CN117683754A - 腈水解酶突变体及其在农药合成中的应用 - Google Patents

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Abstract

由吡啶环取代苯而制成的新化合物通常具有更高的生物活性、更低的毒性和更高的选择性。因此，合成含吡啶环结构的化合物已成为近年新农药创制工作的主要方向之一。本发明公开了一种腈水解酶的突变体及其在农药合成中的应用，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第134、165、201位点进行单突变或多点联合突变获得的。本发明构建的腈水解酶突变体的比酶活是对照组腈水解酶的100倍。腈水解酶突变体NIT‑T134G/W164Y/L201W用于生物催化合成农药中间体，具有极大的工业应用前景。

Description

腈水解酶突变体及其在农药合成中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种源自伯克霍尔德氏菌的腈水解酶的突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌及在农药中间体的生物催化合成方面的应用。
(二)背景技术
粮食安全是“国之大者”，关系国家经济的大账本、国家安全的大战略。保农药作为快速、高效、经济防治病虫害最重要的武器，在农作物产量、保障粮食安全中起到了至关重要的作用。另一方面，对农药的长期大量使用易造成农产品质量不安全、耕地土壤质量下降等问题，使农业难以持续发展。
在绿色合成有机化合物领域，由吡啶环取代苯而制成的新化合物通常具有更高的生物活性、更低的毒性和更高的选择性。因此，合成含吡啶环结构的化合物已成为近年新农药创制工作的主要方向之一。目前，美国Dow Chemical公司在吡啶类农药的开发和合成中优势明显，拥有众多专利，已开发出包括3,6-二氯吡啶甲酸(又名毕克草)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶甲酸(又名毒莠定)在内的多种吡啶类羧酸绿色农药，广泛应用于农业和畜牧业。而在这些吡啶类羧酸农药的合成过程中，3,4,5,6-四氯吡啶甲酸是一种非常重要的中间体(图1)，市场需求量大，应用前景广阔。例如，目前国内外对于毒莠定的合成的三条主要路线中，以3,4,5,6-四氯吡啶甲酸或3,4,5,6-四氯吡啶甲酸盐为起始原料，先与氨水在高压釜内进行氨解反应，然后再使用盐酸或硫酸进行酸化处理，最后经过滤得到产品毒莠定，收率大约为75-91％，是最为常用的一条路线。
因此，作为毒莠定合成过程中的重要中间体，3,4,5,6-四氯吡啶甲酸的高效合成备受关注。目前，国内外3,4,5,6-四氯吡啶羧酸合成有两种主流方法，均由美国DowChemical公司开发，全部采用全化学合成工艺。一种是以2-甲基吡啶为原料的液相氯化水解工艺。该工艺需通过釜式间歇反应制备，工艺条件控制繁杂，反应选择性难以控制，产品收率低，分离困难，且该工艺同时产生了大量的硫酸盐废水，以及部分未水解的高毒性腈化合物，环保成本高昂。在此基础上，Dow Chemical公司开发的高温气相连续氯化工艺是目前的主流方法。在反应过程中，连续气相反应可提高氯气利用率并降低投料比。但是该工艺仍存在较大的局限性：一是使用的过量氯气对车间要求非常严格；二是反应需保持500℃高温，易使催化剂表面结焦，降低了其活性和使用寿命。
得益于蛋白质工程的科技进步，生物催化已广泛应用于工业化生产。与化学催化剂相比，酶作为绿色天然生物催化剂，在催化化学反应中具有优越的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优点，且反应条件温和、副产物少、环境友好。通过腈水解酶法合成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸具有原子经济性高、反应条件温和、环境友好等优点，因此探索腈水解酶法生产3,4,5,6-四氯吡啶甲酸具有很高的经济价值，且能引起显著的社会效益。但由于工业环境与细胞环境有着很大的差异，所以工业应用中，大多数的野生酶的性能并不能满足工业化的需求。因此，急需找出一种相对简单且有效的方法来解决这一问题。获得能够高效水解3,4,5,6-四氯吡啶腈的腈水解酶成为生物法合成路线合成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸的关键。随着基因工程、分子生物学等技术的发展，蛋白质的分子改造被证实可以用于对酶的各种性质(如酶活力、酶的选择性、酶的底物特异性和酶的稳定性等)进行改造的有效手段。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有腈水解酶对3,4,5,6-四氯吡啶腈活性不高的问题，提供一种高活性腈水解酶系列突变体及利用该腈水解酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于3,4,5,6-四氯吡啶腈等吡啶腈化合物的生物催化合成，催化剂活性是原始菌的100倍。
本发明采用的技术方案是：
一种源自伯克霍尔德氏菌的腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体是将SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列第134、165、201位点进行单突变或多点联合突变获得的。
