CN102741406A

CN102741406A - 用于产生莽那亭的方法

Info

Publication number: CN102741406A
Application number: CN2011800042460A
Authority: CN
Inventors: 高仓康彰; 荻野博臣; 杉山雅一; 森健一; 田渕英莉; 石川弘纪; 田上宇乃; 藤井秀美
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2010-10-14
Filing date: 2011-10-12
Publication date: 2012-10-17
Also published as: RU2505606C2; KR20120068872A; RU2012110249A; JPWO2012050125A1; WO2012050125A1; EP2479272A1; EP2479272A4

Abstract

本发明提供了用于改善2R，4R-莽那亭收率的方法。具体而言，本发明提供了用于产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸存在下用L-氨基酸氨基转移酶接触4R-IHOG而形成2S，4R-莽那亭；用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括异构化2S，4R-莽那亭以产生2R，4R-莽那亭；等等。这些产生方法可进一步包括将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG，和使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。

Description

用于产生莽那亭的方法

技术领域

本发明涉及使用L-氨基酸氨基转移酶等产生莽那亭(Monatin)的方法。

背景技术

莽那亭[4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-谷氨酸](4-(indole-3-yl-methyl)-4-hydroxy-glutamic acid)是一种包含于南非的灌木Schlerochitom ilicifolius的根中的氨基酸，并特别期待其作为低热量增甜剂，因为其具有为蔗糖一千数百倍的甜度(参见专利文献1)。莽那亭在位置2和4具有不对称碳原子，且莽那亭的天然存在的立体异构体为2S，4S异构体。已通过有机化学方法合成了非天然存在的三种立体异构体。所有这些立体异构体具有优异的甜度，并期待用作增甜剂。

已报道几种方法作为产生莽那亭的方法(例如，参见专利文献2)。然而，所有报道的方法需要多阶段的步骤，并因此需要改善莽那亭的合成收率。

具体而言，对于用于产生莽那亭的方法，已知下述用于产生2R，4R-莽那亭的方法，即从L-色氨酸(L-Trp)合成吲哚-3-丙酮酸(根据需要，在后文中称作“IPA”)，从所得的IPA和丙酮酸合成4R形式的4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-2-酮戊二酸(根据需要，在后文中称作“4R-IHOG”)，并随后对获得的4R-IHOG进行肟化反应，还原反应和差向异构-结晶方法(常规方法(1))(参见专利文献2)。

然而，醛缩酶步骤(第二步骤)是平衡反应，因此，并不总是在该反应中获得令人满意的收率。

用于产生2R，4R-莽那亭的常规方法(1)

为了改善2R，4R-莽那亭的收率，已经发明了通过一锅法酶反应产生2R，4R-莽那亭的方法(常规方法(2))(参见专利文献3至6)。

专利文献1：JP Sho-64-25757-A

专利文献2：国际公开WO2003/059865

专利文献3：国际公开WO2007/133184

专利文献4：国际公开WO2005/042756

专利文献5：美国专利公开号2006/0252135说明书

专利文献6：美国专利公开号2008/020434说明书

发明内容

发明待解决的问题

本发明的目标是提供以良好收率产生莽那亭的方法。

解决问题的手段

作为广泛研究的结果，本发明发现上述问题可通过使用L-氨基酸氨基转移酶来解决，并完成了本发明。目前尚未知任何作用于4R-IHOG的L-氨基酸-氨基转移酶。

相应地，本发明如下所述：

[1]一种用于产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。

[2][1]的产生方法，进一步包括将酮酸与脱羧酶相接触而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-氨基酸形成的。

[3][1]的产生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。

[4][3]的产生方法，进一步包括将草酰乙酸与草酰乙酸脱羧酶相接触而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-天冬氨酸形成的。

[5][1]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒杆菌属(Corynebacterium)、洛德酵母属(Lodderomyces)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌属(Dietzia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、Carnimonas属、西洋蓍霉属(Yarrowia)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、席蓝细菌(Phormidium)、火球菌属(Pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母属(Saccharomyces)、噬糖菌属(Saccharophagus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)或栖热菌属(Thermus)的微生物。

[6][5]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解纤维芽孢杆菌(Bacilluscellulosilyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、平常假丝酵母(Candida inconspicua)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、微杆菌属菌种(Microbacterium sp.)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronocllolis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假单胞菌(Pseudomonastaetrolens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)、寡养单胞菌属菌种(Stenotrophomonassp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia maris)、Ochrobactrum pseudogrignonense、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowia lypolytica)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、Deinococcus geothermalis、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、Phormidium lapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解噬糖菌(Saccharophagus degradans)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的微生物。

[7][1]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶由与以EQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111表示的氨基酸序列显示90％或更高同一性的氨基酸序列组成。

[8][7]的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，所述氨基酸残基选自下组：位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431处的氨基酸残基。

[9][8]的产生方法，其中所述一种或多种氨基酸残基的突变选自下组：

i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；

ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；

iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；

iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；

v)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；

vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；

vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；

viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；

ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；

x)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和

xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。

[10][1]的产生方法，其中使用表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触。

[11][1]的产生方法，进一步包括将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG。

[12][11]的产生方法，通过将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸与醛缩酶相接触而将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合。

[13][11]的产生方法，其中至少部分用于形成4R-IHOG的丙酮酸是来自由于草酰乙酸脱羧酶的作用从草酰乙酸形成的丙酮酸。

[14][11]的产生方法，进一步包括使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。

[15][14]的产生方法，其中所述色氨酸通过将色氨酸与脱氨酶相接触来脱氨基。

[16][11]或[14]的产生方法，其中所述2S，4R-莽那亭或其盐的产生是在一个反应器中进行的。

[17]一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I)和(II)：

(I)进行[1]的方法而形成2S，4R-莽那亭；和

(II)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。

[18][17]的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。

[19][17]的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。

[20]一种L-氨基酸氨基转移酶，其为选自下组(A)-(D)的蛋白：

(A)蛋白，其由以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53或SEQID NO：61表示的氨基酸序列组成。

(B)蛋白，其包含以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53或SEQID NO：61表示的氨基酸序列。

(C)蛋白，其由与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53或SEQID NO：61表示的氨基酸序列显示90％或更高同一性，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成；和

(D)蛋白，其由在以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53或SEQID NO：61表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成，所述突变选自下组：氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入。

[21][20]的L-氨基酸氨基转移酶，其中L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，其中氨基酸残基选自下组：位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288和位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基。

[22][21]的L-氨基酸氨基转移酶，其中所述一个或多个氨基酸残基的突变选自下组：

i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；

ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；

iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；

iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；

v)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；

vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；

vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；

viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；

ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；

x)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和

xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。

[23]一种多核苷酸，选自下组(a)-(e)：

(a)多核苷酸，其由以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60表示的核苷酸序列组成；

(b)多核苷酸，其包含以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60表示的核苷酸序列；

(c)多核苷酸，其由与以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60表示的氨基酸序列显示90％或更高同一性，并编码具有L-氨基酸氨基转移酶的蛋白的核苷酸序列组成；

(d)多核苷酸，其在严格条件下与由互补于以SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：60表示的核苷酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并编码具有L-氨基酸氨基转移酶活性的蛋白；和

(e)多核苷酸，其编码[20]的L-氨基酸氨基转移酶。

[24]一种表达载体，其包含[23]的多核苷酸。

[25]一种转化体，其导入[24]的表达载体。

[26]一种用于产生L-氨基转移酶的方法，包括在培养基中培养[25]的转化体而获得L-氨基酸氨基转移酶。

[27]一种产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与[20]的L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。

[28]一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I’)和(II’)：

(I’)进行[27]的方法而形成2S，4R-莽那亭；和

(II’)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。

[29][28]的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。

[30][28]的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。

发明的效果

本发明的方法可通过使用L-氨基酸氨基转移酶从4R-IHOG以良好收率产生2S，4R-莽那亭而有助于莽那亭收率的改善。本发明的方法具有下述优点：当从IHOG形成2S，4R-莽那亭时无需使用昂贵的D-氨基酸(D-Asp等)作为底物，或无需添加酶如消旋酶以从L-氨基酸形成D-氨基酸。在本发明的方法中，当不仅进行从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的反应(第三步)，还进行从L-Trp形成IPA的反应(第一步)，和进行从IPA形成4R-IHOG的反应(第二步)时，可在第三步中限定全反应的平衡，并将第二步中的反应平衡极大地移向形成4R-IHOG的方向。在此情况下，本发明的方法使得可通过避免副产物L-Trp(第一步的逆反应的进程)而以非常良好的收率(yield)产生2S，4R-莽那亭。

附图说明

图1是显示本发明的产生方法的一个实例的图。Trp：色氨酸；IPA：吲哚-3-丙酮酸；IHOG：4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-2-酮戊二酸；莽那亭：4-(吲哚-3-基-甲基)-4-羟基-谷氨酸。

图2是显示本发明的产生方法的一个实例的图。缩写与图1中的相同；和

图3是显示本发明的产生方法的一个优选实例的图。L-Trp：L-色氨酸；L-Asp：L-天冬氨酸；OAA：草酰乙酸；PA：丙酮酸；而其他缩写与图1中的相同。

图4是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID166)以400ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。SR-莽那亭：2S，4R-莽那亭；SS-莽那亭：2S，4S-莽那亭；IHOG：4R-IHOG；Trp：L-Trp。

图5是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID189)以80ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。缩写与图4中的那些类似。

图6是显示使用L-氨基酸氨基转移酶突变体(ID296)以80ml规模从L-Trp形成2S，4R-莽那亭的反应的图。缩写与图4中的那些类似。

实施发明的最佳模式

(1)用于产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法

本发明提供了用于产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法(1)。本发明的产生方法可分类为(1-1)一种用于从4R-IHOG产生2S，4R-莽那亭的方法，(1-2)一种用于从IPA和丙酮酸产生2S，4R-莽那亭的方法，和(1-3)一种用于从色氨酸产生2S，4R-莽那亭的方法。方法(1-1)、(1-2)和(1-3)在将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶在L-氨基酸的存在下相接触而形成2S，4R-莽那亭方面是共同的。

(1-1)用于从4R-IHOG产生2S，4R-莽那亭的方法

该方法包括在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭(反应1)。通过在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触，可将L-氨基酸中的氨基基团转移至4R-IHOG而形成2S，4R-莽那亭。

