CN108795835B - 一种基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用。该基因工程菌包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒，所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因；所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。本发明利用基因工程技术，通过在大肠杆菌中表达核糖‑5‑磷酸途径合成的关键基因PdxST，或增强大肠杆菌自身PLP合成途径关键基因epd，pdxJ和dxs的表达，构建得到辅酶强化的转氨酶基因工程菌，不仅显著提高了胞内辅酶PLP的含量，使该基因工程菌在生产L‑草铵膦时无需添加外源PLP，而且还显著提高了转氨酶的酶活和稳定性，延长了转氨酶的半衰期，降低了生产成本，提高了L‑草铵膦的生产效率。

Description

一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用。

背景技术

转氨酶(EC 2.6.1.X)是一类催化氨基转移作用的酶，能够催化氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮或酮酸上，得到手性胺或手性氨基酸，以及副产物酮或酮酸(图1)，因其具有高选择性、高转化率和温和的反应条件赢得了广大研究者的青睐。

使用转氨酶催化合成R-西他列汀(Savile CK,Janey JM,Mundorff EC,Moore JC,Tam S,Jarvis WR,Colbeck JC,Krebber A,Fleitz FJ,Brands J,Devine PN,Huisman GW,Hughes GJ.Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketonesapplied to sitagliptin manufacture.Science 2010；329:305-309.)已经实现工业生产。使用转氨酶能够催化合成多种手性胺如S-利斯的明(Fuchs M,Koszelewski D,TauberK,Kroutil W,Faber K.Chemoenzymatic asymmetric total synthesis of(S)-Rivastigmine usingω-transaminases.Chemical communications 2010；46:5500.)，R-或S-美西律(Koszelewski,Dominik,Pressnitz,Desiree,Clay,Dorina,Kroutil,Wolfgang.Deracemization of MexiletineBiocatalyzed byω-Transaminases,OrganicLetters,2009；11:4810-4812)和手性氨基酸如L-草铵膦(K Bartsch,R Dichmann,PSchmitt,E Uhlmann and A Schulz,Stereospecific Production oftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation andCharacterization of a Phosphinothricin-specific Transaminasefrom Escherichiacoli[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56:1-6.，)L-高苯丙氨酸(Hsueh-Hsia Lo,Shih-KuangHsu,Wei-De Lin,Nei-Li Chan,Wen-Hwei Hsu,AsymmetricalSynthesis of l-Homophenylalanine Using Engineered Escherichia coli AspartateAminotransferase[J].Biotechnology progress,2005,21:411-415)等关键药物手性中间体或手性化学品。

目前，已知的转氨酶都需要磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶，PLP是最通用的辅酶之一，以PLP为辅酶的酶包括转氨酶，脱羧酶，裂解酶，醛缩酶，消旋酶等，在生物体中起到关键作用，参与包括脱羧、转氨、消旋、断裂Cα-Cβ键和α,β-消除反应等超过160种酶促反应，占目前已知细胞中全部反应的4％。

国际上，Schulz A等人(Stereospecific Production oftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation andCharacterization of a Phosphinothricin-specific Transaminasefrom Escherichiacoli[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56:1-6.)(美国专利US5221737)早在上世纪90年代就利用转氨酶生产L-草铵膦；BartschK(美国专利US6335186B1)在上述单酶反应体系下，增加一个谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，组成双转氨酶偶联反应体系；Bartsch K等随后在中国申请的专利(中国专利CN1349561A)中又提出了利用谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体制备L-草铵膦。这些涉及转氨酶的反应中，均需要在体系中加入磷酸吡哆醛(PLP，0.01-0.1mM)作为辅酶，保证转氨反应的正常发生。

国内，杨立荣等在中国申请的专利(公开号CN105603015A，CN106916857A和CN107119084A)均涉及转氨酶在制备L-草铵膦中的应用，反应体系中也都需要加入磷酸吡哆醛(PLP，0.1-1mM)，因此辅酶磷酸吡哆醛(PLP)是转氨酶催化过程中的必要因素。

重组转氨酶的基因工程菌株胞内自身合成的PLP无法满足转氨酶高效转化的要求。其部分原因是大肠杆菌合成PLP主要依赖1-脱氧-5-磷酸木酮糖途径，该途径需要7种酶的参与，合成效率较低，但增强其中关键基因的表达可能提高吡哆醛的含量(专利WO2004029271A1)；相比较下，生物体内存在广泛存在于真菌、植物及部分原核生物细胞中的PLP从头合成途径，底物是细胞中较充足的核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺，且仅需要两个酶参与，即PdxS(又称YaaD、Pdx1或SnzP)和PdxT(又称YaaE、Pdx2或SnoP)，且该路径已应用于1,5-戊二胺的合成(CN 106148373 A，Engineering a pyridoxal 5’-phosphate supply for cadaverine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis[J],Scientific Reports,2005,5(1):1-10)。