进一步，优选所述突变体为下列之一：(1)第134位苏氨酸突变为甘氨酸；(2)第165位色氨酸突变为酪氨酸；(3)第201位亮氨酸突变为色氨酸；(4)第134位苏氨酸突变为甘氨酸、第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸。
更优选突变体为第134位苏氨酸突变为甘氨酸、第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，谷氨酰胺替换天冬酰胺，酶变体也可具有非保守性改变。
本发明还提供了所述的腈水解酶突变体的编码基因。
SEQ ID NO.2所示氨基酸序列对应的编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。第134位苏氨酸突变为甘氨酸、第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还提供含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组质粒，以及利用该重组质粒构建的含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。所述重组基因工程菌表达宿主通常为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述腈水解酶突变体可按以下方法获得：将含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌进行培养，并诱导腈水解酶突变体的表达，所得培养液分离纯化得到腈水解酶突变体。
本发明还提供所述腈水解酶突变体在微生物催化5-氯烟腈、3-氯苯腈和3,5-二氯苯腈、3,4,5,6-四氯吡啶腈合成5-氯烟酸、3-氯苯甲酸和3,5-二氯苯甲酸3,4,5,6-四氯吡啶甲酸中的应用。
进一步，所述应用的方法为：
以含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌经诱导培养后的培养液获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的粗酶作为催化剂，以3,4,5,6-四氯吡啶腈为底物，以pH 6.5～8缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃、400～600rpm条件下进行反应，制得3,4,5,6-四氯吡啶甲酸。
进一步，优选缓冲液为pH 7.0、20mM的PBS缓冲液。
优选反应温度为35℃。
进一步，所述转化体系中，底物浓度10～200mM，优选20-100mM。
所述反应结束后，反应液分离纯化，制得3,4,5,6-四氯吡啶甲酸；分离纯化的步骤优选为：反应结束后的转化反应液，经过冷冻干燥后用去离子水溶解，用离子交换柱分离，2M的氨水洗脱，收集洗脱液，用甲醇重结晶，制得3,4,5,6-四氯吡啶甲酸的纯化产品。
所述催化剂的形式可以为酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等：所述菌体的形式包括存活菌体细胞和/或死亡菌体细胞。
所述催化剂为菌体的形式时，催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1～20gDCW/L(DCW细胞干重，优选10g DCW/L)。
进一步，所述湿菌体可按如下方法制备：将含有编码所述的腈水解酶突变体的基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.1～1mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。
本发明所述粗酶可按如下方法制备：按照湿菌体总量100g/L的用量重悬于pH7.0、100mM PBS缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎6min，所得菌体悬液离心，取上清液获得含有腈水解酶突变体的粗酶液。粗酶液可进一步用镍柱纯化、透析脱盐后得到腈水解酶突变体蛋白。
超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s。
本发明腈水解酶及腈水解酶突变体碱基序列全长均为1068bp，从第一个碱基起至第1068个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
本发明所述腈水解酶突变体的获取是采用定点饱和突变技术，使用该技术对腈水解酶基因(SEQ ID NO.1)进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用重悬菌液催化3,4,5,6-四氯吡啶腈，制备3,4,5,6-四氯吡啶甲酸，具体方法如下：第一步将对照菌活化，获得了对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NIT，提取质粒pET28a(+)-NIT，并保存于-20℃。第二步通过SWISS-MODEL与NIT比较，获得同源建模的模板蛋白晶体结构，利用Modeller 9.19同源建模，并进行分子对接，选择合适的突变位点，选择的位点主要是位于活性中心附近的氨基酸残基以及活性中心loop环上的氨基酸残基，设计突变的引物，以pET28a(+)-NIT为模板质粒，进行定点饱和突变，获得突变质粒，并转化，进行优势突变菌的筛选，获得pET28a(+)-NIT-T134G/W165Y/L201W，将优势突变体送样测序并保存。
