CN117603935A - 一种ω-转氨酶突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种ω‑转氨酶突变体及其编码基因与应用。本发明构建的ω‑转氨酶嵌合体MwTAMc对底物前西他列汀酮第一次出现催化活性，且表现出严格的(R)‑立体选择性。针对MwTAMc的酶活改造，获得一系列优势突变菌株。突变体MwTAM3、MwTAM4、MwTAM7和MwTAM8的比细胞活力较过表达嵌合体的菌株MwTAMc分别提高了11.28倍、20.33倍、42.33倍和278.48倍。其中，嵌合体和突变体催化2g/L前西他列汀酮时，底物转化率由MwTAMc的4.5％提高到MwTAM4的30.3％，以及MwTAM8的95.6％。最佳优势突变体MwTAM8基本实现了2g/L前西他列汀酮的全转化，具有一定的应用前景。

Description

一种ω-转氨酶突变体及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种ω-转氨酶突变体及其编码基因与应用。
背景技术
手性胺是许多生物活性化合物、农用化学品和精细化学品的手性砌块。在过去的几十年里，可持续地、有效的手性胺合成方法取得了重大的进展，包括传统的金属催化化学还原反应，以及由亚胺还原酶/胺脱氢酶、转氨酶、单胺氧化酶和裂解酶等催化的酶促方法。生物催化法在生产手性胺产品的化学合成中具有吸引力，因为其中温和的反应条件，避免使用潜在污染的金属催化剂和较低的环境影响。转氨酶介导的不对称还原胺化反应，具有高立体选择性和最大理论产率100％等优点，是一种应用广泛的手性胺合成方法。ω-转氨酶(ω-TA，EC 2.6.1.X)是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶，催化氨基供体(通常为丙氨酸或异丙胺(IPA))氨基可逆转移到前手性酮，酮酸，或醛生成相应的手性氨基化合物。ω-TAs通常属于PLP依赖酶超家族中的折叠I型和折叠IV型亚家族。ω-折叠I型(III类转氨酶)的TAs催化的底物具有多样性，但立体特异性只有(S)-选择性。(R)-ω-TAs存在于折叠IV型亚家族(IV类转氨酶)，其中还包括支链氨基酸转氨酶(BCAT)和D-氨基酸转氨酶(DAAT)。(R)-ω-TAs因其不对称合成(R)-胺而受到研究者的关注，因此折叠IV型PLP依赖的酶是挖掘(R)-TAs的关键来源。
ω-TAs的活性形式一般是同源二聚体，活性口袋由两个单体的残基组成，位于二聚体的界面上，形成一个大口袋和一个小口袋。转氨反应遵循乒乓双双反应机制，催化中心是高度保守的赖氨酸。ω-TAs严格的立体选择性使其对合成手性胺具有吸引力，但天然存在的(R)-选择性ω-TAs较少，阻碍了这类产品的合成。到目前为止，只有几十个可查询的(R)-ω-TAs，且大部分不能应用于产业化(R)-胺的合成。ω-TAs的大口袋可以容纳一个大的取代基，如长烷基或芳基，但小口袋里往往只能容纳一个甲基，其底物范围较窄，这进一步障碍了ω-TA的应用。因此，快速、有效地获取(R)-TA具有重要意义。除了在自然界中发现的少数(R)-ω-TAs外，由Hohne组成的研究人员基于数据库挖掘和(R)-ω-TAs序列分析，提出了经验性的决定(R)-ω-TAs选择性的多个关键序列(M.S./>H.Jochens,K.Robins,U.T.Bornscheuer,Rational assignmentofkeymotifs forfunctionguidesinsilico enzyme identification,Nat.Chem.Biol.6(2010)807-813)。然而，已有的(R)-ω-TAs的底物范围有限并很难结合体积庞大的底物。利用蛋白质改造的方法，如定向进化、半理性设计和理性设计等可以有效地裁剪(R)-ω-TAs的活性口袋，以扩大TAs底物范围，进而用于生物合成具有重要药物意义的手性胺。例如，Savile等人合理设计了节杆菌ATA117，开发出一个强大的(R)-选择性ATA，用于不对称制备西格列汀(C.K.Savile,J.M.Janey,E.C.Mundorff,J.C.Moore,S.Tam,W.R.Jarvis,J.C.Colbeck,A.Krebber,F.J.Fleitz,J.Brands,P.N.Devine,G.W.Huisman,G.J.Hughes,Biocatalytic asymmetric synthesisofchiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture,Science(NewYork,N.Y.)329(2010)305-309)。目前，基于数据库中已有的ω-TAs，仍然很难精准的利用蛋白质工程改造选择性高、活性强的(R)-ω-TAs。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种ω-转氨酶突变体及其编码基因，并应用于微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中，以克服现有技术中自然界中存在的(R)-转氨酶稀少、难以催化长侧链底物等问题。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种ω-转氨酶突变体，将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。