L-草铵膦，英文名为：L-Phosphinothricin(简称L-PPT)，一般是指化合物2(S)-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPT)或其与碱性化合物形成的盐(如式(2)所示)，是由赫斯特公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱触杀型除草剂的有效成分，其除草活性为市场上销售的外消旋混合物(如式(1)所示)的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，在L-草铵膦的制备工艺中，为了能够降低生产成本，如何能够在不加入外源PLP的情况下，也能保证转氨酶的正常催化，提高L-草铵膦的生产效率，是研究者们的一个研究方向。

发明内容

本发明提供了一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用，通过构建能够在大肠杆菌胞内大量表达磷酸吡哆醛(PLP)且不影响转氨酶活性的基因工程菌，来解决现有技术中手性氨基酸制备过程中需要外源加入磷酸吡哆醛(PLP)的问题，大大降低生产成本。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒，所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因；

所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～5所示。

SEQ ID NO.2～4所示的核苷酸序列分别为大肠杆菌PLP合成途径中的关键基因epd(D-赤藓糖-4-磷酸脱氢酶，GenBanK：NP_417402.1)，dxs(1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，GenBanK：NP_414954.1)和pdxJ(吡哆醇5'-磷酸合成酶，GenBanK：NP_417059.1)的核苷酸序列。而SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列为DXP-非依赖型的PLP合成途径中所需的PdxS酶(吡哆醛生物合成裂解酶)基因和PdxT酶(谷氨酰胺转酰胺酶)基因通过RBS序列连接而成的核苷酸序列。

上文所述的转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因既可以克隆至不同的载体上进行共转化，也可以克隆至相同载体上进行转化。

进一步地，所述重组质粒由包含转氨酶基因的表达载体I和包含磷酸吡哆醛合成途径酶基因的表达载体II组成。

其中，所述表达载体I为pET28或pCDFDuet；所述表达载体II为pCDFDuet或pACYC。

经试验发现，不同的磷酸吡哆醛合成途径酶基因以及不同的表达载体组合获得的基因工程菌，其表达的转氨酶活性都不相同。

进一步优选，所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.5所示；所述表达载体I为pET28，所述表达载体II为pCDFDuet。

其中，将SEQ ID NO.5所示的PdxST酶(磷酸吡哆醛合成酶)克隆在pCDFDuet上，将转氨酶基因克隆在表达载体I上进行共转化得到的基因工程菌所表达的转氨酶活性最高。

进一步优选，所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述表达载体I为pCDFDuet，所述表达载体II为pACYCDuet。

进一步地，所述重组质粒由同时包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因的共表达载体构成。

进一步优选，所述共表达载体为pETDuet；所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了所述的基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

本发明提供了一种制备L-草铵膦的方法，包括以下步骤：

(1)构建基因工程菌，采用A方案或者B方案；

A.将转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因分别克隆至不同的表达载体上，得到重组质粒I和重组质粒II；再将重组质粒I和重组质粒II共转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌；所述基因工程菌如权利要求1～5任一项所述；

B.将转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因克隆至同一表达载体上，得到重组质粒X；再将重组质粒X转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌；所述基因工程菌如权利要求1、6或7任一项所述；

(2)培养所述基因工程菌，并诱导酶类表达，离心收集细胞，制备静息细胞悬液；

(3)以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在添加氨基供体但不添加磷酸吡哆醛的情况下，利用所述静息细胞悬液作为催化剂，进行还原胺化反应，获得L-草铵膦。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用基因工程技术，通过在大肠杆菌中表达核糖-5-磷酸途径合成的关键基因PdxST，或增强大肠杆菌自身PLP合成途径关键基因epd，pdxJ和dxs的表达，构建得到辅酶强化的转氨酶基因工程菌，不仅显著提高了胞内辅酶PLP的含量，使该基因工程菌在生产L-草铵膦时无需添加外源PLP，而且还显著提高了转氨酶的酶活和稳定性，延长了转氨酶的半衰期，降低了生产成本，提高了L-草铵膦的生产效率。

附图说明

图1为转氨酶催化的反应通式。

图2为关键基因epd，dxs，pdxJ分别和转氨酶TA1双质粒共表达的蛋白表达情况(实施例1)。

图3为PdxST和转氨酶TA1共表达的蛋白表达情况(实施例2和3)。

图4为PdxST和不同转氨酶双质粒共表达的蛋白表达情况(实施例4)。

图5为最优选菌株6D和对照(单独表达TA1)的细胞的半衰期测定(实施例6)。

图6为最优选菌株6D和对照(单独表达TA1)的细胞对L-草铵膦生产的影响(实施例6)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

通过标准的SDS-PAGE测定各重组工程菌的蛋白表达情况，考察转氨酶和提高胞内PLP浓度的基因在重组工程菌中的表达情况。

通过高效液相色谱(HPLC)测定转氨酶对生成L-草铵膦的反应的活力测定和监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：液相色谱仪：Agilent1100；色谱柱型号：AQ-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：50mM磷酸氢二氨水溶液(含0.1％四丁基氢氧化铵，并用磷酸调pH至3.6):乙腈＝92：8。检测波长：205nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃。