L-氨基酸的类型并不特别限制，只要所述L-氨基酸中的氨基基团可转移至L-氨基酸氨基转移酶的目标底物4R-IHOG。多种L-氨基酸如L-α-氨基酸是已知为此种L-氨基酸。具体而言，此种氨基酸包括L-天冬氨酸，L-丙氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-谷氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，L-甲硫氨酸和L-色氨酸。可将L-氨基酸的盐形式添加至反应溶液。反应溶液中L-氨基酸的浓度为，例如1mM至3M，优选20mM至1M，更优选100mM至500mM。

在一个实施方案中，所述L-氨基酸氨基转移酶可为来源于微生物如细菌、放线菌或酵母的蛋白。微生物的分类可通过本领域公知的分类方法进行，例如，用于NCBI(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)数据库中的分类方法。L-氨基酸氨基转移酶所来源的微生物的实例包括属于节杆菌属、芽孢杆菌属、假丝酵母属、棒杆菌属、洛德酵母属、微球菌属、微杆菌属、诺卡氏菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、寡养单胞菌属、迪茨氏菌属、苍白杆菌属、短波单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、Carnimonas属、西洋蓍霉属、梭菌属、异常球菌属、真杆菌属、乳杆菌属、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷嗜热杆菌属、席蓝细菌属、火球菌属、红球菌属、酵母属、噬糖菌属、中华根瘤菌属、热厌氧杆菌属、栖热袍菌属或栖热菌属的微生物。

具体而言，属于节杆菌属的微生物的实例包括节杆菌属菌种。

属于芽孢杆菌属的微生物的实例包括高地芽孢杆菌、解纤维芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、芽孢杆菌属菌种。属于假丝酵母属的微生物的实例包括挪威假丝酵母、平常假丝酵母。属于棒杆菌属的微生物的实例包括产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌。属于洛德酵母属的微生物的实例包括长孢洛德酵母。属于微球菌属的微生物的实例包括藤黄微球菌。属于微杆菌属的微生物的实例包括微杆菌属菌种。属于诺卡氏菌属的微生物的实例包括小球诺卡氏菌。

属于假单胞菌属的微生物的实例包括绿针假单胞菌(例如，绿针假单胞菌绿针亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis))、香茅醇假单胞菌、莓实假单胞菌、恶臭假单胞菌、产黄假单胞菌、腐臭假单胞菌和假单胞菌属菌种。

属于根瘤菌属的微生物的实例包括放射根瘤菌和根瘤菌属菌种。属于寡养单胞菌属的微生物的实例包括寡养单胞菌属菌种。属于迪茨氏菌属的微生物的实例包括海洋迪茨氏菌。属于苍白杆菌属的微生物的实例包括Ochrobactrum pseudogrignonense。属于短波单胞菌属的微生物的实例包括缺陷短波单胞菌。属于伯克霍尔德氏菌属的微生物的实例包括伯克霍尔德氏菌属菌种。属于Carnimonas属的微生物的实例包括Carnimonas sp.。属于西洋蓍霉属的微生物的实例包括解脂西洋蓍霉。

属于梭菌属的微生物的实例包括解纤维梭菌。属于异常球菌属的微生物的实例包括Deinococcus geothermalis。属于真杆菌属的微生物的实例包括直肠真杆菌。属于乳杆菌属的微生物的实例包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。属于甲烷球菌属的微生物的实例包括詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)。属于甲烷嗜热杆菌属的微生物的实例包括热自养甲烷嗜热杆菌。属于席蓝细菌属的微生物的实例包括Phormidium lapideum。属于火球菌属的微生物的实例包括掘越氏火球菌。属于红球菌属的微生物的实例包括红平红球菌。属于酵母属的微生物的实例包括酿酒酵母。属于噬糖菌属的微生物的实例包括降解噬糖菌。属于中华根瘤菌属的微生物的实例包括苜蓿中华根瘤菌。属于热厌氧杆菌属的微生物的实例包括腾冲热厌氧杆菌。属于栖热袍菌属的微生物的实例包括海栖热袍菌。属于栖热菌属的微生物的实例包括嗜热栖热菌。

在另一个实施方案中，L-氨基酸氨基转移酶可为天然存在的蛋白或人工突变体蛋白。此种L-氨基酸氨基转移酶包括由与以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111表示的氨基酸序列具有高同源性(例如，类似性，同一性)，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成的那些。术语“L-氨基酸氨基转移酶活性”指将L-氨基酸中的氨基转移至用于形成2S，4R-莽那亭(其为具有氨基的目标化合物)的目标底物4R-IHOG的活性。具体而言，所述L-氨基酸氨基转移酶包括由与以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列显示80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，且特别优选98％或更高或99％或更高同源性(例如类似性，同一性)，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成的蛋白。

氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或Pearson的算法FASTA(Methods Enzymol.，183，63(1990))来确定。已基于该算法BLAST开发了称作BLASTP和BLASTN(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的程序。因此，可使用这些程序用缺省设定来计算氨基酸序列和核苷酸序列的同源性。当通过使用GENETYX版本7.0.9(其为来自GENETYX Corporation的软件)并以UnitSize至Compare＝2的设定使用编码于ORF的全长多肽链将匹配计数计算为百分比时获得的数值可用作氨基酸序列的同源性。来源于这些计算的值中的最低值可用作氨基酸序列和核苷酸序列的同源性。

在另一个进一步的实施方案中，所述L-氨基酸氨基转移酶可为由在以SEQID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111表示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基突变(例如缺失，取代，添加和插入)，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成的蛋白。所述一个或几个氨基酸残基的突变可导入氨基酸序列中的一个区或多个不同的区。术语“一个或几个氨基酸残基”指蛋白的活性和三维结构不极大地受损的范围。术语“一个或几个氨基酸残基”在蛋白的情况下指例如1至100，优选1至80，更优选1至50，1至30，1至20，1至10或1至5个氨基酸残基。此种突变可归因于基于携带编码所述L-氨基酸氨基转移酶的基因的微生物的个体差异、种差异等的天然存在的突变(突变体或变体)。

在氨基酸序列中待突变的氨基酸残基的位置对于本领域技术人员是显而易见的。具体而言，本领域技术人员可通过如下来识别结构和功能之间的关联：1)比较多种具有相同类型活性的蛋白的氨基酸序列(例如，以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，和其他L-氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列)，2)阐明相对保守的区和相对不保守的区，然后3)分别由相对保守的区和相对不保守的区来预测能够就其功能起重要作用的区，和不能就其功能起重要作用的区。因此，本领域技术人员可在L-氨基酸氨基转移酶的氨基酸序列中指明待突变的氨基酸残基的位置。

当通过取代突变氨基酸残基时，所述氨基酸的取代可为保守取代。如用于本文，术语“保守取代”意指某些氨基酸残基由具有类似侧链的氨基酸残基所取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域是公知的。此类家族的实例包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，具有不带电极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸或色氨酸)，具有β位分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸或异亮氨酸)，具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸或组氨酸)，具有含羟基基团(例如醇或酚)侧链的氨基酸(例如丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸)，和具有含硫侧链的氨基酸(例如半胱氨酸或甲硫氨酸)。优选地，氨基酸的保守取代可为天冬氨酸和谷氨酸之间的取代，精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的取代，色氨酸和苯丙氨酸之间的取代，苯丙氨酸和缬氨酸之间的取代，亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸之间的取代，和甘氨酸和丙氨酸之间的取代。

在另一个进一步的实施方案中，所述L-氨基酸氨基转移酶可为由DNA编码，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的蛋白，所述DNA在严格条件下与互补于以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：60、SEQID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ IDNO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110表示的核苷酸序列的核苷酸序列杂交。术语“严格条件”指形成所谓特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。尽管难以清楚地定量该条件，该条件的一个实例是具有80％或更高，优选90％或更高，更优选95％或更高，且特别优选98％或更高的同源性的多核苷酸对发生杂交而具有较低同源性的多核苷酸对不发生杂交的条件。具体而言，此种条件包括在6xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在约45℃杂交，然后在0.2x SSC和0.1％SDS中在50至65℃进行一次或两次或更多次洗涤。

在一个优选实施方案中，所述L-氨基酸氨基转移酶可为L-氨基酸氨基转移酶突变体，其中选自以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列中位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288，位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基组成的组的任何氨基酸残基中的一个或多个(例如一个或两个)被突变(例如取代)。L-氨基酸氨基转移酶突变体的优选实例包含一个或多个(例如一个或两个)选自下组的取代：

i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；

ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；

iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；

iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；

v)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；

vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；

vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；

viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；

ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；

x)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和

xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。

对于选自由以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列中位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288，位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基组成的组的任何氨基酸残基中的一个或多个(例如一个或两个)取代的组合，可导入如下所示的组合的突变，尽管可用于本发明的氨基酸取代的组合并不限于下述：

a)T288G

b)S258G/I289A

c)K39R/T288G

d)Q287E/T288G

e)K39R/D109R/T288G/S431T

f)K39R/D109R/T288G/F303L

g)D109R/Q287E/T288G/F303L

h)D109R/S258G/I289A/F303L

i)D 109R/Q287E/T288G/S431T

j)D109R/S258G/I289A/S431T

k)K39R/D109R/E128G/T288G/F303L

l)K39R/D109G/E128G/T288G/F303L

m)D109R/E128G/Q287E/T288G/F303L

n)D109R/E128G/S258G/I289A/S431T

o)D109G/E128G/Q287E/T288G/F303L

p)D109G/E128G/S258G/I289A/F303L

q)K39R/D109G/H150Y/T288G/F303L/D358Y/S431T

r)K39R/D109G/E128G/H150Y/T288G/F303L/D358Y

s)D109G/H150Y/Q287E/T288G/F303L/D358Y/S431T

t)D109G/H150Y/S258G/I289A/F303L/D358Y/S431T

u)D109G/E128G/H150Y/Q287E/T288G/F303L/D358Y或

v)D109G/E128G/H150Y/S258G/I289A/F303L/D358Y

在一个实施方案中，4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶的接触可通过允许4R-IHOG和提取自产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物的L-氨基酸氨基转移酶(提取的酶)共存于反应溶液来达成。产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物的实例包括天然产生所述L-氨基酸氨基转移酶的微生物(例如，前述的微生物)和表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体。具体而言，提取的酶的实例包括纯化的酶、粗酶、固定化的酶、培养液和培养液的经处理的产物(例如，从上述产生酶的微生物制备的含L-氨基酸氨基转移酶的级分，和上述产生酶的微生物的裂解物或受破坏的产物)。用于从培养液获得培养液的经处理的产物的处理的实例包括热处理(42℃至80℃，pH 3至12，1分钟至24小时)，溶剂处理(例如二甲苯，甲苯，乙醇，异丙醇)，表面活性剂(例如Tween 20，Triton X-100)和用细菌溶解酶(bacteriolytic enzyme)(例如溶菌酶处理)的处理。在调整的温度、pH等维持培养液以增强培养液中检测出的酶活性之后，对培养液进行反应。在此情况下，所述温度可设为4℃至60℃，优选20℃至37℃。此外，所述pH可设为3至12，优选7至9。所述时间可设为约5分钟至20日，优选约1小时至7日。在维持培养液期间，可进行或可不进行通气和搅拌。