本发明提供了一种具有(R)-立体选择性的ω-转氨酶突变体，获得该ω-转氨酶突变体的筛选和改造策略包括：首先以已知的严格R选择性(R)-ω-转氨酶(PDB：5FR9)为探针，在NCBI数据库中筛选序列相似性高且三维结构模型符合折叠类型IV的PLP依赖型转氨酶，以前西他列汀酮的截断(羰基侧链的短链为一个甲基)类似物为底物，催化表征数据库挖掘的ω-转氨酶，获得潜在的能够催化前西他列汀酮的候选ω-转氨酶MwTA，所述ω-转氨酶MwTA源自Mycolicibacterium wolinskyi，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过与严格的(R)-ω-转氨酶(PDB：5FR9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)序列比对后，确定5FR9的(R)-选择性控制的2个关键序列motif，通过片段替换技术，将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第69位至81位(记为motif1，36bp)和第130位至148位(记为motif2，48bp)与(R)-转氨酶5FR9对应片段进行motif替换后获得嵌合体MwTAMc，该MwTAMc嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该MwTAMc嵌合体首次对底物前西他列汀酮具有催化活性，且表现出严格的(R)-选择性。
为提高酶活，第一步将所述MwTAMc嵌合体工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-MwTAMc活化并提取质粒pET28b(+)-MwTAMc，并保存于-20℃。第二步通过SWISS-MODEL进行同源建模，获得嵌合体MwTAMc的三维结构；然后再通过HOTSPOT WIZARD预测嵌合体MwTAMc的活性中心和相关的氨基酸；再通过同源模型与底物的分子对接，考察底物范围内的氨基酸。分析二种方法获得的氨基酸，确定重叠的氨基酸为突变热点，发现影响酶活的关键氨基酸位点。以pET28b(+)-MwTAMc为模板质粒，通过对以上位点进行单位点突变或者定点饱和突变，获得突变质粒，并转化，获得一系列突变体，即将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得的所述ω-转氨酶突变体。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体是将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得：(1)第290位苏氨酸突变为丝氨酸；(2)第292位丙氨酸突变为甘氨酸；(3)第163位亮氨酸突变为异亮氨酸；(4)第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸；(5)第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸；(6)第142为苏氨酸突变为色氨酸；(7)第101位赖氨酸突变为精氨酸；(8)第130位缬氨酸突变为组氨酸；(9)第140位丝氨酸突变为精氨酸。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.5所示。
用邻亚二甲苯二胺作为氨基供体在转氨反应中的颜色变化(亮黄色变为黑褐色)建立高通量筛选方法，利用高通量方法对MwTAMc单位点突变或者定点饱和突变后获得一系列突变体进行优势突变菌株的筛选，得到优势体，再利用气相复筛获得优势突变T290S，A292G和L163IV，接着对三个优势突变进行组合突变获得三突变体MwTAM3(T290S/S292G/L163I)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。再以三突变体的重组质粒pET28b(+)-MwTAM3为模板，通过对M130进行定点饱和突变，获得突变质粒，并转化。利用上述同样的高通量方法得到优势突变体，再利用气相复筛获得优势突变M130V，获得四突体MwTAM4(T290S/S292G/L163I/M130V)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。以叠加饱和突变技术和高通量筛选方法及气相复筛，获得优势七突变体MwTAM7(T290S/S292G/L163I/M130V/F144S/T142W/K101R)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。发现突变体MwTAM7、MwTAM4和MwTAM3相较于其出发菌株MwTAMc的比细胞活力分别提高了42.33倍、20.33倍和11.28倍。
