CN106916857A - 一种生产l‑草铵膦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产L‑草铵膦的方法，该方法以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系由γ‑氨基丁酸/α‑酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明方法在利用转氨酶催化活力高、立体选择性强等优点的同时，解决了转氨酶催化反应不彻底的难题，使催化反应能完全地将底物2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L‑草铵膦，转化率可达100％；本发明方法的最终产品中没有副产物a‑酮戊二酸的积累，反应结束时产品中其他物质如原料谷氨酸的残留量极低，从而极大地简化了L‑草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。

Description

一种生产L-草铵膦的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种生物酶法生产光学纯L-草铵膦的新方法。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是由Hoechst公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱灭生性除草剂。

众所周知，灭生性除草剂市场巨大，占整个除草剂市场的六七成，尤其是在热带、亚热带地区，使用量巨大。目前世界三大除草剂分别为草甘膦、百草枯和草铵膦。在市场使用量方面，草甘膦独占鳌头，近年来全球年使用量在85万吨左右；百草枯紧随其后，2015年的市场份额10万吨左右；而目前草铵膦产量很小，2015年国内产能只有0.6-0.7万吨。

然而，前两大除草剂都遇到了极大的问题：草甘膦的长期大量使用，一是造成大量杂草产生抗性，使草甘膦趋于失效；二是造成严重水土流失和土壤板结；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部等多部委联合发布的1745号公告已说明，百草枯水剂在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用。百草枯退市后，其国内近5万吨的市场空白将极有可能被草铵膦替代。更重要的是，草铵膦乃全球第二大转基因作物的耐受除草剂，使用量仅次于草甘膦，由于作用机理不同，可除去对草甘膦产生抗性的杂草。随着转基因技术的发展，抗草铵膦作物的种类和种植面积会进一步增多，草铵膦完全有可能与草甘膦并驾齐驱，甚至成为除草剂中的第一大品种。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。但目前市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这将极大地提高提高原子经济性、降低生产和使用成本、减轻环境压力。因此，开发一种低成本、可工业化的L-草铵膦生产方法，具有极其重要的经济价值和社会价值。

制备光学纯L-草铵膦的方法主要分两大类：化学法和生物法。化学法包括化学手性合成和化学手性拆分，生物法包括生物催化手性合成以及生物催化手性拆分。

化学手性合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，如Minowa N等利用甘氨酸为起始原料合成L-草铵膦(Hirayama M.Asymmetric Synthesis of(+)-Phosphinothricin and Related Compounds by the Michael Addition of GlycineSchiff Bases to Vinyl Compounds[J].Bulletin of the Chemical Society of Japan,1987,60:1761–1766.)。Zeiss H J等对L-草铵膦的不对称合成做了很多尝试(Enantioselective Synthesis of Both Enantiomers of Phosphinothricin viaAsymmetric Hydrogenation ofα-acylamidoAcrylates[J].Journal of OrganicChemistry,1991,56:1783–1788.)，(Enantioselective Synthesis of L-Phosphinothricin from L-methionine and L-glutamic Acid via L-vinylglycine[J].Tetrahedron,1992,48(38):8263–8270.)。不对称合成法工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，目前仅限于实验室研究，并没有用于工业化制备L-草铵膦。

化学手性拆分法是通过化学合成外消旋DL-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂，进行D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。1998年，Hoechst公司报道了草铵膦消旋体的化学拆分法。将草铵膦消旋体与奎宁成盐后结晶，过滤洗涤后得到高纯度的L-草铵膦酸奎宁盐，再用氨中和得到精草铵膦。收率最高为86％，e.e.值最高为99％(美国专利US5767309)。此工艺主要存在以下缺点，一是需要使用昂贵的手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，也没有相关工业化的报导。

相比之下，生物法具有立体选择性严格、反应条件温和等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。

生物催化的手性拆分技术是先合成消旋的草铵膦衍生物，通过酶的选择性催化反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物消旋后再进行酶催化反应。早在1983年，Hoechst公司就研究过青霉素G酰化酶手性拆分制备L-草铵膦的技术，类似的拆分反应还可以利用蛋白酶、酯酶或酰胺酶，以及乙酰氨基水解酶、腈水解酶、酰胺酶等。Hoechst公司在后续的研究中经过一系列的改进，利用乙酰氨基水解酶，水解N-苯乙酰草铵膦制备L-草铵膦，L-构型N-苯乙酰草铵膦转化率83％，产品ee值66％(美国专利US6686181-B1)。这类生物催化工艺还是存在明显的缺陷：需要合成草铵膦衍生物，产物难以分离，产品光学纯度不高，工艺过程复杂、与化学合成相比优势不大。