在另一个实施方案中，4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶的接触可通过允许4R-IHOG和产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物共存于反应溶液(例如培养基)中来达成。

用于本发明的产生方法(1)中的反应溶液并无特别限制，只要目标反应有进展即可，且例如使用水和缓冲液。反应溶液的实例包括Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液(例如，KH₂PO₄)，碳酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液和乙酸盐缓冲液。所述缓冲液的浓度可为，例如0.1mM至10M，优选1mM至1M。当在本发明的产生方法中使用产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物时，可将培养基用作反应溶液。此种培养基可使用后文描述的培养基来制备。用于本发明的产生方法中的反应溶液可进一步包含吡哆醛磷酸(PLP)作为辅酶。可将PLP的盐形式添加至反应溶液。反应溶液中的PLP的浓度可为例如1μM至100mM，优选10μM至1mM。当反应溶液包含PLP时，可期待通过可由PLP催化的异构化反应从2S，4R-莽那亭形成2R，4R-莽那亭(例如，参见实施例11)。

用于本发明的产生方法(1)中的反应溶液的pH并无特别限制，只要目标反应进展即可，且为例如pH 5至10，优选为pH 6至9，且更优选为pH 7至8。

本发明的产生方法(1)中的反应温度并无特别限制，只要目标反应进展即可，且为例如10至50℃，优选为20至40℃，且更优选为25至35℃。

本发明的产生方法(1)中的反应时间并无特别限制，只要该时间足以形成2S，4R-莽那亭即可，且为例如2至100小时，优选为4至50小时，且更优选为8至25小时。

当将表达L-氨基酸氨基酸氨基转移酶的转化体用作产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物时，可通过例如制备所述L-氨基酸氨基转移酶的表达载体，然后将该表达载体导入宿主来制成该转化体。例如，表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体可通过制备并入具有以SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的DNA的表达载体，并将其导入合适的宿主来获得。例如，多种原核细胞包括属于埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)，棒杆菌属(例如谷氨酸棒杆菌)和芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))的细菌，和多种真核细胞包括酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母)，毕赤酵母属(Pichia)(例如，树干毕赤酵母(Pichia stipitis))和曲霉属(Aspergillus)(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)可用作供表达所述L-氨基酸氨基转移酶的宿主。对于宿主，可使用缺失某基因的菌株。此种可缺失的基因的实例包括AspC，源自宿主的L-氨基酸氨基转移酶，源自宿主的醛缩酶，源自宿主的脱氨酶。转化体的实例包括在其细胞质中携带载体的转化体，和将目标基因导入其基因组的转化体。

可使用特定培养装置(例如，试管、烧瓶或发酵釜)在具有下文中提及的组成的培养基中来培养产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物。可适当地设定培养条件。具体而言，培养温度可为25℃至37℃，pH可为6.5至7.5，培养时间可为1小时至100小时。可控制溶解氧的浓度来进行培养。在此情况下，可将培养溶液中的溶解氧的浓度(DO值)用作控制的指示剂。可控制通气和搅拌的条件使得在考虑空气中的氧气浓度为21％的情况下溶解氧的相对浓度(DO值)不少于1％至10％，优选3％至8％。所述培养可为分批培养或补料分批培养。在补料分批培养的情况下，可以以顺序的方式连续或不连续地添加糖源溶液和含磷酸盐的溶液以继续培养。

待转化的宿主如上所述。具体描述大肠杆菌，宿主可选自大肠杆菌K12株亚种，大肠杆菌JM109、DH5α、HB101、BL21(DE3)株等。用于进行转化的方法和用于选择转化体的方法描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor press(2001/01/15)等。用于制备转化的大肠杆菌并通过其使用产生特定酶的方法会在下文中作为一个实施例具体描述。

作为用于表达编码L-氨基酸氨基转移酶的DNA的启动子，可使用通常用于在大肠杆菌中产生异源蛋白的启动子，且包括强力启动子如PhoA、PhoC、T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR和PL启动子和T5启动子。优选PhoA、PhoC和lac。作为载体，可使用pUC(例如pUC19、pUC18)、pSTV、pBR(例如pBR322)、pHSG(例如pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398)、RSF(例如RSF1010)、pACYC(例如pACYC177、pACYC184)、pMW(例如pMW119、pMW118、pMW219、pMW218)、pQE(例如pQE30)及其衍生物等。噬菌体DNA的载体亦可用作其他载体。此外，可使用含有启动子并能够表达插入的DNA序列的表达载体。优选地，所述载体可为pUC、pSTV或pMW。

可将作为转录终止序列的终止子连接于L-氨基酸氨基转移酶基因下游。此种终止子的实例包括T7终止子，fd噬菌体终止子，T4终止子，四环素抗性基因的终止子和大肠杆菌trpA基因的终止子。

所谓多拷贝类型优选作为用于将L-氨基酸氨基转移酶基因导入大肠杆菌的载体，且包括具有源自ColE1的复制起点的质粒，如pUC型质粒，pBR322型质粒，或其衍生物。在此，“衍生物”意指其中通过核苷酸取代、缺失、插入、添加和/或倒位而将修饰给予质粒的那些。“修饰”如本文中所指，还包括通过由诱变剂和UV辐射的诱变处理进行的修饰，或自然突变等。

为了选择转化体，优选所述载体具有标志物如氨苄青霉素抗性基因。作为此种质粒，携带强力启动子的表达载体是商业上可获得的(例如pUC型(由TAKARA BIO Inc.提供)，pPROK型(由Clontech提供)，pKK233-2(由Clontech提供))。

通过用获得的表达载体转化大肠杆菌并培养该大肠杆菌来表达L-氨基酸氨基转移酶。

可将通常用于培养大肠杆菌的培养基如M9-酪蛋白氨基酸培养基和LB培养基用作培养基。所述培养基可含有特定碳源、氮源和辅酶(例如吡哆醇盐酸盐(pyridoxine hydrochloride))。具体而言，可使用蛋白胨、酵母提取物、NaCl、葡萄糖、MgSO₄、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸铁、磷酸锰、硫胺素、大豆盐酸水解物、Disfoam GD113-K(NOF Corporation)等。取决于使用的载体中的启动子和标志物的类型、宿主细菌等适当地选择培养条件和生产诱导条件。

下述方法等可用于回收L-氨基酸氨基转移酶。L-氨基酸氨基转移酶可通过收集所述产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物继而破坏(例如声处理、匀浆)或裂解(例如溶菌酶处理)该微生物细胞作为破坏的产物或裂解液来获得。同样，纯化的酶、粗酶、L-氨基酸、含氨基转移酶的级分等可通过对此种破坏的产物或裂解物施以如提取、沉淀、过滤和柱层析的技术来获得。

在一个优选实施方案中，本发明的产生方法进一步包括将通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-氨基酸(例如，L-α-氨基酸)形成的酮酸(R-COCOOH)与脱羧酶相接触以降解该酮酸(参见反应1’)。通过促进藉由氨基基团转移反应从L-氨基酸形成的酮酸的降解，可能移动反应从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的平衡，使得以更大的量形成2S，4R-莽那亭。

(反应1’)

用于本发明的脱羧酶是催化酮酸的脱羧反应的酶。由脱羧酶催化的脱羧反应可为不可逆的。已知多种酶作为用于酮酸的不可逆脱羧反应的脱羧酶，且其实例包括源自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的草酰乙酸脱羧酶(Arch Biochem Biophys.，365，17-24，1999)和源自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶(Applied Microbiology and Biotechnology，17，152-157，1983)。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的产生方法包括将通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-天冬氨酸(L-Asp)形成的草酰乙酸(OAA)与草酰乙酸脱羧酶相接触而形成丙酮酸(PA)(参见反应1”)。通过促进丙酮酸从草酰乙酸的不可逆形成，可能移动反应从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的平衡，从而使得以更大的量形成2S，4R-莽那亭。可将L-天冬氨酸的盐形式添加至反应溶液。反应溶液中的L-天冬氨酸的浓度为1mM至3M，优选20mM至1M，更优选100mM至500mM。

(反应1”)

用于本发明的草酰乙酸脱羧酶是催化草酰乙酸脱羧反应而形成丙酮酸的酶。由草酰乙酸脱羧酶催化的脱羧反应可为不可逆的。已知多种酶作为用于草酰乙酸的不可逆脱羧反应的草酰乙酸脱羧酶。此种草酰乙酸脱羧酶的实例包括源自施氏假单胞菌的草酰乙酸脱羧酶(Arch Biochem Biophys.，365，17-24，1999)，源自产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)的草酰乙酸脱羧酶(FEBSLett.，141，59-62，1982)，和源自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的草酰乙酸脱羧酶(Biochim Biophys Acta.，957，301-311，1988)。

当脱羧酶用于从4R-IHOG产生2S，4R-莽那亭时，从L-氨基酸形成的酮酸与脱羧酶的接触可通过允许所述酮酸和从产生脱羧酶的微生物提取的脱羧酶(提取的酶)或所述产生脱羧酶的微生物在反应溶液(例如培养基)中共存来达成。产生脱羧酶的微生物的实例包括天然地产生脱羧酶的微生物和表达所述脱羧酶的转化体。提取的酶的实例包括纯化的酶、粗酶、固定化的酶、培养液和经处理的培养液的产物(例如从上述产生脱羧酶的微生物制备的含脱羧酶级分，和上述产生脱羧酶的微生物的裂解物和破坏产物)。用于从培养液获得经处理的培养液的产物的处理的实例包括热处理(42℃至80℃，pH 3至12，1分钟至24小时)，溶剂处理(例如二甲苯，甲苯，乙醇，异丙醇)，表面活性剂(例如Tween 20，Triton X-100)，和用细菌溶解酶的处理(例如溶菌酶处理)。或者，在调整的温度、pH等维持培养液以增强培养液中检测出的活性之后对培养液进行反应。在此情况下，温度可设为4℃至60℃，优选20℃至37℃。pH可设为3至12，优选7至9。温度可设为约5分钟至20日，优选约1小时至7日。在维持培养液过程中，可进行或可不进行通气和搅拌。