进一步地，对突变体MwTAM7与MwTA进行序列比对，分析片段替换和分子改造后改变的氨基酸，即G69Y,H70T,L73A,V77T,A78F,M130V,N132T,L133V,V135I,G140S,K141S,R142T,K143P和G144F。以pET28b(+)-MwTAM7为模板质粒，通过对以上位点进行定点饱和突变，获得突变质粒并转化，获得突变体文库。利用高通量方法对MwTAM7定点饱和突变文库进行优势突变菌株的筛选，得到优势体，再利用气相复筛获得优势突变V130H，S140R，W142K和S144R。接着pET28b(+)-MwTAM7-V130H为模板质粒，组合叠加另外三个优势突变获得优势八突变体MwTAM8(T290S/S292G/L163I/F144S/T142W/K101R/V130H/S140R)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。八突变体的比细胞活力是七突变体的6.44倍。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，第130位缬氨酸突变为组氨酸，第140位丝氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步优选，所述ω-转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明提供了一种含有编码所述的ω-转氨酶突变体的基因的重组载体或基因工程菌。
第三方面，本发明提供了所述的ω-转氨酶突变体在微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中的应用。
所述应用的方法为：将ω-转氨酶突变体重组表达的工程菌经诱导培养获得的湿细胞作为催化剂，以2g/L前西他列汀酮为底物，以1M异丙胺为氨基供体，以100mM三乙醇胺(TEA)-HCl缓冲液(pH 7.5),1mM磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶,100g/L湿细胞和10％(v/v)DMSO助溶剂为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm(优选30℃、800rpm)条件下进行反应，定期取样检测底物和产物的浓度。
进一步优选，所述湿细胞按如下方法制备：将含ω-转氨酶突变体的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(OD600＝0.6-0.8)，培养液中加入终浓度为0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含ω-转氨酶突变体蛋白的湿菌体。
纯酶按如下方法制备：将含ω-转氨酶嵌合体及突变体的湿菌体以50g/L的量重悬于含0.1mM PLP的pH 7.5、50mM PB缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎30min，超声破碎条件：振幅50％，破碎1s、暂停2s，取破碎混合液，8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液，通过0.45μm膜微过滤后，获得粗酶液，采用镍亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含300mM NaCl、20mM NaH2PO4、0.1mM PLP、pH 7.5)进行预平衡；②以1.0mL/min的流速将粗酶液上样至镍亲和柱；③用缓冲液A以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定；③然后用缓冲液B(含300mM NaCl、20mM NaH2PO4、50mM咪唑、0.1mM PLP、pH 7.5)洗去非特异性结合的杂蛋白脱；③再用缓冲液C(含300mMNaCl、20mM NaH2PO4、500mM咪唑、0.1mM PLP、pH 7.5)洗脱、收集目标蛋白。将收集的洗脱液用含0.1mM PLP的20mM PB缓冲液(pH 7.5)透析过夜，取截留液，即为ω-转氨酶的纯酶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明构建的ω-转氨酶嵌合体MwTAMc对底物前西他列汀酮第一次出现催化活性，且表现出严格的(R)-立体选择性。针对MwTAMc的酶活改造，获得一系列优势突变菌株。突变体MwTAM3、MwTAM4、MwTAM7和MwTAM8的比细胞活力较过表达嵌合体的菌株MwTAMc分别提高了11.28倍、20.33倍、42.33倍和278.48倍。其中，嵌合体和突变体催化2g/L前西他列汀酮时，底物转化率由MwTAMc的4.5％提高到MwTAM4的30.3％，以及MwTAM8的95.6％。最佳优势突变体MwTAM8基本实现了2g/L前西他列汀酮的全转化，具有一定的应用前景。
附图说明
图1为折叠IV类型PLP依赖型酶序列比对。
图2为ω-转氨酶催化截断底物类似物的转化率。
图3为构建新型(R)-ω-转氨酶及蛋白质改造策略。
图4为MwTAMc对接模型的结构分析。
图5为(R)-ω-转氨酶不对称合成西他列汀中间体(R)-APTfpB。
图6为合成产物表征。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1：以底物进化、片段替换策略筛选(R)-ω-转氨酶
1、数据库挖掘潜在的(R)-ω-转氨酶