通过高效液相色谱(HPLC)测定ω-转氨酶的活力，主要检测rac-苯乙胺和丙酮酸反应生成苯乙酮和丙酮酸的活力，主要检测苯乙酮的生成表征酶的活力。HPLC分析方法为：液相色谱仪：Agilent 1100；色谱柱型号：AQ-C18,5μm,4.6mm×250mm。流动相：水(含0.1％三氟乙酸):乙腈＝2：1。检测波长：245nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃。

通过高效液相色谱(HPLC)测定胞内PLP的浓度，使用反相Ultimate^○R AQ-C18,(4.6×250mm,5μm粒径)，柱温25℃；流速0.5mL/min；检测波长UV254 nm，进样体积20μL。流动相：30mM磷酸二氢钾溶液(pH 6.9)和乙腈，并用梯度洗脱方式，具体程序为：0min时3％乙腈，12min时乙腈增加至85％。样品处理方法：取相同体积的细胞发酵液在4℃、12000rpm条件下离心3min，用生理盐水(0.9％氯化钠溶液)洗涤细胞两次后，用水重悬菌体，在冰水浴中使用超声破碎细胞(功率400W，超声3s，停止7s，工作50个循环)，加入10％体积预冷的100％三氯乙酸(TCA)溶液，涡旋振荡1min，冰上静置5min，4℃、12000rpm条件下离心10min，收集上清液用于测定液相检测胞内PLP的含量。

实施例1通过质粒表达大肠杆菌自身PLP合成途径中的关键酶来提高胞内PLP浓度和转氨酶活性

针对大肠杆菌PLP合成途径中的关键基因epd(D-赤藓糖-4-磷酸脱氢酶，GenBanK：NP_417402.1)，dxs(1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，GenBanK：NP_414954.1)和pdxJ(吡哆醇5'-磷酸合成酶，GenBanK：NP_417059.1)，为便于考察其对提高胞内PLP浓度的影响，将该基因克隆至pCDFDuet-1质粒上，测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌Epd，Dxs和PdxJ。

使用重组法构建epd，dxs和pdxJ的重组质粒，设计的引物序列如下(其中Promoter是用于获得质粒片段，以空载体pCDFDuet-1为模板，其他的引物为目的基因的引物，以大肠杆菌基因组为模板，加粗部分为重组的序列)：

转氨酶TA1(来源于大肠杆菌，Genbank登录号为WP_001087611.1)在生物催化合成L-草铵膦中有重要作用，因而被选为模型转氨酶，用于评价本申请的辅酶强化基因工程菌对转氨酶的表达的效果。转氨酶TA1克隆至质粒pET28上，测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达转氨酶的菌株TA1。

TA1-pET28a-R(Hind III) CCCAAGCTTCTACTGCTTCGCCTCATCAAAAC

为考察关键基因epd,dxs和pdxJ对大肠杆菌胞内产生的PLP的影响和对转氨酶活力的影响，需将关键基因和转氨酶TA1共表达。将关键基因的重组质粒和转氨酶TA1的质粒共转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主中，获得增强PLP合成途径的双质粒共表达的基因工程重组菌。

基因epd和TA1共表达的基因工程菌为6A(含质粒epd-pCDFDuet和TA1-pET28)，基因dxs和TA1共表达的基因工程菌为6B(含质粒dxs-pCDFDuet和TA1-pET28)，基因pdxJ和TA1共表达的基因工程菌为6C(含质粒pdxJ-pCDFDuet和TA1-pET28)。上述菌株经诱导培养后，收集菌体，分别测定胞内PLP浓度，转氨酶活力和细胞密度(OD600)，其中转氨酶活力分别测定两种条件下的活力。

活力1的测定体系为：250μL 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中加入200μL底物(0.5ML-谷氨酸，0.1M PPO混合物，氢氧化钠调pH至7.0)，25μL 20mMPLP，该活力测定表征转氨酶的蛋白表达量；

活力2的测定体系为：250μL 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中加入200μL底物(0.5ML-谷氨酸，0.1M PPO混合物，氢氧化钠调pH至7.0)，25μL水，该活力测定表征转氨酶不外源添加PLP的活力，体现转氨酶的蛋白表达量和胞内PLP浓度的共同作用。

其中，TA1的活力1设为活力对照，即100％，其他活力均为相对活力。具体测定结果如表1所示，双质粒共表达菌株的蛋白表达电泳如图1所示。

结果表明，表达大肠杆菌合成途径的关键基因epd，dxs和pdxJ可以提高胞内PLP的浓度，且不影响细胞的生长，其中表达epd基因的效果最好，dxs次之，pdxJ最差，此时大肠杆菌没有转氨酶的过量表达，因此测不到转氨酶活力；当关键基因和转氨酶TA1实现双质粒共表达时，相比单独表达转氨酶TA1时胞内PLP的浓度均有提高，且细胞生长不受明显影响，且效果最明显的仍是基因epd；其中共表达菌株6A和6C的活力1与对照TA1相比没有明显变化，菌株6B的活力1明显下降，主要原因是在共表达过程中基因dxs和TA1互相竞争，导致TA1的蛋白表达量明显下降；双质粒共表达菌株的活力2相较对照TA1均有提高，说明关键基因的引入对转氨酶的活力2有明显提高的作用，其中菌株6A效果最好，但是其活力(73.4％)离能达到的最高活力(110.4％)仍有一定差距，需其他方法尝试进一步提高胞内PLP的浓度以寻找最优选菌株。