生物催化的不对称合成可以针对分子的手性中心，直接合成单一的光学异构体。这类反应中的代表就是酶催化的转氨基作用或酶催化的还原氨化，涉及到的酶分别为转氨酶和谷氨酸脱氢酶。Fang人利用谷氨酸脱氢酶制备L-草铵膦，产品ee值达到89.2％(Fang JM,Lin C H,Bradshaw C W.Enzymes in Organic Synthesis:Oxidoreductions[J].Journal of the Chemical Society.1995,Perkin Transaction 1:967-978)。但目前谷氨酸脱氢酶针对底物PPO存在酶活低、选择性不高等缺点，还需要进一步研究。

Hoechst公司的研究人员则对转氨酶工艺做了一系列研究，产品L-草铵膦浓度最高可达76.1g/L，ee值达到99.9％(Schultz A,Taggeselle P,Tripier D,etal.Stereospecific production of the herbicide phosphinothricin(glufosinate)bytransamination:isolation and characterization of a phosphinothricin-specifictransaminase from Escherichia coli[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology.Jan 1990,56(1):1-6)。反应原理如图1所示。转氨酶工艺具有酶活高、立体选择性高等优点。但也存在两大缺陷，其一是转氨酶催化的反应为可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-PPT，在过量谷氨酸存在的条件下转化率最高也只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行、获得高的转化率，需要3-4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸残余给L草铵膦的分离精制带来了很大的麻烦。

Hoechst公司也曾试图解决这一问题。途径之一就是利用L-天冬氨酸代替L-谷氨酸，L-天冬氨酸经转氨作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不稳定、易分解为丙酮酸，从而打破了转氨反应的平衡(美国专利US6335186 B1)。鉴于此，在上述单酶反应体系下，增加一个草酰乙酸转氨酶，组成双转氨酶偶联反应体系。然而，在偶联反应中仍然需要使用相当量的谷氨酸，谷氨酸与酮戊二酸在反应中形成平衡，其结构又与产品L-PPT极为类似，难以在分离纯化中加以去除；而且还增加了两种需要分离的杂质丙酮酸和L-天冬氨酸，而且此工艺中PPO的转化率也只有85％，效果并不理想。

Hoechst公司随后在中国申请的专利(中国专利CN1349561A)中又提出了一条新工艺，他们筛选得到了能够特异性地催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体。但此工艺效率低下，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在几乎完全消耗大约700mmol/L的原料L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-PPT，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸，原料PPO反应转化率只有52％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的生产L-草铵膦的方法。该方法原料转化率高、分离精制过程简单、产品收率高、生产成本低，易于工业化。

本发明提供一种生产L-草铵膦的方法，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系由γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。

具体原理为：采用2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，在微量L-谷氨酸(反应后无需分离)存在的条件下，通过一个包含三种酶的催化体系作用，将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦。在催化反应过程中，转氨酶将L-谷氨酸的氨基转移到2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成L-草铵膦，L-谷氨酸失去氨基变为α-酮戊二酸；α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下又生成L-谷氨酸，从而实现L-谷氨酸的原位再生，避免了大量L-谷氨酸的使用；谷氨酸脱氢酶催化α-酮戊二酸生成L-谷氨酸需要NADH作为辅酶，反应后生成NAD⁺，而NADH价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD⁺为NADH。反应原理见附图2。

具体的，所述酶催化体系中的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶为离体酶、固定化酶或经工程菌表达的酶。

作为优选，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

具体的，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168或巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium)YYBM1。

作为优选，所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。

具体的，所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168或假单胞菌(Pseudomonas entomophila str.)L48。

本发明中，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

本发明的一个实施方式中，所述酶催化体系包括γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、微量的谷氨酸和辅酶PLP、谷氨酸脱氢酶以及葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和微量的NAD⁺。向该酶反应体系中加入2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，在控制pH和温度的条件下，该酶反应体系可以高效地将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦。反应原理如附图3所示。