本发明腈水解酶突变体的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基，包括以下组分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。
与现有技术相比，本发明主要的有益效果主要体现在：本发明通过建立高通量筛选模型，构建大容量突变体文库，筛选获得具有高活性和鲁棒性的超级突变体，其中活力最高的突变体T134G/W165Y/L201W，酶活是野生型NIT的100倍。并进一步分析了突变体催化性能提升的分子机理，优化反应工艺参数，突变体NIT-T134G/W165Y/L201W在催化100mM底物时，转化率可达100％，产物收率高于99％。对腈水解酶突变体催化生物转化后的转化液用离子交换柱来分离产物，再经甲醇重结晶，最后产物从转化液中的回收率达到98％。因此腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W可用于生物催化合成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸，生物催化活性高，反应条件温和，产率高，分离纯化简单，具有极大的工业应用前景。
(四)附图说明
图1是以3,4,5,6-四氯吡啶甲酸为原料合成吡啶类羧酸绿色农药的反应式。
图2是腈水解酶及其突变体纯酶的SDS-PAGE电泳图。M：标准蛋白分子；泳道1：腈水解酶对照纯酶；泳道2：腈水解酶突变体NIT-T134G纯酶；泳道3：腈水解酶突变体NIT-W165Y纯酶；泳道4：腈水解酶突变体NIT-L201W纯酶；泳道5：腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W纯酶。
图3是反应温度对腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W转化的影响。
图4是反应体系pH对腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W转化的影响。
图5是底物浓度对腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W转化的影响。
图6是利用腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W催化3,4,5,6-四氯吡啶腈制备3,4,5,6-四氯吡啶甲酸时间进程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：腈水解酶突变体文库的构建及筛选
腈水解酶突变体文库的制备通过3轮定点饱和突变来实现。
以含有来源于伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)的腈水解酶基因NIT，核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，构建含有重组质粒pET28a(+)-NIT的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NIT为对照菌，从重组大肠杆菌中提取含腈水解酶基因NIT的重组质粒pET28a(+)-NIT,设计突变引物，如表1所示，以E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NIT为模板，对靠近活性口袋的6个位点(Lys-130、Val-136、Trp-165、Glu-166、Pro-189、Gly-202)进行饱和突变PCR，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂平板培养，通过优势菌株筛选，获得腈水解酶突变体NIT-W165Y(即SEQ ID NO.2所示氨基酸第165位色氨酸突变为酪氨酸)。再以E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NIT-W165Y为模板，对epPCR中筛选到的五个随机突变位点(Thr-134、Arg-138、Gln-169、Phe-191、Leu-201)再进行饱和突变，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W(即第134位苏氨酸突变为甘氨酸、第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸)。
表1：腈水解酶定点饱和突变引物设计