综上所述，通过质粒表达大肠杆菌自身PLP合成途径中的关键酶可以提高胞内PLP的浓度，与转氨酶TA1进行双质粒共表达后，转氨酶活力2(不需要外源PLP，节约成本)明显提高，其中较优菌株为6A(epd-pCDFDuet和TA1-pET28)。

表1 强化大肠杆菌PLP合成途径的关键酶对胞内PLP浓度和转氨酶活力的影响

实施例2通过质粒表达PLP合成酶PdxST来提高胞内PLP浓度和转氨酶活性

除了大肠杆菌自身的PLP合成途径外，其他细菌合成PLP的途径为DXP-非依赖型途径。DXP-非依赖型的PLP合成途径仅需要两个酶(PdxS，即吡哆醛生物合成裂解酶和PdxT，即谷氨酰胺转酰胺酶)的参与，且这两个酶在基因组中以基因簇的形式存在，由RBS序列连接(即为PdxST，即磷酸吡哆醛合成酶，称为PLP合成酶)，因此可以直接将该基因扩增并连接到质粒上。

从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组中克隆PdxST基因(相应的基因序列见SEQ ID NO.1)并连接到质粒pCDFDuet-1上设计的引物序列为：

PdxST-F(Bgl II)：GGAAGATCTGATGGCTCAAACAGGTACTGA

PdxST-R(Xhol I)：CCGCTCGAGTTATACAAGTGCCTTTTGCT

测序正确后，将质粒pdxST-pCDF转化至大肠杆菌B21(DE3)中，获得菌株PdxST-pCDF；将表达TA1的质粒TA1-pET28和pdxST-pCDF质粒共转化至大肠杆菌B21(DE3)中，获得大肠杆菌双质粒共表达菌株6D。将这几株菌诱导培养后，收集菌体，测定细胞密度(OD600)，转氨酶活力(包括活力1和活力2，具体见实施例1)和胞内PLP含量，结果如表2所示。

表2 PLP合成酶PdxST对胞内PLP浓度和转氨酶活力的影响

结果表明，质粒表达PLP合成酶PdxST能够显著提高胞内PLP的浓度，且不会影响细胞的生长；此外，对比单独表达转氨酶的对照TA1，共表达菌株6D的PLP浓度、活力(包括活力1和活力2)均有提高，说明质粒PdxST-pCDF和TA1-pET28的共表达有相互促进的作用，提高了转氨酶的活力，为本发明最优选菌株。

实施例3不同共表达策略对胞内PLP浓度和转氨酶活力的影响

双质粒共表达菌株的表达效果与质粒的拷贝数有较大的关系，考察不同的质粒组合对胞内PLP浓度，转氨酶活力的影响，具体实施方式如下：

将PLP合成酶的基因序列PdxST分别连接到质粒pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pETDuet-1和pRSFDuet-1上，引物序列同实施例2，测序正确后，得到PLP合成酶的重组质粒pdxST-pCDF、PdxST-pACYC、PdxST-pET和PdxST-pRSF；

此外，将转氨酶TA1的序列分别连接到质粒pCDFduet-1和pETDuet-1上，使用的引物均为：

TA1-Duet-F(Bgl II) GGAAGATCTGATGAACAGCAATAAAGAGTTAATG

TA1-Duet-R(Xhol I) CCGCTCGAGCTACTGCTTCGCCTCATCAAAAC

测序正确后，得到转氨酶的重组质粒TA1-pET28、TA1-pETDuet和TA1-pCDFDuet。

将PLP合成酶的质粒和转氨酶的质粒两两组合(避开相同的复制子和抗性基因的组合)，得到的双质粒菌株，具体的质粒组合见表3。

为获得单质粒双启动子共表达PdxST基因和转氨酶TA1的菌株，重新设计引物，将PdxST基因经过酶切和酶连构建到重组质粒TA1-pETDuet上，得到重组质粒PdxST-TA1-pETDuet，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌株6I，具体引物序列为：

PdxST-F(NdeI)：CGCCATATGGATGGCTCAAACAGGTACTGA

PdxST-R(Hind III)：CCCAAGCTTTTATACAAGTGCCTTTTGCT

将上述菌株诱导表达，收集菌体，测定细胞密度(OD600)、胞内PLP浓度和转氨酶活力(含活力1和活力2，具体见实施例1)，结果如表3所示，菌株6D-6I的蛋白表达情况见图3。