当L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶二者均用于从4R-IHOG产生2S，4R-莽那亭时，可以以下述方式在反应溶液中提供L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶：

-L-氨基酸氨基转移酶(提取的酶)和脱羧酶(提取的酶)；

-产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物和脱羧酶(提取的酶)；

-L-氨基酸氨基转移酶(提取的酶)和产生脱羧酶的微生物；

-产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物和产生脱羧酶的微生物；和

-产生L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的微生物。

优选地，所述L-氨基酸氨基转移酶和产生脱羧酶的微生物可为转化体。此种转化体可通过如下制备：i)将L-氨基酸氨基转移酶的表达载体导入产生脱羧酶的微生物，ii)将脱羧酶的表达载体导入产生L-氨基酸氨基转移酶的微生物，(iii)将L-氨基酸氨基转移酶的第一表达载体和脱羧酶的第二表达载体导入宿主微生物，和(iv)将L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的表达载体导入宿主微生物。L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的表达载体的实例包括i’)表达载体，其含有第一表达单元和第二表达单元，所述第一表达单元包含(组成为)编码L-氨基酸氨基转移酶的第一多核苷酸和可操作地连接于所述第一多核苷酸的第一启动子，所述第二表达单元包含(组成为)编码脱羧酶的第二多核苷酸和可操作地连接于所述第二多核苷酸的第二启动子；和ii’)表达载体，其含有编码L-氨基酸氨基转移酶的第一多核苷酸，编码脱羧酶的第二多核苷酸，和可操作地连接于所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的启动子(能够表达多顺反子mRNA的载体)。所述编码L-氨基酸氨基转移酶的第一多核苷酸可位于所述编码脱羧酶的第二多核苷酸的上游或下游。

(1-2)用于从IPA和丙酮酸产生2S，4R-莽那亭的方法

本发明的产生方法可进一步包括将IPA和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG以供制备4R-IHOG。IPA和丙酮酸的缩合可通过有机化学工艺，或使用醛缩酶的酶方法进行。用于通过藉由有机化学工艺将IPA和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG的方法公开于，例如国际公开WO2003/059865和美国专利公开号2008/0207920。用于通过藉由使用醛缩酶的酶方法将IPA和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG的方法公开于，例如国际公开WO2003/056026、JP2006-204285-A、美国专利公开号2005/0244939和国际公开WO2007/103989。因此，在本发明中，这些方法可用于从IPA和丙酮酸制备4R-IHOG。

用于制备4R-IHOG的IPA是不稳定的化合物。因此IPA和丙酮酸的缩合可在对于IPA的稳定化因子的存在下进行。对于IPA的稳定化因子的实例包括超氧化物歧化酶(例如，参见国际公开WO2009/028338)和巯基乙醇(例如，参见国际公开WO2009/028338)。例如，表达超氧化物歧化酶的转化体公开于国际公开WO2009/028338。因此，此种转化体可用于本发明的方法。

从IPA和丙酮酸形成4R-IHOG的反应，和从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的反应可分别或平行进行。这些反应可在一个反应器中进行。当在一个反应中进行这些反应时，这些反应可通过顺次或同时添加底物和酶来进行。具体而言，当进行通过使用醛缩酶的酶方法从IPA和丙酮酸形成4R-IHOG的反应和通过L-氨基酸氨基转移酶从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的反应时，可在一个反应器中顺次或同时添加(1)IPA、丙酮酸和醛缩酶，和(2)L-氨基酸和L-氨基酸氨基转移酶。可将丙酮酸的盐形式(例如，钠盐)添加至反应溶液。可将丙酮酸以任何方式(例如分批方法或补料方法)添加至反应溶液。反应溶液中的丙酮酸的浓度可为，例如0.1mM至10M，优选1mM至1M。

在一个优选实施方案中，将本发明的产生方法与上述反应1”如下所述进行组合。在此情况下，将不可逆地从草酰乙酸形成的丙酮酸用于制备4R-IHOG。换言之，至少部分用于形成4R-IHOG的丙酮酸可来自通过草酰乙酸脱羧酶的作用从草酰乙酸形成的丙酮酸。在此情况下，应注意若反应体系中存在的L-氨基酸的量是充足的，则反应体系中丙酮酸的起始量并不一定重要，因为在2S，4R-莽那亭的形成同时从草酰乙酸形成了丙酮酸。因此，与丙酮酸比较，可将较大量的L-氨基酸添加至反应体系。

当醛缩酶用于从IPA和丙酮酸产生4R-IHOG时，IPA和丙酮酸与醛缩酶的接触可通过允许IPA、丙酮酸和从产生醛缩酶的微生物提取的醛缩酶(提取的酶)或所述产生醛缩酶的微生物在反应溶液(例如培养基)中共存来达成。产生醛缩酶的微生物的实例包括天然产生醛缩酶的微生物和表达醛缩酶的转化体。提取的酶的实例包括纯化的酶、粗酶、固定化的酶、培养液和经处理的培养液的产物(例如从上述产生醛缩酶的微生物制备的含醛缩酶级分，和上述产生醛缩酶的微生物的裂解物和破坏产物)。用于从培养液获得经处理的培养液的产物的处理的实例包括热处理(42℃至80℃，pH 3至12，1分钟至24小时)，溶剂处理(例如二甲苯，甲苯)，表面活性剂处理。培养液可在4℃至60℃，pH 3至12，和5分钟至20日的条件下使用(具有或不具有通气和搅拌)。所述产生醛缩酶的微生物可进一步表达其他酶(例如超氧化物歧化酶，L-氨基酸氨基转移酶，脱羧酶)。或者，可允许除了产生醛缩酶的微生物之外的产生其他酶的微生物在反应溶液中共存。描述于本发明产生方法(1-1)的那些可用作反应溶液。

优选地，所述产生醛缩酶、L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的微生物可为转化体。醛缩酶、L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的表达可使用相同转化体进行，或可用两个转化体的组合进行，或所述三个酶可在不同的转化体中表达。醛缩酶、L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶基因在相同转化体中表达，这些基因可整合入其染色体，或将醛缩酶、L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶基因插入一个载体。或者，L-氨基酸氨基转移酶的表达载体可导入产生脱羧酶和醛缩酶的微生物，或可将L-氨基酸氨基转移酶的第一表达载体和脱羧酶和醛缩酶的第二表达载体导入宿主微生物。醛缩酶、L-氨基酸氨基转移酶和脱羧酶的表达载体的实例包括i’)表达载体，其含有第一表达单元、第二表达单元和第三表达单元，所述第一表达单元包含(组成为)编码L-氨基酸氨基转移酶的第一多核苷酸和可操作地连接于所述第一多核苷酸的第一启动子，所述第二表达单元包含(组成为)编码脱羧酶的第二多核苷酸和可操作地连接于所述第二多核苷酸的第二启动子，所述第三表达单元包含(组成为)编码醛缩酶的第三多核苷酸和可操作地连接于所述第三多核苷酸的第三启动子；和ii’)表达载体，其含有第一表达单元和第二表达单元，所述第一表达单元包含(组成为)编码L-氨基酸氨基转移酶的第一多核苷酸，编码脱羧酶的第二多核苷酸和可操作地连接于第一多核苷酸和第二多核苷酸的启动子，所述第二表达单元包含编码醛缩酶的第三多核苷酸和可操作地连接于第三多核苷酸的启动子(能够表达多顺反子mRNA的载体)。编码L-氨基酸氨基转移酶、脱羧酶和醛缩酶的基因在质粒上的位置并无特别限制。

只要目标反应可进展，即可合适地构建反应中的多种条件如温度、pH值和时间。例如，使用醛缩酶的酶方法的条件可与描述于本发明产生方法(1-1)中的那些相同。

(1-3)用于从色氨酸或其盐产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法

本发明的产生方法可进一步包括使色氨酸(Trp)脱氨以制备IPA。Trp包括L-Trp，D-Trp，和L-Trp与D-Trp的混合物。Trp的脱氨可通过有机化学技术和使用脱氨酶的酶方法进行。

已知多种方法作为通过有机化学技术使Trp脱氨基而形成IPA的方法。此种方法的实例包括其中色氨酸用作起始材料并在碱存在下与吡啶醛(pyridine aldehyde)反应以供使质子受体脱水的方法(参见，例如JPSho-62-501912和国际公开WO1987/000169)，和使用吲哚和乙基-3-溴丙酮酸酯肟(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作为原材料的缩合反应之后进行酸水解的方法(例如，欧洲专利申请公开号421946)。

如用于本文，术语“脱氨酶”指能够从Trp形成IPA的酶。从Trp形成IPA基本上是将Trp中的氨基(-NH₂)转化为氧基团(＝O)。因此催化该反应的酶有时称作其他名称，如氨基酸脱氨酶，氨基转移酶和氨基酸氧化酶。因此，术语“脱氨酶”意指任何可从Trp形成IPA的酶，且具有其他名称(例如氨基酸脱氨酶，氨基转移酶，氨基酸氧化酶)的催化从Trp形成IPA的反应的酶亦包含于“脱氨酶”。

使用氨基酸脱氨酶或产生氨基酸脱氨酶的微生物从Trp形成IPA的方法的实例包括公开于国际公开WO2009/028338中的方法。由氨基酸脱氨酶催化的反应的通式包括下式：氨基酸+H₂O→2-酮酸+NH₃。

使用氨基转移酶或产生氨基转移酶的微生物从Trp形成IPA的方法的实例包括公开于东德专利DD 297190、JP Sho-59-95894-A、国际公开WO2003/091396和美国专利公开号2005/028226的方法。

使用L-氨基酸氧化酶或产生L-氨基酸氧化酶的微生物从Trp形成IPA的方法的实例包括公开于美国专利号5,002,963，John A.Duerre等(Journal ofBacteriology 1975，vol.121，No.2，p656-663)，JP Sho-57-146573，国际公开WO2003/056026和国际公开WO2009/028338的方法。由氨基酸氧化酶催化的反应的通式包括下式：氨基酸+O₂+H₂O→2-酮酸+H₂O₂+NH₃。为了抑制由此时产生的作为副产物的过氧化氢所致的化合物的降解，可将过氧化氢降解酶如过氧化氢酶添加至反应溶液中。