具体步骤如下：PCR反应体系(50μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，25μL 2×Phanta缓冲液，1μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，1μL DNA聚合酶和21μL超纯水。根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后29个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸7s)，72℃终延伸10min，16℃保温。将得到的重组质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并将克隆子在37℃培养12h。然后挑出克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，并在37℃，180rpm培养10h。对获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：挑取转化平板上的单菌落置96孔细胞培养板(每个孔中都预先加入了含有50μg/mL卡那霉素的1mL LB液体培养基)中，37℃，200rpm恒温摇床培养3h。之后取出，加入10μL TPTG(终浓度为0.1mM/L)，置于28℃，200rpm恒温摇床诱导10h。在3000rpm的条件下，离心30min。离心后的菌体用1mL 0.85％的生理盐水重悬后转移至1.5mL Ep管中，再次离心，去上清。初筛的反应在1.5mL Ep管中进行。反应体系为：离心后的菌体中加入含有10mM底物3,4,5,6-四氯吡啶腈的DMSO-PBS(v:v＝10:90)溶液1mL，振荡重悬。在温度为35℃，转速为200rpm的条件下，反应5h。离心，取上清在酶标仪上检测300nm处的吸光值，吸光值高于对照组的视为有益突变体进行测序。取有益突变体进行复筛，复筛方法为：挑取转化平板上具有正向突变潜力的单菌落，接种到50mL的LB液体培养基(含50μg/mL的卡那霉素抗性)中，在37℃，150rpm摇床上培养至OD600到0.6～0.8时，加入50μL 0.1mM/mL的IPTG。在28℃，150rpm摇床上诱导8h。离心收集菌体。在50mL三角瓶中进行反应。反应体系：0.1g湿菌体，10mLpH 7.0的PBS缓冲液，10mM的底物3,4,5,6-四氯吡啶腈，在温度35℃，200rpm的条件下反应5h。取1mL反应液离心，取上清，用0.22μm的微滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)检测。
实施例2：腈水解酶的诱导表达
将实施例1出发菌株和实施例1筛选的腈水解酶突变菌株分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化底物3,4,5,6-四氯吡啶腈合成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸。
实施例3：腈水解酶母本及其突变体的纯化
将实施例1获得的优势突变体，根据实施例2所述方法获得突变体湿菌体，分别在8000rpm，4℃下离心10min收集菌体，并用0.9％(w/v)盐水洗涤两次。按照湿菌体总量100g/L的量加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎6min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，获得突变株粗酶液。通过在8000rpm，4℃下离心10min收集上清液(电泳图见图2所示)，将其通过0.45μm膜微过滤后，采用Ni亲和柱纯化突变体蛋白。
使用镍亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含0.3M NaCl、20mM咪唑的pH 8.0、20mM PBS缓冲液)进行预平衡。②用缓冲液A以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定。③然后用缓冲液B(含0.3MNaCl、500mM咪唑的pH 8.0、20mM PBS缓冲液)洗脱目的蛋白。将收集的洗脱液用20mM PBS缓冲液(pH 7.0)透析过夜。所有纯化步骤均在4℃下进行。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质大小。对照菌株纯酶采用相同条件收集，电泳结果示于图2，突变菌株的目标酶表达量较原始菌株的酶表达量没有显著变化，因此，突变体的酶活提高不是酶的表达量增加引起的，与酶自身比活力增加有关。
实施例4：母本腈水解酶及其突变体酶活的测定
35℃下，每分钟催化底物生成1μmol产物所需的酶量定义为一个活力单位，记为U。
酶活检测标准条件：10mL反应体系：10mM 3,4,5,6-四氯吡啶腈底物，pH 7.00.1MPBS缓冲液，100μL上述得到的腈水解酶纯酶液，在35℃，200rpm条件下反应一定时间。取样，离心得到的上清经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC测定产率。
液相检测条件：Thermo C18色谱柱(250×4.6mm；流动相：乙腈：水：85％磷酸＝40:60:0.4；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；紫外检测波长224nm。
蛋白浓度用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。将原始菌株NBIT以及实施例1得到的多个突变体NIT-H136A(即SEQ ID NO.2所示氨基酸第136位组氨酸突变为丙氨酸)、NIT-R138E(氨基酸第138位精氨酸突变为谷氨酸)、NIT-W165G(氨基酸第165位色氨酸突变为甘氨酸)、NIT-W165Y(氨基酸第165位色氨酸突变为酪氨酸)、NIT-E166G(氨基酸第166位谷氨酸突变为甘氨酸)、NIT-E169W(氨基酸第169位谷氨酸突变为色氨酸)、NIT-F191H(氨基酸第191位苯丙氨酸突变为组氨酸)、NIT-L201W(氨基酸第201位亮氨酸突变为色氨酸)，NIT-T134G/W165Y/L201W，T134G/W165Y/L201W，测试酶活数据如表2所示。