以已知的严格的(R)-ω-转氨酶ATA117-Rd11(PDB：5FR9)为探针，在NCBI数据库中挖掘序列相似性高且属于折叠类型IV的PLP依赖型转氨酶家族的ω-转氨酶，折叠类型IV的PLP依赖型转氨酶家族主要包含branched-chain amino acid aminotransferases(BCAT)和D-amino acid aminotransferases(DAAT)以及(R)-转氨酶。序列比对结果如图1所示。通过基因合成手段获得8个以大肠杆菌为宿主进行密码子优化后的核苷酸序列，C端添加6×His标签用于蛋白纯化。
2、实验表征ω-转氨酶的催化活性
8个基因序列分别插入质粒pET28b(+)的NcoI/XhoIII酶切位点之间，构建重组表达载体；并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至LB培养基，37℃培养12h，测序确定ω-转氨酶构建成功。
重组工程菌接种至10mL LB培养基中(含50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6-0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，置于28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。
将经摇瓶发酵获得的湿菌体用于对前西他列汀酮(英文名：1-(1-piperidinyl)-4-(2,4,5-trifluorophenyl)-1,3-butanedione，记为PTfpB)及其截断底物类似物(英文名：1-(3-(trifluorom-ethyl)-5,6-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyrazin-7(8H)-yl)butane-1,3-dione，记为SS)的催化验证，湿菌体催化条件如下：将获得的湿菌体以湿重50g/L的量加入pH 7.5的三乙醇胺-盐酸缓冲液(100mM)中重悬，再加入1mM PLP辅酶，10％DMSO助溶剂，2g/L底物PTfpB或SS，在恒温震荡仪中30℃、1200rpm条件下进行反应24小时。取反应液500μL加入等体积乙腈，离心、过滤后上清液用于液相检测底物和产物。结果发现，8个候选转氨酶催化底物PTfpB没有检测到产物生成；8个候选转氨酶对底物SS具有不同程度的转化，见图2。因为底物SS是PTfpB羰基侧链小基团截掉变成甲基的一个类似物，因此，可以推测候选转氨酶具备催化PTfpB的大口袋，但其小口袋仍然无法催化较大的基团；并且候选的8个转氨酶对PTfpB的立体选择性是未知的，因此建立候选转氨酶对PTfpB的催化活性及(R)-选择性是后续实验的一个重要目标。
3、片段替换构建ω-转氨酶嵌合体
转氨酶ATA117-Rd11(PDB:5FR9)是一个强健的(R)-ω-转氨酶，具有广泛的底物谱，能够催化多种羰基侧链小基团比甲基大的底物。根据文献报道，(R)-ω-转氨酶有二段关键基序(motif),二段motif中某些氨基酸表现为特征氨基酸。符合这种基序特征的氨基酸往往表现出(R)-选择性，即二个关键motif中的某些特征氨基酸决定了ω-转氨酶的(R)-选择性。这些特征氨基酸不是严格保守的，存在多种组合共同参与调控底物催化时的选择性。以ATA117-Rd11为例，motif1(氨基酸残基60-71)和motif2(氨基酸残基122-137)的关键特征氨基酸是T62××××Y×T×H，M122VY×××××××××TPFT。因此，基于图1的序列比对，将候选转氨酶的对应motif替换成ATA117-Rd11的2个motif，改造策略见图3a，以此构建的转氨酶嵌合体将可能具备(R)-选择性；并且嵌合体的催化能力可能也将受益于ATA117-Rd11的广泛底物谱。
嵌合体的制备以将motif基因片段作为同源臂的引物设计来实现。以原始菌株中载体pET28b(+)-转氨酶为模板，采用表1引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。将经Clean-up纯化试剂盒(Axygen，USA)纯化所得的PCR产物经过一步克隆试剂盒(Vazyme)的自连体系构建重组质粒，再转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并将克隆子接种至10mL LB平板培养基中，在37℃培养12-16h。测序确定ω-转氨酶嵌合体构建成功。
将获得的转氨酶嵌合体进行步骤2的发酵培养后，获得的湿菌体用于对底物PTfpB的催化。催化反应同步骤2。结果发现，来自Mycolicibacterium wolinskyi的转氨酶构建的嵌合体对底物PTfpB具有微弱的催化能力，比细胞活力约0.039U/g。该转氨酶嵌合体记为MwTAMc。MwTAMc催化产物的对映体过量值(e.e.)通过正相液相色谱检测，无(S)-产物生成，初步判定产物e.e.大于99％。通过底物进化、片段替换等手段的整合策略成功地获得了一个能够催化底物PTfpB生成(R)-产物的转氨酶嵌合体。
表1引物设计
实施例2：计算机挖掘、筛选蛋白质突变位点