表3 质粒表达PLP合成酶对胞内PLP浓度和转氨酶活力的影响

结果表明：对比转氨酶TA1单独表达的情况，PLP合成酶PdxST和转氨酶TA1的共表达均可以提高胞内PLP浓度和转氨酶活力2，但由于酶的共表达会导致表达量降低，使得转氨酶活力1有较大的变化，但这些共表达策略均不如最选优菌株6D的效果好。

实施例4高表达胞内磷酸吡哆醛的基因对其他转氨酶活力的影响

为考察高表达胞内磷酸吡哆醛的基因对其他转氨酶的影响，首先将转氨酶连接到质粒pET28上，获得转氨酶的重组质粒。本发明选取的转氨酶包括，分别来源于大肠杆菌E.coli K12 W3110和芽孢杆菌YM-1，命名缩写及Genbank登录号分别为：TA4(AMC98987.1)、TA5(CAQ33892.1)、和TA21(AAA22252.1)，将目的基因通过酶切、酶连分别构建到质粒pET28a(+)载体上，其中TA21基因由上海生工生物工程技术服务有限公司提供基因全合成服务并将目的基因直接构建在pET28a(+)载体。将测序正确的重组质粒分别转化至BL21(DE3)，获得其他转氨酶单独表达的基因工程菌；将转氨酶的重组质粒分别和PdxST-pCDFDuet质粒共转化至BL21(DE3)，获得其他转氨酶和PdxST基因双质粒共表达的基因工程菌，并在菌株后加C表示共表达菌株，如TA4C、TA5C等。

将上述菌株诱导培养，收集菌体，测定细胞密度(OD600)、胞内PLP浓度和转氨酶活力(包括活力1和活力2)，结果如表4所示。

表4 不同菌株对胞内PLP浓度和转氨酶活力的影响

菌株	PLP浓度(μmol/L)	活力1	活力2	OD<sub>600</sub>
					TA4	0.68	100％	9.8％	4.2
TA4C	3.12	92.7％	61.1％	4.4
					TA5	0.74	100％	11.8％	4.3
TA5C	1.33	87.3％	15.0％	4.4
					TA21	0.86	100％	13.7％	4.1
TA21C	2.44	78.3％	35.8％	4.2

结果表明，不同转氨酶与PLP合成途径酶共表达的效果不同，转氨酶TA1和PLP合成途径酶的匹配性和相容性更好。

实施例5通过大肠杆菌基因组表达PLP合成酶PdxST来提高胞内PLP浓度和转氨酶活性

基因组上整合表达具有能够减少细胞负载，且传代较稳定等优点，因此本发明也考察了基因组表达PLP合成酶对转氨酶活力的影响。本发明使用CRISPR-Cas9技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Applied and Environmental Microbiology,2015,81(7):2506-2514)进行基因编辑，具体操作步骤按照文献报道的标准进行操作，具体引物设计如下：

针对基因编辑的靶点选择设计的引物(以pTargetF质粒作为PCR扩增的模板)如下：

N20-F：ccgttatttgtctattgctggttttagagctagaaatagc

N20-R：cagcaatagacaaataacggactagtattatacctaggac

针对基因编辑过程涉及的修复模板(上下游的同源臂使用E.coli BL21(DE3)的基因组作为扩增的模板，PdxST-pCDFDuet质粒作为PdxST基因片段及T7启动子的扩增模板)，设计引物如下：

EndA-Up-F:taactacccggagccaaaactc

EndA-Down-R:gctcacaggcagcaattgc

endA-PET-F2:GCCTCTAAACGGGTCTTGcctacactagcgggattc

endA-pET-R2:gaatcccgctagtgtaggcaagacccgtttagaggc

通过重叠延伸PCR的方法获得修复模板

将质粒pTargetF和修复模板电转化至E.coli BL21(DE2)感受态，挑取单菌落进行培养，进行菌液PCR验证，确定获得阳性克隆，即获得基因组表达PdxST的基因工程菌。制备经基因组表达PdxST的基因工程菌的感受态，将转氨酶TA1转化至工程菌内，即可获得经基因组编辑的TA1基因工程重组菌，编号6J。经诱导培养，收集菌体，测定细胞密度(OD600)，胞内PLP浓度和转氨酶TA1的活力，结果如表5所示。

结果表明，基因组表达PdxST对胞内PLP的浓度的提高不明显，且降低了转氨酶TA1的活力1，对活力2的提高也远远不如质粒表达PdxST的效果。

表5.基因组表达PLP合成酶PdxST对转氨酶活力的影响

实施例6最优选菌株6D对转氨酶稳定性和催化制备L-草铵膦的影响

提高胞内PLP浓度对共表达的转氨酶的稳定性和催化活力有较明显的提高作用，以最优选的菌株6D为例(实施例2)验证其效果。

1、菌株6D中转氨酶的稳定性

菌株6D经诱导表达后，收集菌体，在-80℃冰箱冻24h，即使用冻融法破碎细胞，利于检测反应，与同样条件获得的单独在pET28a(+)质粒上表达的TA1菌体，在45℃和50℃下保温，定时取样测定活力1，测定其活力随时间变化的曲线，计算相应的半衰期，结果如图5所示。