本发明的一个实施方式中，所述酶催化体系包括γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、微量的谷氨酸和辅酶PLP、谷氨酸脱氢酶以及醇脱氢酶、异丙醇和微量的NAD⁺。向该酶反应体系中加入2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，在控制pH和温度的条件下，该酶反应体系可以高效地将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦。反应原理如附图4所示。

本发明的另一个实施方式中，所述酶催化体系包括γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、微量的谷氨酸和辅酶PLP、谷氨酸脱氢酶以及甲酸脱氢酶、甲酸盐和微量的NAD⁺。向该酶反应体系中加入2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，在控制pH和温度的条件下，该酶反应体系可以高效地将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦。反应原理如附图5所示。

作为优选，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌；所述醇脱氢酶来源于乳酸杆菌；所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母。

具体的，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)DSM319的葡萄糖脱氢酶；所述醇脱氢酶来源于乳酸杆菌(Lactobacillus kefiri)DSM20587的醇脱氢酶。

作为优选，催化体系中，以酶活力为单位，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶的添加量均为100～100000U/L；更优选，添加量为1000～50000U/L。

催化体系中，底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的添加量为100～2000mM；辅酶再生底物的添加量为120～2400mM。

作为优选，催化体系中，谷氨酸的添加量为0.1～500mM，更优选为1～100mM，进一步优选为10～50mM；辅酶NAD⁺以及辅酶PLP添加量均为0.01～10mM，更优选为0.1～1mM。

作为优选，催化体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～96h；更优选，温度为30～60℃，时间为12～72h。

作为优选，控制反应的pH值为6～9。采用氢氧化铵(氨水)来控制pH的下降，采用甲酸来控制pH的上升。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦，在利用转氨酶催化活力高、立体选择性强等优点的同时，解决了转氨酶催化反应不彻底的难题，使催化反应能完全地将底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L-草铵膦，转化率可达100％。

(2)本发明方法构建了一种全新的三酶催化体系用于生产L-草铵膦；这种三酶催化体系制备L-草铵膦的工艺路线目前尚未见报导。

(3)本发明方法的最终产品中没有副产物a-酮戊二酸的积累，反应结束时产品中其他物质如原料谷氨酸的残留量极低，从而极大地简化了L-草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。

(4)本发明所用原料易得且成本低廉，生产工艺简单且三废生成量低，是一种绿色、环保、低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。

附图说明

图1为转氨酶法生产L-草铵膦的反应式。

图2为本发明方法所采用的三酶体系生产L-草铵膦的反应式。

图3为本发明方法所采用的三酶体系以葡萄糖脱氢酶再生辅酶生产L-草铵膦的反应式。

图4为本发明方法所采用的三酶体系以醇脱氢酶再生辅酶生产L-草铵膦的反应式。

图5为本发明方法所采用的三酶体系以甲酸脱氢酶再生辅酶生产L-草铵膦的反应式。

图6为原料2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的质谱图；其中，A图为PPO的正源质谱图；B图为PPO的负源质谱图。

图7为本发明涉及的反应物和产物的高效液相检测图谱；

其中，1：保留时间3.244min为L-谷氨酸；2：保留时间:4.041min为草铵膦；3：保留时间:9.117min为a-酮戊二酸；4：保留时间:11.291min为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)。

图8为本发明涉及的草铵膦两个光学异构体的高效液相检测图谱；

其中，1：保留时间5.490min为D-草铵膦；2：保留时间:6.255min为L-草铵膦。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为实验室合成，其质谱图如图6所示；L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的结构式如式(1)所示；L-草铵膦(简称L-PPT)的结构式如式(2)所示；具体如下：

本发明的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/40℃；流速/1mL/min；检测波长/UV205nm；流动相：50mM(NH₄)₂HPO4，加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸调pH至3.6，加入8％乙腈。具体各相关物质出峰情况见附图7。

以柱前衍生化HPLC法测定产品的光学纯度，手性HPLC分析方法为色谱条件：色谱柱/QS-C18；流动相/50mM乙酸钠溶液:乙腈＝8:0.5；检测波长/338nm；流速/0.85mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μL进行分析。D,L-草铵膦出峰情况见附图8。

实施例1基因工程菌菌种构建

1.1表达γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶的基因工程菌的构建

分别从大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组中克隆转氨酶基因，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号分别为CP012868.1、CP010052.1和CP001982.1)设计相应的PCR上游引物和下游引物。

