂重量用量的2-3倍。
本发明制备的鸟氨酸可以进一步加工成盐酸盐、硫酸盐、醋酸盐、硝酸盐、碳酸盐等。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种微生物酶法转化生产L-鸟氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将具有L-精氨酸酶活性的枯草芽孢杆菌接种到试管中的斜面培养基上制备成斜面菌种;
(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液;
(3)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养得发酵液;
(4)发酵液离心后收集含精氨酸酶的湿菌体,湿菌体与精氨酸、缓冲液和去离子水配制成转化体系,进行转化反应得含鸟氨酸的转化液;
(5)将含鸟氨酸的转化液经脱色后利用强酸性阳离子交换树脂进行鸟氨酸分离纯化。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)中斜面培养基组成为:蛋白胨5-20g/L、酵母膏5-25g/L、NaCl 1-15g/L、琼脂5-30g/L,糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配置;斜面培养条件:30-50℃下培养6-72h。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(2)中扩大培养的培养基组成为:L-Arg 2-20g/L,酵母膏10-50g/L,蛋白胨5-25g/L,葡萄糖10-50g/L,无机氮源1-10g/L、糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配制。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤(2)中扩大培养的条件为:温度30-50℃、100-300rpm的振荡速度下,培养6-72h。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(3)中发酵培养基的组成为:L-Arg 2-20g/L,酵母膏10-50g/L,蛋白胨5-25g/L,葡萄糖10-50g/L,无机氮源1-10g/L、糊精5-20g/L、碳酸钙1-15g/L、磷酸二氢钾1-15g/L、硫酸镁1-15g/L,调PH 5.0-10.0,去离子水配制。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤(3)中发酵培养的条件为:温度30-50℃、100-300rpm的振荡速度下,培养6-72h。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(4)中所述转化体系中各组分浓度为:精氨酸50-300g/L,缓冲液0.1-0.3mol/L,湿菌体5-50 g/L,催化剂0.02-0.2g/L。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(4)中转化反应的条件为:温度30-50℃、50-350rpm的振荡速度下,培养6h以上。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(5)中强酸性阳离子交换树脂型号为001×4、001×7、DL08、DL10、DL16、D001、D002或D006。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤(5)分离纯化后的鸟氨酸与盐酸、硫酸、醋酸、硝酸或碳酸反应后获得鸟氨酸盐酸盐、鸟氨酸硫酸盐、鸟氨酸醋酸盐、鸟氨酸硝酸盐或鸟氨酸碳酸盐。
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