结果表明，菌株6D可将转氨酶重组菌在45℃的半衰期约由1.9h提高到3.8h，在50℃下的半衰期约由1h提高到1.7h，说明提高胞内PLP的浓度对转氨酶热稳定性的提高有明显作用。

2、菌株6D催化制备L-草铵膦

将最优的基因工程重组菌6D用于L-草铵膦的生产，同时使用单独表达的TA1转氨酶作为对照，分别设置不添加PLP和添加终浓度为1mM PLP的对照组作为催化剂，取样测定反应进程。

反应体系(20mL)为：400mM PPO、1M Glu、发酵菌体为15mL培养液(LB培养基，25℃诱导培养14h)离心得到的菌体。取样后用5倍体积的0.5M HCl终止反应，稀释10倍后进行液相检测，根据生成的L-PPT量和PPO的剩余量绘制反应的过程曲线，如图6所示。

结果表明，重组菌6D相比对照组反应速度稍快，在更短的时间达到反应平衡，而对照组添加1mM PLP时反应也较快，基本和重组菌6D持平，而不添加PLP的对照组反应则明显慢，与活力测定的结果基本相符。说明本发明中提高PLP浓度的策略能够有效避免在转氨反应制备L-草铵膦的过程中额外添加PLP，降低了反应过程成本，且减少分离的难度。

综上所述，本发明通过构建表达提高胞内PLP浓度的基因，同时表达能够催化转化L-草铵膦的转氨酶的重组工程菌的方法，具有操作方面，活力高，稳定性好，催化效率高，杂质少，生产成本低，分离简单，适合大规模工业化生产等优点。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例做了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的，而非限制性的。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia Coli)

<400> 1

atgaacagca ataaagagtt aatgcagcgc cgcagtcagg cgattccccg tggcgttggg 60

caaattcacc cgattttcgc tgaccgcgcg gaaaactgcc gggtgtggga cgttgaaggc 120

cgtgagtatc ttgatttcgc gggcgggatt gcggtgctca ataccgggca cctgcatccg 180

aaggtggtgg ccgcggtgga agcgcagttg aaaaaactgt cgcacacctg cttccaggtg 240

ctggcttacg agccgtatct ggagctgtgc gagattatga atcagaaggt gccgggcgat 300

ttcgccaaga aaacgctgct ggttacgacc ggttccgaag cggtggaaaa cgcggtaaaa 360

atcgcccgcg ccgccaccaa acgtagcggc accatcgctt ttagcggcgc gtatcacggg 420

cgcacgcatt acacgctggc gctgaccggc aaggtgaatc cgtactctgc gggcatgggg 480

ctgatgccgg gtcatgttta tcgcgcgctt tatccttgcc cgctgcacgg cataagcgag 540

gatgacgcta tcgccagcat ccaccggatc ttcaaaaatg atgccgcgcc ggaagatatc 600

gccgccatcg tgattgagcc ggttcagggc gaaggcggtt tctacgcctc gtcgccagcc 660

tttatgcagc gtttacgcgc tctgtgtgac gagcacggga tcatgctgat tgccgatgaa 720

gtgcagagcg gcgcggggcg taccggcacg ctgtttgcga tggagcagat gggcgttgcg 780

ccggatctta ccacctttgc gaaatcgatc gcgggcggct tcccgctggc gggcgtcacc 840

gggcgcgcgg aagtaatgga tgccgtcgct ccaggcggtc tgggcggcac ctatgcgggt 900

aacccgattg cctgcgtggc tgcgctggaa gtgttgaagg tgtttgagca ggaaaatctg 960

ctgcaaaaag ccaacgatct ggggcagaag ttgaaagacg gattgctggc gatagccgaa 1020

aaacacccgg agatcggcga cgtacgcggg ctgggggcga tgatcgccat tgagctgttt 1080

gaagacggcg atcacaacaa gccggacgcc aaactcaccg ccgagatcgt ggctcgcgcc 1140

cgcgataaag gcctgattct tctctcctgc ggcccgtatt acaacgtgct gcgcatcctt 1200

gtaccgctca ccattgaaga cgctcagatc cgtcagggtc tggagatcat cagccagtgt 1260

tttgatgagg cgaagcagta g 1281

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia Coli)