表2NIT及其突变体的催化活性
表2结果表明，突变体T134G/W165Y/L201W的酶活是野生型NIT的100倍。
实施例5：母本腈水解酶及其突变体对其他结构类似底物的酶活测定
根据实施例3的描述，获得母本腈水解酶及其突变体纯酶，用以探究突变后对其他结构类似底物的催化性能影响。
酶活检测标准条件：10mL反应体系：10mM底物(分别为5-氯烟腈、3-氯苯腈和3,5-二氯苯腈)，pH 7.00.1M PBS缓冲液，100μL上述得到的腈水解酶纯酶液，在35℃，200rpm条件下反应一定时间。取样，离心得到的上清经0.22μm滤膜过滤后进行HPLC测定产率。测试酶活数据如表3所示。
表3NIT及其突变体对不同底物的催化活性
表3结果表明，突变体T134G/W165Y/L201W对多种氯代苯腈和氯代吡啶腈活力都有较大提高，突变体T134G/W165Y/L201W对底物5-氯烟腈的酶活是野生型NIT的1.38倍，对底物3-氯苯腈的酶活是野生型NIT的6.25倍，对底物3,5-二氯苯腈的酶活是野生型NIT的15.75倍。
实施例6：腈水解酶催化合成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸体系的优化
将实施例2制备好的腈水解酶E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NIT突变体的菌体作为催化剂。
不同反应温度对催化产生3,4,5,6-四氯吡啶甲酸的速率是不一样的，考虑了8个温度梯度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃)。初始反应体系为：100mM 3,4,5,6-四氯吡啶腈底物，pH 7.0、0.1M磷酸钾缓冲液，10g/L的湿菌体，在35℃，200rpm条件下反应5h，取样品处理并进行HPLC检测分析。如图3可见，当反应温度在25℃到35℃之间时，酶活呈上升趋势，在35℃转化率达到最高。当温度继续升高时，转化率开始下降，当反应温度升高至55℃时，转化率为最高值的一半不到。
在上述静息细胞反应体系中，选择反应体系pH:4-9.5来考察不同pH对菌体催化的影响。所用的缓冲液如下，柠檬酸缓冲液：pH 4.0、4.5、5.0、5.5和6.0；PBS缓冲液：pH 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；Tris-HCl缓冲液：pH 7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。反应5h取样品处理并进行HPLC检测分析，以比较不同pH条件下产率。如图4可见，在pH范围在6.5-7.5时，突变体细胞对底物3,4,5,6-四氯吡啶腈的催化效率较好，在pH为7.0时达到最高。当pH大于7.5或小于6.5时，产率下降明显。最终，突变体腈水解酶全细胞催化的最适pH选用pH 7.0的PBS缓冲液。
在上述静息细胞反应体系中，选择反应体系中底物浓度为10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、100mM、150mM和200mM，来考察不同底物浓度对菌体催化的影响。反应24h结束取样品处理并进行HPLC检测分析。结果如图5所示，反应体系中的3,4,5,6-四氯吡啶腈的浓度在40mM及以下时，突变体腈水解酶可在24h内将底物完全水解。底物浓度为50mM时，产物收率高于95％。当底物浓度大于50mM时，产率随底物浓度的升高而降低。当底物浓度达到200mM时，产物收率低于50％。
实施例7：腈水解酶对照组NIT催化3,4,5,6-四氯吡啶腈生成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸
根据实施例2的描述，通过发酵获得腈水解酶对照组NIT湿菌体。将湿菌体NIT催化3,4,5,6-四氯吡啶腈生成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸。
在50mL反应体系中，先将菌体用pH 7.0、100mM的PBS缓冲液重悬，转化体系中菌体加入干重量为10g DCW/L，3,4,5,6-四氯吡啶腈的投料量为100mM，以pH7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在35℃、600rpm条件下反应，24h底物转化率小于1％。
实施例8：腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W催化3,4,5,6-四氯吡啶腈生成3,4,5,6-四氯吡啶甲酸
根据实施例2的描述，通过发酵获得腈水解酶突变体NIT-T134G/W165Y/L201W湿菌体。在50mL反应体系中，先将菌体用pH 7.0、100mM的PBS缓冲液重悬，转化体系中菌体加入干重量为10g DCW/L，3,4,5,6-四氯吡啶腈的投料量为100mM，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在35℃、600rpm条件下反应，每4h取样检测。最终24h底物转化率约为80％(图6)。
实施例9：产物的分离