来源于E.coli的转氨酶的引物：

EC-F序列：5’-CCGGAATTCATGAGCAACAATGAATTCCATC-3’(EcoRI)

EC-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAATCGCTCAGCGCATCC-3’(XholI)

来源于Bacillus subtilis的转氨酶的引物：

BS-F序列：5’-CCCGAGCTCATGAGTCAAACAACAGCAAGCATCA-3’(SacI)

BS-R序列：5’-CCCAAGCTTTTAAGCTCGCAGGCCCGCCT-3’(HindIII)

来源于Bacillus magaterium的转氨酶的引物：

BM-F序列：5’-CGCGGATCCATGAGTCAAACTTTTAGCAA-3’(BamHI)

BM-R序列：5’-CCCAAGCTTTTACACTTCAACCGTTTGCT-3’(HindIII)

在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点，如下划线所示，具体限制酶见引物序列括号内。分别以大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组DNA为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：

PCR扩增体系：

PCR扩增条件：

1)预变性：95℃5min；

2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存2.0h。

PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小为1400bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表1所示：

表1 pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系

将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16℃金属浴中连接12h。将酶连产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。再将重组表达载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误的基因工程菌即为E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-gabT。

1.2表达谷氨酸脱氢酶的基因工程菌的构建

分别从大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及假单胞菌Pseudomonas entomophila str.L48基因组(对应NCBI登录号分别为946802、938975、WP_011532995.1)中克隆谷氨酸脱氢酶基因，具体步骤参考1.1中γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶表达菌种构建方法。相关的PCR上游引物和下游引物如下：

来源于E.coli的谷氨酸脱氢酶的引物：

EGldh-F序列：5’-CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGG-3’(BamHI)

EGldh-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAAATCACACCCTGCGCCA-3’(XholI)

来源于Bacillus subtilis的谷氨酸脱氢酶的引物：

BGldh-F序列：5’-CGCGGATCCATGGCAGCCGATCGAAACAC-3’(BamHI)

BGldh-R序列：5’-CCGCTCGAGTTATATCCAGCCTCTAAAAC-3’(XholI)

来源于Pseudomonas entomophila的谷氨酸脱氢酶的引物：

PGldh-F序列：5’-CTAGCTAGCATGGCGTTTTTCACCGCAGCC-3’(BamHI)

PGldh-R序列：5’-CCCAAGCTTTCAGGACGGAATCACCACCG-3’(XholI)

1.3其他菌种的构建

从巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319基因组中克隆葡萄糖脱氢酶基因；从乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM20587基因组中克隆醇脱氢酶基因；从博伊丁假丝酵母Candidaboidinii基因组中克隆甲酸脱氢酶基因，具体步骤参考1.1中γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶表达菌种构建方法。相关的PCR上游引物和下游引物如下：

来源于Bacillus megaterium的葡萄糖脱氢酶的引物：

BGdh-F序列：5’-GAAGATCTGATGTATAAAGATTTAGAAGGAAAAGTC-3’(BglⅡ)

BGdh-R序列：5’-CCGCTCGAGTTATCCGCGTC-3’(XholI)

来源于Lactobacillus kefiri的醇脱氢酶的引物：

LAdh-F序列：5’-CCGAATTCATGACCGATCGTCTGAAGGGC-3’(EcoRI)

LAdh-R序列：5’-CCCAAGCTTTCACTGTGCGGTATACCCGCC-3’(HindIII)

来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶的引物：

CFdh-F序列：5’-GGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCTTATACGGT-3’(BamHI)

CFdh-R序列：5’-TACGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTTACCGT-3’(SalI)

实施例2

2.1微生物的培养

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有转氨酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/mL Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.3mM，28℃下诱导培养20h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。

2.2粗酶液的制备

将培养结束后收集到的菌体细胞，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5,20mM咪唑,0.3M NaCl,5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为含转氨酶的粗酶液。

其他酶类的粗酶液制备方法同上。

2.3酶活力的测定

酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(25℃)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

转氨酶的酶活测定：取底物溶液(0.3M谷氨酸、0.1M PPO溶液)250μL，加入0.1M的NH3·NH4Cl缓冲溶液(pH＝7.5)200μL，加入10mM PLP溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、迅速放回金属浴震荡器中，开始计时，25℃反应10min；反应10min后加入500μL 5％的盐酸，取出震荡混匀，反应终止；12000rpm离心三分钟，取上清液，用去离子水稀释10倍，进HPLC分析；根据HPLC测得的L-草铵膦浓度数据，计算酶活。