<400> 2

atgaccgtac gcgtagcgat aaatggcttc ggtcgcatcg ggcgtaatgt ggttcgtgct 60

ttgtatgaat ccggacgccg ggcggaaatt accgtggtgg caatcaacga actggcggat 120

gctgcgggca tggcgcattt gttgaaatat gacaccagcc atggccgttt tgcatgggaa 180

gtacgacagg aacgcgatca actttttgtt ggtgatgacg ccatccgcgt attgcatgaa 240

cgttcactgc aatcgctccc ctggcgtgaa cttggcgttg atgtagtcct cgactgcacc 300

ggcgtatatg gctcccgcga gcatggcgaa gcgcatattg ccgccggggc caaaaaagtg 360

ctcttttcac atcctggcag taacgatctc gacgcgaccg ttgtttacgg cgtcaatcag 420

gatcaacttc gtgcggaaca ccgcatcgtt tctaacgctt cctgtaccac gaattgcata 480

attcccgtca tcaaattgtt agatgatgcg tacggtattg agtccggcac tgtgaccaca 540

attcactccg ccatgcacga tcaacaggtt attgatgcat accatcctga cctgcgtcgc 600

acccgggcag ccagccagtc gatcattccg gtcgatacta aactggccgc cggtatcaca 660

cgattttttc cgcaatttaa cgatcgcttt gaagcgattg cggtacgtgt gccaaccata 720

aatgtgacgg caatcgattt aagcgtgacg gtgaagaaac ctgtaaaagc caatgaagtc 780

aacctgttgc tgcaaaaagc agcacaaggt gcatttcatg gtatagttga ctatacggaa 840

ttgccgttgg tctctgtaga ttttaaccac gatccgcaca gtgccattgt cgatggcacc 900

caaacccggg tcagtggcgc acacctgatc aaaacgttgg tctggtgcga taacgaatgg 960

ggctttgcta accgaatgct cgacacgacg ttagctatgg ctactgttgc tttcaggtaa 1020

<210> 3

<211> 1863

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia Coli)

<400> 3

atgagttttg atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta 60

cgactgttgc cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc 120

gacagcgtga gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc 180

gtggcgctgc actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat 240

caggcttatc cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag 300

aaaggcggtc tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc 360

gggcattcat caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa 420

ggcaaaaatc gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg 480

tttgaagcga tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac 540

aatgaaatgt cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt 600

tccggtaagc tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaaa aagttttctc tggcgtgccg 660

ccaattaaag agctgctcaa acgcaccgaa gaacatatta aaggcatggt agtgcctggc 720

acgttgtttg aagagctggg ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg 780

gggcttatca ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc 840

atgaccaaaa aaggtcgtgg ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc 900

gtgcctaaat ttgatccctc cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc 960

tattcaaaaa tctttggcga ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg 1020

gcgattactc cggcgatgcg tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg 1080

gatcgctact tcgacgtggc aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg 1140

gcgattggtg ggtacaaacc cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat 1200

gatcaggtgc tgcatgacgt ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc 1260

gcgggcattg ttggtgctga cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg 1320

cgctgcatac cggaaatggt cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg 1380

ctctataccg gctatcacta taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac 1440

gcggtcggcg tggaactgac gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag 1500

cgtcgtggcg agaaactggc gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa 1560

gtcgccgaat cgctgaacgc cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa 1620

gcgttaattc tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc 1680

attatgggcg gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta 1740

cccgtgctga acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg 1800

cgcgccgaac tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca 1860

taa 1863

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia Coli)