将腈水解酶生物转化后转化液收集，经过冷冻干燥后用去离子水溶解，用强酸性阳离子交换树脂001×7填充的离子交换柱来分离产物，上柱流速为1.0BV/h。当吸附达到了穿透点时，柱子先用去离子水洗涤，再用2M的氨水进行洗脱，洗脱速度为0.5BV/h，收集洗脱液，并每隔一段时间进行HPLC检测其中所含的3,4,5,6-四氯吡啶甲酸，将收集的洗脱液进行甲醇重结晶。最后产物从转化液中的回收率达到98％。
实施例10：电化学-酶法催化合成毕克草
将实施例8得到的3,4,5,6-四氯吡啶甲酸和碳酸钠(摩尔比1:1.5)于65℃溶于蒸馏水中，安装电极在同样温度条件下进行电解反应，过程中缓慢滴入10mol/L氢氧化钠溶液，维持体系碱性范围pH 9.5～11，直至检测到溶液中3,4,5,6-四氯吡啶甲酸含量低于1％后，降温至25℃，并分批加入10mol/L的氢氧化钠溶液，维持反应体系的pH约13.5，继续反应4小时结束。电解液冷却、过滤后，用浓盐酸调节电解液pH至1.0，冷却、结晶、过滤、干燥，得到3,6-二氯吡啶甲酸的白色针状晶体。剩余的滤液浓缩后使用二氯乙烷萃取三次，脱溶、烘干，得到萃取物即为剩余的3,6-二氯吡啶甲酸，将过滤产品和萃取产品混合，最终收率大于90％，产品中3,6-二氯吡啶甲酸的含量高于99.1％。
实施例11：化学-酶法催化合成毒莠定
将实施例8得到的3,4,5,6-四氯吡啶甲酸溶于一定配比的水放入高压釜内，加入浓度为10～30％(W/V)的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢铵或碳酸铵调节至溶液pH呈中性，再加入一定摩尔比例的氨化剂(氨水、液氨、碳酸等)并密闭反应釜进行氨解反应，具体操作为加热至100～140℃反应0.5～10h，冷却，待釜内温度降到一定程度时，打开反应釜并回收剩余氨气。随后用无机酸(稀硫酸、稀盐酸或稀硝酸)将反应液pH调至1～2，抽滤，取滤渣置于于燥箱中烘干后即得毒莠定产品。

Claims (10)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述腈水解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第134、165、201位点进行单突变或多点联合突变获得的。
2.如权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQID NO.2所示的氨基酸序列第134位苏氨酸突变为甘氨酸；(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第165位色氨酸突变为酪氨酸；(3)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第201位亮氨酸突变为色氨酸；(4)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第134位苏氨酸突变为甘氨酸、氨基酸序列第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸。
3.如权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为：将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第134位苏氨酸突变为甘氨酸、氨基酸序列第165位色氨酸突变为酪氨酸且第201位亮氨酸突变为色氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1～3之一所述的腈水解酶突变体的编码基因。
5.含有如权利要求4所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组质粒。
6.如权利要求5所述的重组质粒构建的含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。
7.如权利要求1～3之一所述的腈水解酶突变体在微生物催化5-氯烟腈、3-氯苯腈和3,5-二氯苯腈、3,4,5,6-四氯吡啶腈合成5-氯烟酸、3-氯苯甲酸和3,5-二氯苯甲酸或3,4,5,6-四氯吡啶甲酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述腈水解酶突变体微生物催化3,4,5,6-四氯吡啶甲酸的应用的方法为：
以含有所述的腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌经诱导培养后的培养液获得的湿菌体或者湿菌体破碎后提取的粗酶作为催化剂，以3,4,5,6-四氯吡啶腈为底物，以pH 6.5～8缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃、400～600rpm条件下进行反应，制得3,4,5,6-四氯吡啶甲酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.0、20mM的PBS缓冲液；反应温度为35℃；底物浓度10～200mM。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于催化剂为菌体的形式时，催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1～20g DCW/L。
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