从Trp形成IPA的反应，从IPA和丙酮酸形成4R-IHOG的反应和从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的反应可分别或平行进行。这些反应可在一个反应器中进行。当在一个反应器中进行这些反应时，这些反应可通过顺次或同时添加底物和酶来进行。具体而言，当进行通过使用脱氨酶的酶方法使Trp脱氨形成IPA的反应，通过使用醛缩酶的酶方法从IPA和丙酮酸形成4R-IHOG的反应和通过L-氨基酸氨基转移酶从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的反应时，可在一个反应器中顺次或同时添加(1)Trp和脱氨酶，(2)丙酮酸和醛缩酶，和(3)L-氨基酸和L-氨基酸氨基转移酶。

当脱氨酶用于从Trp产生IPA时，Trp与脱氨酶的接触可通过允许Trp和从产生脱氨酶的微生物提取的脱氨酶(提取的酶)或所述产生脱氨酶的微生物在反应溶液中共存来达成。产生脱氨酶的微生物的实例包括天然地产生脱氨酶的微生物和表达所述脱氨酶的转化体。例如，可使用描述于WO 2009/028338的实施例2中的pTB2菌株(导入源自雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)菌株的氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的修饰株)。可将操作性启动子(operative promoter)(例如phoA，phoC，trp，lac或tac启动子)连接于质粒中的脱氨酶。当使用大肠杆菌作为宿主时，可将能够表达脱氨酶的质粒导入具有特定基因如aspC基因缺失的宿主中。提取的酶的实例包括纯化的酶、粗酶、固定化的酶、培养液和经处理的培养液的产物(例如从上述产生脱氨酶的微生物制备的含脱氨酶级分，和上述产生脱氨酶的微生物的裂解物和破坏产物)。用于从培养液获得经处理的培养液的产物的处理的实例包括热处理(42℃至80℃，pH 3至12，1分钟至24小时)，溶剂处理(例如二甲苯，甲苯，乙醇，异丙醇)，表面活性剂(例如Tween 20，Triton X-100)，和用细菌溶解酶的处理(例如溶菌酶处理)。或者，在调整的温度、pH等维持培养液以增强培养液中检测出的活性之后对培养液进行反应。在此情况下，温度可设为4℃至60℃，优选20℃至37℃。pH可设为3至12，优选7至9。温度可设为约5分钟至20日，优选约1小时至7日。在维持培养液过程中，可进行或可不进行通气和搅拌。所述产生脱氨酶的微生物可进一步表达其他酶(例如醛缩酶，超氧化物歧化酶，L-氨基酸氨基转移酶，脱羧酶)。或者可允许除了产生脱羧酶的微生物之外的产生其他酶的微生物在反应溶液中共存。描述于本发明的产生方法(1-1)的那些可用作反应溶液。Trp优选为L-Trp。可将Trp的盐形式添加至反应溶液。反应溶液中Trp的浓度为，例如1mM至3M，优选20mM至1M，更优选20mM至300mM。

只要目标反应可进展，可合适地构建反应中的多种条件如温度、pH和时间。例如，使用脱氨酶的酶方法的条件可与本发明的产生方法(1-1)中描述的那些相同。

在一个优选实施方案中，当在一个反应器中进行本发明的产生方法(1-3)时，使用脱氨酶，醛缩酶，L-氨基酸氨基转移酶和草酰乙酸脱羧酶，和/或一种或多种表达它们的转化体。可进一步使用超氧化物歧化酶，和/或表达它的转化体。这些酶可为突变体。对于酶的表达体系，可使用前述的转化体。具体而言，在其细胞质中携带目标基因的表达载体的转化体，目标基因导入其基因组的转化体，和在其细胞质中携带目标基因的表达载体并在其基因组导入目标基因的转化体。对于用于制备转化体的表达载体，可使用上述的表达载体。

在一个优选实施方案中，当在一个反应器中进行本发明的产生方法(1-3)时，可使用含有特定浓度的L-Trp，L-Asp，PA，缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液)和PLP的反应溶液。L-Trp的浓度为，例如1mM至3M，优选10mM至1M，更优选50mM至300mM。L-Asp的浓度为，例如1mM至3M，优选100mM至1M，更优选200mM至400mM。L-Asp可为盐形式(例如钠盐，钾盐)或游离形式。当以游离形式使用L-Asp时，可在将其供予反应溶液中之后适当地调节pH。在此情况下，可将碱溶液(例如NaOH水溶液，KOH水溶液)用于调整pH。PA的浓度为，例如1mM至3M，优选10mM至100mM。PA可为盐形式(例如钠盐，钾盐)或游离形式。当以游离形式使用PA时，可在将其供予反应溶液之后调整pH。PLP的浓度为，例如1μM至100mM，优选10μM至1mM。所述反应溶液可进一步含有镁、磷酸根和消泡剂。当镁作为盐使用时，镁的盐形式并无特别限制，且盐形式的实例包括氯化镁和硫酸镁。酶的浓度为，例如0.1mM至100mM，优选0.5mM至5mM。此外，磷酸根作为盐使用，磷酸根的盐形式并无特别限制，且盐形式的实例包括钾盐(例如单钾盐、二钾盐、三钾盐)和钠盐(例如单钠盐、二钠盐、三钠盐)。磷酸根的浓度为，例如1mM至100mM，优选10mM至50mM。消泡剂并无特别限制，且消泡剂的实例包括GD113K。消泡剂的浓度并无特别限制，且为0.0001％至1％(v/v)，优选0.001％至0.1％(v/v)。可适当地设定反应条件如pH，温度，通气，搅拌和时间。反应溶液的pH为，例如5至10，优选6至9，更优选7至8。在反应过程中pH的控制可通过适当地添加酸或碱来达成。在此情况下使用的酸或碱并无特别限制，且酸或碱的实例包括盐酸，磷酸，硫酸，氨气，氨水溶液，NaOH水溶液和KOH水溶液。用于调整pH的酸或碱的浓度并无特别限制。当使用酸或碱的溶液时，其为，例如0.1N至20N，优选3N至12N。反应温度为，例如10℃至50℃，优选20℃至40℃，更优选25℃至35℃。当能够控制通气和搅拌的容器(例如发酵釜)用于反应时，可通过控制通气和搅拌的条件设定反应溶液中溶解氧的浓度。本领域的技术人员能根据使用的容器设定通气和搅拌的条件。例如，当使用具有1升体积的发酵釜时，通气条件为，例如，1/200至1vvm，优选1/100至1/10vvm。搅拌条件为，例如，100rpm至1000rpm，优选400rpm至700rpm。待添加至反应的酶的实例包括纯化的酶，表达酶的微生物，表达酶的微生物经处理的产物，含有表达酶的微生物的培养液，和含有表达酶的微生物的培养液经处理的产物。用于从培养液获得培养液经处理的产物的处理的实例包括热处理(42℃至80℃，pH 3至12，1分钟至24小时)，溶剂处理(例如二甲苯，甲苯，乙醇，异丙醇)，表面活性剂(例如Tween 20，Triton X-100)和用细菌溶解酶(例如溶菌酶处理)的处理。在调整的温度、pH等维持培养液以增强培养液中检测出的酶活性之后，对培养液进行反应。在此情况下，所述温度可设为4℃至60℃，优选20℃至37℃。培养液的pH可设为3至12，优选7至9。所述维持温度可设为约5分钟至20日，优选约1小时至7日。在维持培养液期间，可进行或可不进行通气和搅拌。

可通过事先测量每种酶的活性来适当地确定待添加至反应溶液的每种酶。可通过下述方法测量脱氨酶活性，醛缩酶活性，L-氨基酸氨基转移酶活性和草酰乙酸脱羧酶活性。

脱氨酶活性：10mM L-Phe，100mM NH₄Cl，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和苯丙氨酸脱氢酶(由UNITIKA制造，源自中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius)，25℃。由在340nm处测量的吸光度的减少来计算活性。

L-氨基酸氨基转移酶活性(L-Asp/α-KG活性)：100mM L-Asp-Na-1aq，10mMα-KG-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH，25℃。根据在340nm处测量的吸光度的减少来计算活性。使用来自猪心的苹果酸脱氢酶(Sigma)作为MDH。

醛缩酶活性：2mM 4-苯基-4-羟基-2-酮戊二酸(PHOG)，100mM Tris-HCl(pH 7.0)，1mM MgCl₂，0.25mM NADH，10U/ml乳酸脱氢酶(由ORIENTALYEAST Co.，Ltd.制造，源自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))25℃。根据在340nm处测量的吸光度的减少来计算活性。

草酰乙酸脱羧酶活性：1mM草酰乙酸，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH，10U/ml乳酸脱氢酶(由ORIENTAL YEAST Co.，Ltd.制造，源自肠膜明串珠菌)，25℃。据在340nm处测量的吸光度的减少来计算活性。

基于如上所述确定的酶活性，待添加至反应溶液的酶量可如下所述。待添加至反应溶液的脱氨酶的量为，例如0.1至20U/ml，优选0.5至2U/ml。待添加至反应溶液的醛缩酶的量为，例如1至1000U/ml，优选10至100U/ml。待添加至反应溶液的L-氨基酸氨基转移酶的量为，例如1至1000U/ml，优选10至100U/ml。待添加至反应溶液的草酰乙酸脱羧酶的量为，例如0.01U/ml或更高，优选0.1U/ml或更高。可通过分批方法或补料方法将每种底物添加至反应体系。亦可通过分批或补料方法将所述酶，表达酶的微生物，表达酶的微生物经处理的产物，含有表达酶的微生物的培养液，和含有表达酶的微生物的培养液经处理的产物添加至反应体系。反应时间为，例如2至100个小时，优选4至50个小时，更优选8至25个小时。可在适当条件下(例如温度，pH，时间)对反应溶液进行灭菌。

当本发明的产生方法(1-2)在一个反应器中进行时，此种反应方法可类似于本发明的产生方法(1-3)而进行。

可通过借助已知的纯化方法如柱处理，结晶处理和提取处理通过任何本发明的产生方法(1-1)、(1-2)和(1-3)获得的含2S，4R-莽那亭反应溶液来获得纯化的2S，4R-莽那亭。可将纯化的2S，4R-莽那亭提供予用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法(2)。亦可将通过任何本发明的产生方法(1-1)、(1-2)和(1-3)获得的含2S，4R-莽那亭的反应溶液直接提供予用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法(2)。