以ATA117-Rd11(PDB:5FR9)同源二聚体结构为模板，建立MwTAMc三维同源结构模型，该模型显示出典型的PLP依赖型折叠类型IV的结构特征，见图4a。模型结构与底物PTfpB进行对接，对接结果分析显示，底物口袋由包围辅酶PLP氨基酸残基和活性位点装饰环两个结构域组成，见图4b。距离底物范围包含17个氨基酸，主要参与口袋的形成。17个氨基酸分别是I63、F64、Y69、Y75、T77、M130、T132、F144、I160、L163、K196、Y198、W200、G232、T290、T291和A292。通过计算机辅助HOTSPOT在线热点预测，共获得27个热点，其中A链中有20个残基(A56、F64、F78、T132、323T134,S141,T142,P143,F144,T145,I157,Y158,I160,L163,A186,T190,V191,324Y198、F233和T258)和7个B链残基(A47、K211、R216、A165、F166、325、S207，A215)。结合结构分析和热点预测，共筛选出30个氨基酸。鉴定重叠的氨基酸和关键的残基，得出一个较小的突变体库，包含11个残基，即F64、M130、T132、T142、F144、I160、L163、Y198、T290、T291和A292。我们选择这11个氨基酸残基作为蛋白质酶活改造的主要靶点，改造策略见图3b。
实施例3：(R)-立体选择性的ω-转氨酶突变体文库的构建及筛选
1、出发菌株：
以构建的ω-转氨酶嵌合体MwTAMc为原始菌株，活化并提取质粒，其中MwTAMc氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。
2、定点饱和突变：
(1)突变文库的构建
MwTAMc突变体文库的制备通过定点突变来实现，以MwTAMc中载体为模板，采用表1引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。将经Clean-up纯化试剂盒(Axygen，USA)纯化所得的重组质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并将克隆子接种至10mL LB平板培养基中，在37℃培养12-16h。
(2)初筛
随机挑选平板上的阳性克隆子及原始菌株，接种于96孔板中，加入1000μL LB培养基(含50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。各转接50μL种子液于另一块新的96孔板(加有1000μL含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基)中，37℃，180rpm振荡培养4h后，加入IPTG(终浓度0.10mM)，转至28℃培养12h。所得的细胞通过96孔板离心机，4000rpm，4℃下离心10min，得到突变体的湿菌体。
将含湿菌体的96孔板每个孔中加入300μL磷酸钠缓冲溶液(50mM pH 7.0)重悬细胞，缓冲液中包含1g/LPTfpB，10％DMSO，0.1mM PLP和0.1mM邻亚二甲苯二胺.反应在35℃,200rpm反应2h后，离心终止反应。取200μL上清液加至96孔酶标板的对应位置，在酶标仪中测定吸光值。颜色越黑或者吸光值越高代表突变体酶活越高，从而筛选出突变文库内活力相对较高的突变体，用于进一步的复筛并进行测序验证。
(3)HPLC复筛
对步骤(2)获得的突变体进行优势突变体的筛选，将优势突变体经摇瓶发酵获得湿菌体，湿菌体用于复筛反应，复筛条件如下：将获得的突变体湿菌体以50g/L的量加入pH7.5，50mM的三乙醇胺(TEA)-HCl缓冲液中重悬，再加入终浓度0.5M异丙胺,1mM PLP,1g/LPTfpB，10％DMSO，在恒温震荡仪中30℃、1200rpm条件下进行反应2h，取反应液200μL加入200μL乙腈终止反应。采用HPLC检测突变体细胞酶活，筛选获得优势菌株。
将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存在-80℃冰箱。
3、迭代饱和突变以上一轮突变中最佳突变体为模板，设计其他位点的饱和突变引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。按照高通量筛选、液相复筛的步骤在第一轮突变体的基础上进一步筛选优势突变。重复多轮突变后，最终获得多个MwTAMc阶段性优势突变体菌株MwTAM3、MwTAM4和MwTAM7。
PCR反应体系(25μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，12.5μL2×Phanta缓冲液，0.5μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，0.5μLDNA聚合酶Phanta(诺唯赞，中国)和8.5μL超纯水。
根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸4min)，72℃终延伸10min，16℃保温。
液相检测条件：色谱柱C18(4.6x 250mm,5μm)，流动相：1:110mM NH4Ac/MeCN，流速：1mL/min，柱温：40℃，检测波长：205nm。
4、催化活性