<400> 4

atggctgaat tactgttagg cgtcaacatt gaccatatcg ctacgctgcg caacgcgcgc 60

ggtaccgctt acccggatcc ggtgcaggcc gcgtttattg ccgagcaggc gggagcggac 120

ggcattaccg tgcatttacg tgaagatcgc cgtcacatta ctgaccgcga cgtgcgcatc 180

ctgcgtcaga cgctggatac ccgcatgaat ctggagatgg cggtgaccga agagatgctg 240

gcgatcgccg ttgagacgaa gccacatttt tgctgcctgg taccggaaaa gcgtcaggaa 300

gtaacaaccg aaggcggcct ggatgtcgca gggcagcgtg acaaaatgcg cgatgcctgc 360

aaacgtctgg cagatgccgg gattcaggtt tctctgttta ttgacgccga tgaagagcag 420

atcaaagctg cggcagaggt tggcgcaccg tttatcgaga tccacaccgg ttgctatgct 480

gatgccaaaa ctgacgccga acaggcgcaa gagctggcgc gtatcgccaa agccgcgacc 540

tttgccgcaa gcctcggtct gaaagttaac gccggacacg gtctgaccta tcacaacgtg 600

aaagccattg ccgccatccc tgagatgcat gaactgaata tcggtcatgc cattattggt 660

cgtgcagtga tgaccggact gaaagatgcg gtggcagaaa tgaagcgtct gatgctggaa 720

gcgcgtggct aa 732

<210> 5

<211> 1497

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 5

atggctcaaa caggtactga acgtgtaaaa cgcggaatgg cagaaatgca aaaaggcggc 60

gtcatcatgg acgtcatcaa tgcggaacaa gcgaaaatcg ctgaagaagc tggagctgtc 120

gctgtaatgg cgctagaacg tgtgccagca gatattcgcg cggctggagg agttgcccgt 180

atggctgacc ctacaatcgt ggaagaagta atgaatgcag tatctatccc ggtaatggca 240

aaagcgcgta tcggacatat tgttgaagcg cgtgtgcttg aagctatggg tgttgactat 300

attgatgaaa gtgaagttct gacgccggct gacgaagaat ttcatttaaa taaaaatgaa 360

tacacagttc cttttgtctg tggctgccgt gatcttggtg aagcaacacg ccgtattgcg 420

gaaggtgctt ctatgcttcg cacaaaaggt gagcctggaa caggtaatat tgttgaggct 480

gttcgccata tgcgtaaagt taacgctcaa gtgcgcaaag tagttgcgat gagtgaggat 540

gagctaatga cagaagcgaa aaacctaggt gctccttacg agcttcttct tcaaattaaa 600

aaagacggca agcttcctgt cgttaacttt gccgctggcg gcgtagcaac tccagctgat 660

gctgctctca tgatgcagct tggtgctgac ggagtatttg ttggttctgg tatttttaaa 720

tcagacaacc ctgctaaatt tgcgaaagca attgtggaag caacaactca ctttactgat 780

tacaaattaa tcgctgagtt gtcaaaagag cttggtactg caatgaaagg gattgaaatc 840

tcaaacttac ttccagaaca gcgtatgcaa gaacgcggct ggtaagaaca taggagcgct 900

gctgacatgt taacaatagg tgtactagga cttcaaggag cagttagaga gcacatccat 960

gcgattgaag catgcggcgc ggctggtctt gtcgtaaaac gtccggagca gctgaacgaa 1020

gttgacgggt tgattttgcc gggcggtgag agcacgacga tgcgccgttt gatcgatacg 1080

tatcaattca tggagccgct tcgtgaattc gctgctcagg gcaaaccgat gtttggaaca 1140

tgtgccggat taattatatt agcaaaagaa attgccggtt cagataatcc tcatttaggt 1200

cttctgaatg tggttgtaga acgtaattca tttggccggc aggttgacag ctttgaagct 1260

gatttaacaa ttaaaggctt ggacgagcct tttactgggg tattcatccg tgctccgcat 1320

attttagaag ctggtgaaaa tgttgaagtt ctatcggagc ataatggtcg tattgtagcc 1380

gcgaaacagg ggcaattcct tggctgctca ttccatccgg agctgacaga agatcaccga 1440

gtgacgcagc tgtttgttga aatggttgag gaatataagc aaaaggcact tgtataa 1497

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

actttaagaa ggagatatac catgatgacc gtacgcgtag 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tctgttcgac ttaagcatta ttacctgaaa gcaacagtag 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

actttaagaa ggagatatac catgatgagt tttgatattg 40

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tctgttcgac ttaagcatta ttatgccagc caggccttg 39

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

actttataag aaggagatat acatatggct gaattactg 39

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gcagcagcct aggttaatta ttagccacgc gcttccag 38

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

taattaacct aggctgctgc cac 23

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

atgtatatct ccttcttata cttaactaat atactaaga 39

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ccggaattca tgaacagcaa taaagagtta atg 33

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cccaagcttc tactgcttcg cctcatcaaa ac 32

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ggaagatctg atggctcaaa caggtactga 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ccgctcgagt tatacaagtg ccttttgct 29

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ggaagatctg atgaacagca ataaagagtt aatg 34

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

ccgctcgagc tactgcttcg cctcatcaaa ac 32

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cgccatatgg atggctcaaa caggtactga 30

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cccaagcttt tatacaagtg ccttttgct 29

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

ccgttatttg tctattgctg gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

cagcaataga caaataacgg actagtatta tacctaggac 40

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

taactacccg gagccaaaac tc 22

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

gctcacaggc agcaattgc 19

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

gcctctaaac gggtcttgcc tacactagcg ggattc 36

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

gaatcccgct agtgtaggca agacccgttt agaggc 36

Claims (3)

1.一种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因；

所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

所述重组质粒由包含转氨酶基因的表达载体I和包含磷酸吡哆醛合成途径酶基因的表达载体II组成，所述表达载体I为pET28，所述表达载体II为pCDFDuet；或者，所述重组质粒由同时包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因的共表达载体构成，所述共表达载体为pETDuet。

2.如权利要求1所述的基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

3.一种制备L-草铵膦的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建基因工程菌，采用A方案或者B方案：

A.将转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因分别克隆至不同的表达载体上，得到重组质粒I和重组质粒II；再将重组质粒I和重组质粒II共转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌；所述基因工程菌如权利要求1所述；

B.将转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因克隆至同一表达载体上，得到重组质粒X；再将重组质粒X转化至大肠杆菌中，得到基因工程菌；所述基因工程菌如权利要求1所述；

(2)培养所述基因工程菌，并诱导酶类表达，离心收集细胞，制备静息细胞悬液；

(3)以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸或其盐为底物，在添加氨基供体但不添加磷酸吡哆醛的情况下，利用所述静息细胞悬液作为催化剂，进行还原胺化反应，获得L-草铵膦。

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