(2)用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法

本发明提供了用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法。本发明的产生方法包括进行本发明的产生方法(1)而形成2S，4R-莽那亭或其盐，并使2S，4R-莽那亭或其盐异构化而形成2R，4R-莽那亭或其盐的方法。

将2S，4R-莽那亭异构化为2R，4R-莽那亭可通过任何使得异构化能够发生的方法进行(例如，参见国际公开WO2005/082850和国际公开WO03/059865)。然而，对于增强2R，4R-莽那亭的收率，优选通过差向异构-结晶进行2S，4R-莽那亭的异构化(例如，参见国际公开WO2005/082580)。差向异构-结晶是其中同时进行异构化反应和结晶的方法。在此情况下，在位置2进行的将2S，4R-莽那亭转化为2R，4R-莽那亭的异构化反应和转化的2R，4R-莽那亭的结晶通过差向异构-结晶同时进行。

在差向异构-结晶中，异构反应可在醛存在下进行。所述醛包括脂族醛和芳族醛，且优选芳族醛。可将纯化的2S，4R-莽那亭或含2S，4R-莽那亭反应溶液用作用于异构化反应的2S，4R-莽那亭。

对于脂族醛，可使用例如，具有1至7个碳原子的饱和/或不饱和醛，如甲醛、乙醛、丙醛、正丁醛、1-丁醛、正戊醛、己醛、正庚醛、丙烯醛或异丁烯醛。

对于芳族醛，可使用芳族醛如苯甲醛、水杨醛、间羟基苯甲醛、对羟基苯甲醛、邻硝基苯甲醛、对硝基苯甲醛、5-硝基水杨醛、3，5-二氯水杨醛、茴香醛、邻香草醛、香草醛、糠醛、吡哆醛或5-磷酸吡哆醛。具体而言，吡哆醛、5-硝基水杨醛或3，5-二氯水杨醛优选作为芳族醛。

所述醛可以在对于体系中存在的莽那亭的0.01至0.1摩尔当量，且更优选0.05至0.5摩尔当量的范围内使用。

在醛的存在下进行差向异构-结晶，并将水和有机溶剂的混合溶剂用作溶剂。将可与水混溶的有机溶剂用作有机溶剂，且具体而言，优选醇如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。可在混合物中使用两种以上不同种类的有机溶剂。有机溶剂对水的体积比设在优选1∶0.01至1∶1，且更优选1∶0.1至1∶0.5(有机溶剂：水)的范围内。

差向异构-结晶中的温度设在优选0至100℃和更优选40至80℃的范围内。进行差向异构-结晶的时间设在优选10小时至一周和更优选15小时至96小时的范围内。

pH设为4至13，优选4.5至10，且更优选5至9的范围。可使用酸或碱调整pH值。待使用的酸并无特别限制，且可使用有机酸如乙酸，或无机酸如氢氯酸或硫酸。碱亦无特别限制，且可使用碱金属氢氧化物如氢氧化钠或氢氧化钾，或有机碱如氨或胺。

可通过任选地组合已知的分离和纯化步骤如浓缩、减压浓缩、溶剂萃取、结晶、重结晶、溶剂转移、用活性炭的处理和使用离子交换树脂或合成吸附树脂的层析等处理来分离并纯化通过上述方法获得的每个化合物。用于本发明方法中的化合物和由本发明的方法产生的化合物(目标化合物)的盐可通过例如将无机酸或有机酸根据自身公知的方法添加至目标化合物来产生。目标化合物及其盐可为水合物，且水合物和非水合物两者包括在本发明的范围内。用于本发明的产生方法的化合物(例如Trp、IPA、4R-IHOG、2S，4R-莽那亭)可为多种盐如钠盐、钾盐和铵盐的形式。通过本发明的产生方法获得的化合物(例如IPA、4R-IHOG、2S，4R-莽那亭、2R，4R-莽那亭)亦可为多种盐的形式。

通过下述实施例具体描述本发明，但本发明并不受这些实施例所限。

实施例

(HPLC的分析条件)

在实施例1至7中，若进行HPLC分析，该HPLC分析在实施例中所示条件下进行。

在实施例8至15中，HPLC在下述条件下进行。

检测器：紫外吸收分光计(测量波长：210nm)

柱温度：40℃

柱：CAPCELLPAK C18 Type MGII，内径：3mm，长度：25cm，和粒径：5μm，Shiseido Co.，Ltd.

流动相：溶液A(20mM磷酸二氢钾∶乙腈＝95∶5的水溶液)和溶液B(20mM磷酸二氢钾∶乙腈＝60∶40的水溶液)

梯度程序：参见下表1

表1：梯度程序

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0.0	100	0
15.0	100	0
			40.0	0	100
45.0	0	100
			45.1	100	0

流速：0.45mL/分钟

注入量：20μL

分析时间：60分钟

实施例1：使用来自高地芽孢杆菌AJ1616微生物细胞的提取液从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭

将高地芽孢杆菌AJ1616在CM2G琼脂培养基(10g/L酵母提取物，10g/L多蛋白胨，5g/L葡萄糖，5g/L氯化钠，15g/L的琼脂，pH 7.0)上划线，并在30℃培养2日。

将一环所得的微生物细胞接种于试管中的3mL酶产生培养基(10g/L酵母提取物，10g/L多蛋白胨，1g/L葡萄糖，3g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，0.1g/L七水合硫酸镁，5g/L硫酸铵)，然后将其在30℃振荡培养16小时。通过离心从2mL培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中以制备1mL微生物细胞悬液。

将1g玻璃珠(0.1mm)添加至1mL该微生物细胞悬液，并使用多珠振荡器(multi beads shocker)(Yasui Kikai Co.，Ltd.)破坏微生物细胞。将所得的破坏的细胞悬液离心以使用上清作为微生物细胞提取物。

制备2S，4R-莽那亭合成反应溶液(0.1mL)(9.5mM 4R-IHOG，0.5mM4S-IHOG，100mM L-Asp，50μM PLP，100mM Tris-HCl，pH 8.0)从而使得包含了0.05mL的高地芽孢杆菌AJ1616微生物细胞提取物。将反应溶液在30℃反应20小时。在反应完成之后，对形成的2S，4R-莽那亭进行定量，且其浓度为0.21mM。

使用UPLC(Waters)定量2S，4R-莽那亭。分析条件如下所述：

流动相：20mM KH₂PO₄/乙腈＝100/5

流速：0.15mL/分钟

柱温度：40℃

检测：UV 210nm

柱：ACQUITYUPLC BEH C18，2.1×50mm，1.7μm(Waters)。

实施例2：源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶的纯化

如下所述从高地芽孢杆菌AJ1616的可溶级分纯化用于形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶。用于合成2S，4R-莽那亭的反应和2S，4R-莽那亭的定量以与实施例1中相同的方式进行。

(1)可溶级分的制备

将高地芽孢杆菌AJ1616划线于CM2G琼脂培养基(10g/L酵母提取物，10g/L多蛋白胨，5g/L葡萄糖，5g/L氯化钠，15g/L琼脂，pH 7.0)上，并在30℃培养2日。

将一环所得的微生物细胞接种至500mL坂口烧瓶中的160mL TB(Terrific Broth)培养基，然后将其在30℃振荡培养16小时。通过离心从约2000mL培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl洗涤并悬于其中，然后通过在4℃声处理30分钟进行破坏。通过离心从破坏所得的溶液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。

(2)阴离子交换层析

将上述可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 26/10Q Sepharose HP(由GE Health CareBioscience提供，CV＝53mL)上，并吸附于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以8mL/分钟的流速将NaCl的浓度从100mM线性改变至500mM来洗脱吸附的蛋白。在每个级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约200mM NaCl的级分中检测出所述活性。

(3)疏水层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并对其分别以终浓度1.4M和20mM添加了硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)。将该溶液上样于用1.4M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 16/10PhenylSepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝20mL)，并吸附于载体。用1.4M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸附于载体的未吸附蛋白，然后通过以3mL/分钟的流速将硫酸铵的浓度从1.4M线性改变至0M来洗脱2S，4R-莽那亭形成酶。在每个级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约1.0M硫酸铵的级分中检测出所述活性。

(4)凝胶过滤层析

合并并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl稀释所得的浓缩溶液。将该溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱HiLoad 16/60Superdex 200pg(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝120mL)，并以1mL/分钟的流速洗脱。该操作确证2S，4R-莽那亭形成活性位于估计为约120kDa的分子量处。

(5)阴离子交换层析

合并其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并将其上样于用20mMTris-HCl，100mM NaCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱Mono Q 5/5(由Pharmacia(GE Health Care Bioscience提供)，CV＝1mL)，并吸附于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以0.5mL/分钟的流速将NaCl的浓度从100mM线性改变至500mM来洗脱吸附的蛋白。在每个级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约200mM NaCl的级分中检测出所述活性。

(6)SDS-PAGE

对获得的级分进行SDS-PAGE，并在活性级分中观察到45kDa左右的条带。将该条带作为供形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶的候选而进行N端氨基酸序列的分析。亦对该条带进行内部氨基酸序列的分析。

实施例3：源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶的N端和内部氨基酸序列的确定

对实施例2中获得的纯化的酶溶液进行N端氨基酸序列的分析，并获得序列SGFTALSEAELNDLY(SEQ ID NO：4)作为N端氨基酸序列。用胰蛋白酶(pH 8.0，35℃，20小时)处理SDS-PAGE凝胶中的样品，然后对其进行反相HPLC以分离肽片段。分析经分级的级分中的氨基酸序列，并获得序列QLDLSMGMLDVV(SEQ ID NO：5)作为内部氨基酸序列。N端氨基酸序列和内部氨基酸序列两者均对源自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)SAFR-032(YP_001487343)的氨基转移酶显示高同源性。