分别将MwTAMc、MwTAM3、MwTAM4和MwTAM7发酵全细胞作为催化剂，以PTfpB为底物，比较各突变体比细胞活力。反应体系选择为1mL，催化剂用量菌体湿重50g/L，pH 7.5、50mM的三乙醇胺(TEA)-HCl缓冲液为反应介质，再加入终浓度0.5M异丙胺,1mM PLP,1g/LPTfpB，10％DMSO，在恒温震荡仪中30℃、1200rpm条件下进行反应2h，取反应液200μL加入200μL乙腈终止反应。采用所述液相检测方法检测产物浓度。
细胞酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.5条件下，每小时生成1μmol产物所需的酶量定义为一个酶活单位U。比细胞酶活定义为每克菌体所具有的活力单位数，U/g。
各突变体比细胞酶活示于表2。
表2 MwTAMc及其突变体比细胞酶活
实施例4：MwTAM7回复突变
蛋白质的自然进化通常是由初级序列的变化所驱动的，可以导致蛋白质的结构和功能的一些改变。凭借追踪一个具有改进属性的突变体的进化路径，我们可以识别出关键的氨基酸残基。通过片段替换和蛋白质改造获得了突变嵌合体MwTAMc和进化突变体MwTAM7，通过比较MwTA原始序列和MwTAM7发现，共14个氨基酸发生了替换或者突变，包括G69Y、H70T、L73A、V77T、A78F、M130V、N132T、L133V、V135I、G140S、369K141S、R142T、K143P和G144F。对14个残基进行反向突变(改造策略见图3c)。所有的反向突变都导致了活性的显著降低或丧失，这表明被取代的氨基酸对于维持目前的特性是很重要的。随后，对14个位置按照实施例3进行了点饱和突变，以进一步探索潜在的有益突变。与MwTAM7相比，前四个优势突变V130H、S140R、W142K和S144R的全细胞活性分别提高了495.3％、97.2％、13.6％和14.9％(表3)。接着通过将V130H与其他三个突变组合，构建双叠加突变，结果显示组合V130H/S140R(菌株记为MwTAM8)对活性的活性表现出预期的协同效应。
表3反向饱和突变中优势突变体
氨基酸位置及突变 比细胞酶活(U/gWCW) 酶活提高(倍)
MwTAM7 1.69 --
V130L 1.42 --
V130H 10.07 4.95
T132S 1.37 --
I135V 0.95 --
S140R 3.34 0.97
S141M 1.20 --
W142K 1.92 0.14
P143A 1.23 --
P143S 1.68 --
S144L 1.11 --
S144V 1.47 --
S144R 1.94 0.15
实施例5：转氨酶的诱导表达
将实施例1和例4获得的转氨酶MwTAMc和MwTAM8单菌落分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6-0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.1mM IPTG，置于28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体细胞。
以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液或全细胞催化PTfpB转化。
实施例6：MwTAMc和MwTAM7纯化、酶活测定及动力学参数表
1、蛋白纯化
将实施例获得的MwTAMc和MwTAM7湿细胞，按照湿菌体总量50g/L的量加入pH 7.5、50mM PB缓冲液含有0.1mM PLP中重悬，在冰水混合物上超声破碎30min，超声破碎条件：振幅50％，破碎1s、暂停2s，取破碎混合液，8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液，通过0.45μm膜微过滤后，获得粗酶液，采用镍亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含300mM NaCl、20mMNaH2PO4、pH 7.5、0.1mM PLP)进行预平衡；②以1.0mL/min的流速将粗酶液上样至镍亲和柱；③用缓冲液A以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定；③然后用缓冲液B(含300mM NaCl、50mM咪唑、20mMNaH2PO4、pH 7.5、0.1mM PLP)洗去非特异性结合的杂蛋白脱；③再用缓冲液C(含300mMNaCl、500mM咪唑、20mM NaH2PO4、pH 7.5、0.1mM PLP)洗脱、收集目标蛋白。将收集的洗脱液用20mM PB缓冲液(pH 7.0、0.1mM PLP)透析过夜，取截留液，即为突变体的纯酶液。所有纯化步骤均在4℃下进行。蛋白浓度用二喹啉甲酸BCA蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。
2、酶活测定
酶活检测标准条件：反应体系选择为1mL，1g/L PTfpB，实施例6方法制备的1mg/mL酶液，pH 7.5、100mM的三乙醇胺(TEA)-HCl缓冲液为反应介质，再加入终浓度0.5M异丙胺,1mM PLP,10％DMSO，在恒温震荡仪中30℃、1200rpm条件下进行反应2h，取反应液200μL加入200μL乙腈终止反应。采用实施例1所述HPLC检测产物浓度。