谷氨酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(20mMα-酮戊二酸溶液)950μL，加入10mMNADH溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。

葡萄糖脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M葡萄糖溶液)950μL，加入10mM NAD⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。

醇脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M异丙醇溶液)950μL，加入10mM NAD⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。

甲酸脱氢酶酶活测定：取底物溶液(0.1M甲酸铵溶液)950μL，加入10mM NAD⁺溶液25μL，置于金属浴震荡器中，25℃保温10min；加入25μL粗酶液，迅速取出用手震荡、到入比色皿中，迅速放入分光光度计内，以时间为横坐标(单位min)、吸光值为纵坐标测定吸光值随时间的变化率，根据事先测定的NADH摩尔吸光系数，即可计算酶活。

实施例3

大肠杆菌E.coli K12W3110来源的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、大肠杆菌E.coli K12W3110来源的谷氨酸脱氢酶、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319来源的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，测定湿细胞酶活，酶活测定方法参考实施例2，三个菌种细胞的酶活分别为932.5U/g湿细胞、338.3U/g湿细胞，993.3U/g湿细胞

将含有PPO 100mM、谷氨酸5mM和磷酸吡哆醛1mM、葡萄糖120mM以及NADH 0.1mM的溶液置于37℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5。依次加入表达大肠杆菌E.coliK12W3110来源的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶的工程菌细胞5g/L、表达来源于大肠杆菌E.coli K12W3110的谷氨酸脱氢酶的工程菌细胞15g/L、表达来源于巨大芽胞杆菌Bacillusmegaterium DSM319的葡萄糖脱氢酶的工程菌细胞5g/L，开始反应，用氨水控制pH＝7.5，反应66小时，液相检测PPO为0mM，转化率为100％；产品L-草铵膦为99.2mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。最终原料谷氨酸残余5.9mM，没有检测到副产物a-酮戊二酸。

实施例4

来源于大肠杆菌E.coli K12W3110的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、来源于大肠杆菌E.coli K12W3110的谷氨酸脱氢酶、来源于巨大芽胞杆菌Bacillus megateriumDSM319的葡萄糖脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO 500mM、谷氨酸30mM、葡萄糖600mM的溶液置于30℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，再加入磷酸吡哆醛1mM和NAD⁺0.1mM；然后依次加入转氨酶粗酶液9000U/L、谷氨酸脱氢酶粗酶液10000U/L、葡萄糖脱氢酶粗酶液10000U/L，开始反应，用氨水控制pH＝7.5，反应26小时，液相检测PPO为0mM，转化率为100％；产品L-草铵膦为490.7mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。最终原料谷氨酸残余28.6mM，没有检测到副产物a-酮戊二酸。

实施例5

来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的谷氨酸脱氢酶、以及来源于乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM20587的醇脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO约600mM、谷氨酸约50mM、异丙醇800mM的溶液置于30℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，再加入磷酸吡哆醛0.75mM和NAD⁺0.55mM；然后依次加入转氨酶粗酶液6000U/L、谷氨酸脱氢酶粗酶液60000U/L、醇脱氢酶粗酶液8000U/L，开始反应，用氨水控制pH＝7.8，反应40小时，液相检测PPO为0mM，转化率为100％；产品L-草铵膦为564.8mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。最终原料谷氨酸残余48.1mM，没有检测到副产物a-酮戊二酸。

实施例6

来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的谷氨酸脱氢酶、以及来源于乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM20587的醇脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎，获得粗酶液，具体方法参考实施例2。分别以粗酶液进行酶的固定化，获得固定化的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、固定化的谷氨酸脱氢酶、以及固定化的醇脱氢酶。(酶的固定化方法参考Nicole End·Kai-Uwe Schoning ImmobilizedBiocatalysts in Industrial Research and Production.Topics in CurrentChemistry(2004)242:273–317)

将含有PPO约750mM、谷氨酸约70mM、异丙醇1000mM的1L反应溶液置于35℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，再加入磷酸吡哆醛0.42mM和NAD⁺0.27mM；然后依次加入固定化的转氨酶(120U/g)50g、固定化的谷氨酸脱氢酶(171U/g)35g、固定化的醇脱氢酶(225U/g)30g，开始反应，用氨水控制pH＝8.0，反应33小时，液相检测PPO为0mM，转化率为100％；产品L-草铵膦为740.7mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。最终原料谷氨酸残余744mM，没有检测到副产物a-酮戊二酸。