实施例4：源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶基因的克隆

以与实施例1中相同的方式培养高地芽孢杆菌AJ1616。通过离心从培养基收集微生物细胞，并提取基因组DNA。

使用获得的基因组DNA作为模板通过PCR来扩增包含氨基转移酶基因的DNA片段。对于引物，使用引物Bp-u300-f (5’-ctcaggaagcaggcgcaaaaagattaattt-3’(SEQ ID NO：6)和引物Bp-d200-r(5’-ggatgctgtctttgtcatcccaaagtggat-3’(SEQ IDNO：7)，其参照短小芽孢杆菌SAFR-032的基因组DNA序列(CP000813)由氨基转移酶基因中上游300bp和下游200bp的DNA序列设计。使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)在下述条件下进行PCR：

确定了约1800bp扩增的DNA片段的核苷酸序列，且显示该核苷酸序列包含1308bp、与源自短小芽孢杆菌SAFR-032(NC 009848)的氨基转移酶具有高同源性的ORF。DNA序列中同源性为89％，而氨基酸序列中同源性为93％。

在该序列中发现了实施例3中获得的N端氨基酸序列和内部氨基酸序列。因此，认为可能已获得了具有2S，4R-莽那亭形成活性的氨基转移酶基因。

实施例5：源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶在大肠杆菌中的表达

(1)表达源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶的质粒的构建

使用高地芽孢杆菌AJ1616的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶基因的DNA片段。使用引物1616AT-Nde-f(5’-ggaattccatATGAGCGGTTTTACAGCGTT-3’：SEQ ID NO：8)和引物1616-xho-r (5’-gtcaaggagtttttctcgagTACCGTTGGTGCTGATTGAC-3’：SEQID NO：9)作为引物。使用引物1616-delNde-f(5’-GGATTGAAGGAACAcATGAAAAAGCATGC-3’：SEQ ID NO：10)和引物1616-delNde-r(5’-GCATGCTTTTTCATgTGTTCCTTCAATCC-3’：SEQ ID NO：11)转化所述氨基转移酶中的NdeI序列。使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)在下述条件下进行PCR。

用限制性酶NdeI和XhoI处理所得的约1300bp的DNA片段，然后将其连接于同样用NdeI和XhoI处理的pET-22b(Novagen)。用含有连接产物的该溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌落提取目标质粒，并将该质粒命名为pET-22-1616AT-His。该质粒表达在C端具有His标记的源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶(1616AT-His)。

(2)从大肠杆菌表达株纯化1616AT-His

将构建的表达质粒pET-22-1616AT-His导入大肠杆菌BL21(DE3)。将一环所得的转化体接种于500mL坂口烧瓶中的160mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)，并在37℃振荡培养16小时。在培养完成之后，通过离心从约1000mL所得的培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑洗涤并悬于其中，并通过在4℃声处理30分钟来进行破坏。通过离心从破坏所得的溶液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

将获得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑平衡的His标记蛋白纯化柱HisPrep FF 16/10(由Pharmacia(GEHealth Care Bioscience)提供，CV＝20mL)，并吸附于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以3mL/分钟的流速将咪唑的浓度从20mM线性改变至250mM来洗脱吸附的蛋白。

合并并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩获得的级分。用20mMTris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl稀释浓缩的溶液，并将其上样于用20mMTris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 16/10QSepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝20mL)，并吸附于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以3mL/分钟的流速将NaCl的浓度从100mM线性改变至500mM来洗脱吸附的蛋白。

在每个洗脱的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并且合并并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩其中已确证了2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液以用作1616AT-His溶液。

实施例6：使用1616AT-His的2S，4R-莽那亭的合成反应

通过HPLC分析对2S，4R-莽那亭进行定量。分析条件如下所述。

流动相：20mM KH₂PO₄/乙腈＝100/5

流速：1.0mL/分钟

柱温度：40℃

检测：UV 280nm

柱：CAPCELL PAK MGII，4.6×150mm，3μm，(Shiseido Co.，Ltd.)

(1)从4R-IHOG合成2S，4R-莽那亭

将制备为含有0.5mg的1616AT-His的1616AT-His溶液(实施例5)添加至0.1mL反应溶液(9.5mM 4R-IHOG，0.5mM 4S-IHOG，80mM L-Asp，50μMPLP，100mM Tris-HCl，pH 8.0)，然后在25℃反应12小时。在反应完成之后，对形成的2S，4R-莽那亭进行定量，且其浓度为8.6mM。

(2)从吲哚丙酮酸(IPA)和丙酮酸(PA)合成2S，4R-莽那亭

制备反应混合物使其在0.1mL反应溶液(50mM IPA，100mM PA，100mM L-Asp，1mM MgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，100mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0)中含有0.5mg的1616AT-His(使用实施例5的1616AT-His溶液)，0.01mg的SpAld(具有醛缩酶活性的溶液，该溶液的制备方法在下文中详细解释，亦参见JP 2006-204285-A)和1U草酰乙酸脱羧酶(Sigma，O4878)，并在25℃反应2小时。在反应完成之后，对形成的2S，4R-莽那亭进行定量，且其浓度为5.0mM。

(3)从L-Trp合成2S，4R-莽那亭

制备反应混合物使其在1.0mL的反应溶液(50mM L-Trp，100mM PA，400mM L-Asp，1mM MgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5)含有5mg的1616AT-His(使用实施例5中的1616AT-His溶液)，0.2mg的SpAld，坂口烧瓶中0.4mL的pTB2株(一种能够表达脱氨酶的细菌菌株，该细菌菌株的制备方法在下文中详细解释，亦参见WO2009/028338)的培养基(TB培养基)，200U超氧化物歧化酶(Sigma，S8160)和10U草酰乙酸脱羧酶(Sigma，O4878)，并在25℃反应12小时。使用试管以140rpm振荡进行该反应。在反应完成之后，对形成的2S，4R-莽那亭进行定量，且其浓度为22mM(44％收率)。

SpAld通过下述方法制备。

使用描述于JP 2006-204285-A中实施例5的质粒DNAptrpSpALD作为模板，通过PCR扩增含有SpAld基因的DNA片段。使用引物SpAld-f-NdeI(5’-GGAATTCCATATGACCCAGACGCGCCTCAA-3’；SEQ ID NO：12)和引物SpAld-r-HindIII(5’-GCCCAAGCTTTCAGTACCCCGCCAGTTCGC-3’；SEQID NO：13)。将醛缩酶基因中的大肠杆菌罕见密码子(6L-ctc，13L-ctc，18P-ccc，38P-ccc，50P-ccc，77P-ccc，81P-ccc和84R-cga)分别转化为6L-ctg，13L-ctg，18P-ccg，38P-ccg，50P-ccg，77P-ccg，81P-ccg和84R-cgc。当转化6L时，使用引物6L-f(5’-ACCCAGACGCGCCTGAACGGCATCATCCG-3’：SEQ IDNO：14)和引物6L-r(5’-CGGATGATGCCGTTCAGGCGCGTCTGGGT-3’：SEQID NO：15)。当转化13L 时，使用引物13L-f(5’-ATCATCCGCGCTCTGGAAGCCGGCAAGCC-3’：SEQ ID NO：16)和引物13L-r(5’-GGCTTGCCGGCTTCCAGAGCGCGGATGAT-3’：SEQ ID NO：17)。当转化18P时，使用引物18P-f(5’-GAAGCCGGCAAGCCGGCTTTCACCTGCTT-3’：SEQ ID NO：18)和引物18P-r(5’-AAGCAGGTGAAAGCCGGCTTGCCGGCTTC-3’：SEQ ID NO：19)。当转化38P时使用，引物38P-f(5’-CTGACCGATGCCCCGTATGACGGCGTGGT-3’：SEQ ID NO：20)和引物38P-r(5’-ACCACGCCGTCATACGGGGCATCGGTCAG-3’：SEQ ID NO：21)。当转化50P时，使用引物50P-f(5’-ATGGAGCACAACCCGTACGATGTCGCGGC-3’：SEQ ID NO：22)和引物50P-r(5’-GCCGCGACATCGTACGGGTTGTGCTCCAT-3’：SEQ ID NO：23)。当转化77P、81P和84P时，使用引物77P-81P-84R-f(5’-CGGTCGCGCCGTCGGTCACCCCGATCGCGCGCATCCCGGCCA-3’：SEQ ID NO：24)和引物77P-81P-84R-r(5’-TGGCCGGGATGCGCGCGATCGGGGTGACCGACGGCGCGACCG-3’：SEQ ID NO：25).使用KOD-plus(Toyobo)在下述条件下进行PCR。

用限制性酶NdeI和HindIII处理约900bp的所得的DNA片段，并将其连接至同样用NdeI和HindIII处理的pSFN Sm_Aet(国际公开WO2006/075486中的实施例1、6和12)。用含有连接产物的该溶液转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性株提取目标质粒，并将该质粒命名为pSFN-SpAld。

将一环大肠杆菌JM 109/pSFN-SpAld(即携带构建的质粒pSFN-SpAld的细菌菌株)接种于500mL坂口烧瓶中的50mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，并在36℃振荡培养8小时。在培养完成之后，将0.0006mL获得的培养基添加至1000mL体积的发酵釜中的300mL含100mg/L氨苄青霉素的种子液体培养基(10g葡萄糖，5g硫酸铵，1.4g磷酸二氢钾，0.45g按氮量计算的水解大豆，1g七水合硫酸镁，0.02g七水合硫酸亚铁(II)，0.02g五水合硫酸锰(II)，1mg硫胺素盐酸盐，0.1mL Disfoam GD-113K(NOFCorporation)，pH 6.3，用水补足至一升)，并开始种子培养。在33℃以1/1vvm的通气并以700rpm搅拌，并用氨将pH控制在6.3，来进行种子培养，直至葡萄糖耗尽。然后，将如上所述获得的15mL培养基添加至1000mL体积发酵釜中的285mL含100mg/L氨苄青霉素的主液体培养基(15g葡萄糖，5g硫酸铵，3.5g磷酸，0.45g按氮量计的水解大豆，1g七水合硫酸镁，0.05g七水合硫酸亚铁(II)，0.05g五水合硫酸锰(II)，1mg硫胺素盐酸盐，0.1mLDisfoam GD-113K (NOF Corporation)，pH 6.3，用水补足至0.95L)。在36℃以1/1vvm的通气进行主培养，用氨将pH控制在6.3，并将搅拌控制在700或更高rpm从而使得溶解氧的浓度为5％或更高。在耗尽了主培养基中所含的葡萄糖之后，以500g/L滴加葡萄糖溶液以继续培养总共50小时。

通过离心从100mL获得的培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗涤，并悬于其中，并通过在4℃进行30分钟声处理来破坏。通过离心从破坏所得的溶液去除微生物细胞碎片，并将获得的上清用作可溶级分。