酶活单位(U)定义为：在上述标准条件下，每小时生成1μmol产物所需的酶量定义为一个酶活单位。比酶活定义为每克蛋白所具有的活力单位数，U/mg。
3、动力学参数测定
测定动力学参数的底物浓度范围是0.5～5g/L,按照实施例6酶活测定方法检测底物转化速率，用GraphPad Prism 8.0.1中Michaelis-Menten米氏方程拟合获得的底物浓度和反应速率的实验数据，得到米氏常数Km和最大反应vmax。进一步，通过公式kcat＝vmax/[E]计算转化数kcat，其中[E]是蛋白摩尔浓度。如表4所示，MwTAM8的kcat值显著增加(从MwTAMc0.56增加到48.40)，MwTAM8的Km值略微下降。总体来看，MwTAM8的催化效率(kcat/Km)相较于MwTAMc明显提高。突变体MwTAM8将进一步应用于底物PTfpB的生物催化转化。
表4MwTAMc和MwTAM8动力学参数
实施例7：转氨酶突变体催化PTfpB制备(R)-APTfpB
以实施例5方法制备的转氨酶湿菌体催化PTfpB不对称合成(R)-产物(英文名：(R)-3-amino-1-(1-piperidinyl)-4-(2,4,5-trifluorophenyl)-1-butanone，记为(R)-APTfpB))。反应体系如下：10mL反应体系中包含100mM TEA-HCl缓冲液(pH 7.5),1M IPA,1mM PLP,2g/LPTfpB,100g/L全细胞和10％(v/v)DMSO用于溶解底物。反应在35℃、800rpm反应48h，定时取样监测反应进程。
如图5所示，MwTAMc，MwTAM4和MwTAM8的转化率分别达到4.5％、30.3％和95.6％。MwTAM8的转化率明显提升。催化产物进一步通过手性HPLC和LC-MS进行分析，结果如图6所示，MwTAMc及突变体表现出优秀的(R)-立体选择性。(R)-APTfpB作为西他列汀合成中间体，进一步应用于西他列汀的合成。

Claims (10)

1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第290位，第292位，第163位，第130位，第144位，第142位，第101位和第140位进行单位点突变或者定点半饱和突变后获得。
2.如权利要求1所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，将如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行下列之一或其中两种以上的组合突变后获得：(1)第290位苏氨酸突变为丝氨酸；(2)第292位丙氨酸突变为甘氨酸；(3)第163位亮氨酸突变为异亮氨酸；(4)第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸；(5)第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸；(6)第142为苏氨酸突变为色氨酸；(7)第101位赖氨酸突变为精氨酸；(8)第130位缬氨酸突变为组氨酸；(9)第140位丝氨酸突变为精氨酸。
3.如权利要求1或2所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.5所示。
4.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
5.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第130位甲硫氨酸突变为缬氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
7.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其构建方法包括以下步骤：将ω-转氨酶的氨基酸序列的第69至81位和第130至148位，与(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列中的对应序列进行片段替换后获得氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的ω-转氨酶嵌合体，将所述ω-转氨酶嵌合体的氨基酸序列的第290位苏氨酸突变为丝氨酸，第292位丙氨酸突变为甘氨酸，第163位亮氨酸突变为异亮氨酸，第144位苯丙氨酸突变为丝氨酸，第142为苏氨酸突变为色氨酸，第101位赖氨酸突变为精氨酸，第130位缬氨酸突变为组氨酸，第140位丝氨酸突变为精氨酸，其中所述ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.如权利要求3所述的一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种含有编码如权利要求1～8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体的基因的重组载体或基因工程菌。
10.权利要求1～8中任意一项所述的ω-转氨酶突变体在微生物催化前西他列汀酮不对称合成西他列汀中间体中的应用。
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