实施例7

来源于巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、来源于假单胞菌Pseudomonas entomophila str.L48的谷氨酸脱氢酶、以及来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii的甲酸脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO约1100mM、谷氨酸约40mM、甲酸铵1500mM的溶液置于40℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.3，再加入磷酸吡哆醛0.15mM和NAD⁺0.1mM；依次加入转氨酶粗酶液6000U/L、谷氨酸脱氢酶粗酶液8000U/L、甲酸脱氢酶粗酶液12000U/L，开始反应，用甲酸控制pH＝7.2-7.3，反应30小时，液相检测PPO为0mM，转化率为100％；产品L-草铵膦为1105.9mM，产品光学纯度ee值大于99.9％。最终原料谷氨酸残余42.4mM，没有检测到副产物a-酮戊二酸。

对比例1

来源于巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶，菌种菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO约100mM、谷氨酸300mM的溶液置于40℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，再加入磷酸吡哆醛1mM；加入转氨酶粗酶液10000U/L，反应72小时，液相检测PPO剩余19.4mM，转化率为80.6％；产品L-草铵膦为80.3mM，剩余原料谷氨酸240.1mM，残留副产物a-酮戊二酸74mM。反应数据如下：

对比例2

来源于巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶，菌种菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO约100mM、谷氨酸10mM的溶液置于40℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，再加入磷酸吡哆醛1mM；加入转氨酶粗酶液10000U/L，反应72小时，液相检测PPO剩余79.0mM，转化率为21％；产品L-草铵膦为5.3mM，剩余原料PPO 79.0mM，剩余原料谷氨酸9.1mM，残留副产物a-酮戊二酸4mM。反应数据如下：

对比例3

来源于假单胞菌Pseudomonas entomophila str.L48的谷氨酸脱氢酶、以及来源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii的甲酸脱氢酶，菌种构建参考实施例1。经微生物培养后收集细胞，再进行细胞破碎和酶活的测定，具体方法参考实施例2。

将含有PPO约100mM、谷氨酸约10mM、甲酸铵150mM的溶液置于40℃温浴，用30％氨水调节溶液pH＝7.3，再加入磷酸吡哆醛1mM和NAD⁺0.5mM；依次加入谷氨酸脱氢酶粗酶液8000U/L、甲酸脱氢酶粗酶液12000U/L，开始反应，用甲酸控制pH＝7.2-7.3。每隔24小时取样分析，HPLC检测，未发现明显的L-草铵膦生成，说明此缺乏γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶的反应体系无催化效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种生产L-草铵膦的方法

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggaattca tgagcaacaa tgaattccat c 31

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt taatcgctca gcgcatcc 28

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccgagctca tgagtcaaac aacagcaagc atca 34

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt taagctcgca ggcccgcct 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatcca tgagtcaaac ttttagcaa 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccaagcttt tacacttcaa ccgtttgct 29

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcggatcca tggatcagac atattctctg g 31

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgctcgagt taaatcacac cctgcgcca 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcggatcca tggcagccga tcgaaacac 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgctcgagt tatatccagc ctctaaaac 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctagctagca tggcgttttt caccgcagcc 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccaagcttt caggacggaa tcaccaccg 29

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaagatctga tgtataaaga tttagaagga aaagtc 36

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccgctcgagt tatccgcgtc 20

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccgaattcat gaccgatcgt ctgaagggc 29

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccaagcttt cactgtgcgg tatacccgcc 30

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggatccatga agatcgtttt agtcttatac ggt 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tacgtcgact tatttcttat cgtgttttac cgt 33

Claims (9)

1.一种生产L-草铵膦的方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系由γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化体系中的γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生酶为离体酶、固定化酶或工程菌表达的酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168或巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)YYBM1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或假单胞菌。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌(E.coli)K12W3110或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168或假单胞菌(Pseudomonasentomophila str.)L48。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；或，以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的醇脱氢酶辅酶再生系统；或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物、包含NADH和NAD⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽胞杆菌；所述醇脱氢酶来源于乳酸杆菌；所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，催化体系中，以酶活力为单位，所述γ-氨基丁酸/α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶的添加量均为100～100000U/L。