将上述可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 26/10Q Sepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝53mL)，并吸附于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以8mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸附的蛋白。合并具有醛缩酶活性的级分，并对其分别以1M和20M的终浓度添加硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)。

将所得溶液上样于用1M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 16/10Phenyl Sepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝20mL)，并吸附于载体。用1M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)，然后通过以3mL/分钟的流速将硫酸铵的浓度从1M线性改变至0M来洗脱吸附的蛋白。合并具有醛缩酶活性的级分并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)将其浓缩。将获得的浓缩溶液用20mMTris-HCl(pH 7.6)稀释，并用作SpAld溶液。使用PHOG作为底物在下述条件下将醛缩酶活性测量为醛醇(aldol)降解活性。

反应条件：50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，2mM PHOG，0.25mM NADH，1mM MgCl₂，16U/mL乳酸脱氢酶，并在25℃测量340nm处的吸光度。

通过下述方法制备pTB2菌株。

将一环描述于国际公开WO2009/028338中的实施例2的pTB2菌株接种于500mL坂口烧瓶中的50mL含100mg/L氨苄青霉素的TB液体培养基，并在37℃搅拌培养16小时。将获得的培养基用作坂口烧瓶中pTB2菌株的培养基(TB培养基)。

实施例7：通过具有2S，4R-莽那亭形成活性的微生物合成2S，4R-莽那亭

(1)由细菌合成2S，4R-莽那亭

将放射根瘤菌LAT1，放射根瘤菌AJ11568，海洋迪茨氏菌AJ2788，寡养单胞菌属菌种AJ3447，寡养单胞菌属菌种AJ13127，绿针假单胞菌绿针亚种NBRC3904，藤黄微球菌NBRC3067，寡养单胞菌属菌种AJ11634，恶臭假单胞菌NBRC12668，Ochrobactrum pseudogrignonense AJ3735，寡养单胞菌属菌种AJ1591，寡养单胞菌属菌种AJ3839，缺陷短波单胞菌AJ3958，香茅醇假单胞菌ATCC13674，节杆菌属菌种AJ1436，根瘤菌属菌种AJ12469，放射根瘤菌AJ2777，伯克霍尔德氏菌属菌种AJ3084，微杆菌属菌种AJ2787，腐臭假单胞菌ATCC4683，放射根瘤菌ATCC4452，放射根瘤菌AJ2557，Carnimonas sp.AJ3230，放射根瘤菌NBRC12667，莓实假单胞菌NBRC3458，放射根瘤菌NBRC12664，产氨棒杆菌NBRC12072，假单胞菌属菌种AJ1594，放射根瘤菌ATCC6466，产黄假单胞菌NBRC3912，放射根瘤菌ATCC4720或假单胞菌属菌种AJ2438施于营养培养液(NB)琼脂培养基或CM2G琼脂培养基(10g/L酵母提取物，10g/L多蛋白胨，5g/L葡萄糖，5g/L NaCl，15g/L琼脂，pH 7.0)，并在30℃温育2日。

然后，将1g玻璃珠(0.1mm)添加至1mL该微生物细胞悬液，并使用多珠振荡器(Yasui Kikai Co.，Ltd.)破坏微生物细胞。将所得的破坏的细胞溶液离心以使用上清作为微生物细胞提取物。

合成2S，4R-莽那亭的反应和2S，4R-莽那亭的定量以与实施例1中相同的方式进行，且形成的2S，4R-莽那亭的量如下所述(表2)

表2：产生的2S，4R-莽那亭的量

菌	形成的2S，4R-莽那亭的量
		放射根瘤菌LAT1	3.8mM
放射根瘤菌AJ11568	3.5mM
		海洋迪茨氏菌AJ2788	3.2mM
寡养单胞菌属菌种AJ3447	2.7mM
		寡养单胞菌属菌种AJ13127	2.7mM
绿针假单胞菌绿针亚种NBRC3904	2.6mM
		藤黄微球菌NBRC3067	2.3mM
寡养单胞菌属菌种AJ11634	2.2mM
		恶臭假单胞菌NBRC12668	2.2mM
Ochrobactrum pseudogrignonense AJ3735	2.2mM
		寡养单胞菌属菌种AJ1591	2.1mM
寡养单胞菌属菌种AJ3839	2.1mM
		缺陷短波单胞菌AJ3958	2.0mM
香茅醇假单胞菌ATCC13674	1.9mM
		节杆菌属菌种AJ1436	1.7mM
根瘤菌属菌种AJ12469	1.6mM
		放射根瘤菌AJ2777	1.5mM
伯克霍尔德氏菌属菌种AJ3084	1.5mM
		微杆菌属菌种AJ2787	1.5mM
腐臭假单胞菌ATCC4683	1.4mM
		放射根瘤菌ATCC4452	1.4mM
放射根瘤菌AJ2557	1.4mM
		Carnimonas sp.AJ3230	1.4mM
放射根瘤菌NBRC 12667	1.3mM
		莓实假单胞菌NBRC3458	1.3mM
放射根瘤菌NBRC 12664	1.3mM
		产氨棒杆菌NBRC12072	1.2mM
假单胞菌属菌种AJ1594	1.2mM
		放射根瘤菌ATCC6466	1.2mM
产黄假单胞菌NBRC3912	1.1mM
		放射根瘤菌ATCC4720	1.1mM
假单胞菌属菌种AJ2438	1.0mM

(2)由放线菌合成2S，4R-莽那亭

将小球诺卡氏菌ATCC21022施于YMPG琼脂培养基(3g/L酵母提取物，3g/L麦芽提取物，5g/L多蛋白胨，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂，pH 7.0)，并在30℃培养2日。

将一环获得的微生物细胞接种至试管中的3mL YMPG培养基(3g/L酵母提取物，3g/L麦芽提取物，5g/L多蛋白胨，10g/L葡萄糖，pH 7.0)，并在30℃振荡培养16小时。通过离心从2mL培养基收集微生物细胞，用20mMTris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中以制备1mL微生物细胞悬液。

然后，将1g玻璃珠(0.1mm)添加至1mL该微生物细胞悬液，并使用多珠振荡器(Yasui Kikai Co.，Ltd.)破坏微生物细胞。将所得的破坏的细胞悬液离心以使用上清作为微生物细胞提取物。

合成2S，4R-莽那亭的反应和2S，4R-莽那亭的定量以与实施例1中相同的方式进行，且形成的2S，4R-莽那亭的量如下所述(表3)

表3：形成的2S，4R-莽那亭的量

微生物	形成的2S，4R-莽那亭的量
		小球诺卡氏菌ATCC21022	0.57mM

(3)由酵母合成2S，4R-莽那亭

将长孢洛德酵母CBS2605，挪威假丝酵母NBRC0970，Candida inconspicuaNBRC0621或解脂西洋蓍霉NBRC0746施于YPD琼脂培养基(10g/L酵母提取物，20g/L多蛋白胨，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂)，并在30℃培养2日。

将一环获得的微生物细胞接种至试管中的YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L多蛋白胨，20g/L葡萄糖)，并在30℃振荡培养16小时。通过离心从2mL培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中以制备1mL微生物细胞悬液。

然后，将1g玻璃珠(0.5mm)添加至1mL该微生物细胞悬液，并使用多珠振荡器(Yasui Kikai Co.，Ltd.)破坏微生物细胞。将所得的破坏的细胞悬液离心以使用上清作为微生物细胞提取物。

合成2S，4R-莽那亭的反应和2S，4R-莽那亭的定量以与实施例1中相同的方式进行，且形成的2S，4R-莽那亭的量如下所述(表4)。

表4：形成的2S，4R-莽那亭的量

微生物	形成的2S，4R-莽那亭的量
		长孢洛德酵母CBS2605	0.57mM
挪威假丝酵母NBRC0970	0.55mM
		Candida inconspicua NBRC0621	0.52mM
解脂西洋蓍霉NBRC0746	0.52mM

实施例8：2S，4R-莽那亭钾盐二水合物的产生

在将149.00g乙醇添加至还原反应浓缩溶液(含有36.62g(125.28mmol)的莽那亭，(2S，4R)∶(2R，4R)＝32∶68)之后，添加0.252R，4R-莽那亭钾盐一水合物作为晶种，并在56℃搅拌混合物4小时以进行2R，4R-莽那亭钾盐一水合物的差示结晶(preferential crystallization)。通过过滤分离结晶的晶体(湿晶体31.27g)而获得225.80g母液(含有22.41g(76.68mmol)的莽那亭，(2S，4R)∶(2R，4R)＝53∶47)。将该母液冷却至10℃，并搅拌5小时以结晶2S，4R-莽那亭钾盐二水合物。通过过滤分离晶体(湿晶体32.74g)，并在减压下干燥而获得9.88g(15.68mmol)的目标2S，4R-莽那亭钾盐二水合物(HPLC纯度：55.5％)。然后，将9.35g粗晶体溶解于25.37g水，并将58.99g乙醇添加至该溶解溶液，并在25℃搅拌5小时以通过结晶精制所述2S，4R-莽那亭钾盐二水合物。通过过滤分离晶体(湿晶体4.49g)，并在减压下干燥以得到3.75g(9.62mmol)的目标2S，4R-莽那亭钾盐二水合物(HPLC纯度：96.0％)。

通过水测量方法和使用离子层析的阳离子分析来分析获得的晶体(2S，4R-莽那亭钾盐二水合物)的水含量和钾含量。进行的水测量方法和阳离子分析方法的细节如下所示。

(水测量方法)

测量装置：Hiranuma Automatic Water Measurement Apparatus AQV-2000(由Hiranuma Sangyo Corporation提供)

测量条件：滴定溶液＝Hydranal Composite 5K(由Riedel de Haen提供)

(阳离子分析方法)

装置：Tosoh IC2001

柱：TSKgel SuperIC-Cation(4.6×150mm)

保护柱：TSKgel SuperIC-Cation(1em)

抑制凝胶(Suppress gel)：TSKgel TSKsuppressIC-C

柱温度：40℃

洗脱液流速：0.7mL/分钟

样品注入量：30μL

检测：电导率

洗脱液组成：2.2mM甲磺酸+1.0mM 18-冠-6-醚+0.5mM组氨酸混合水溶液

¹H NMR(400MHz，D₂O)δ：2.11(dd，J＝19.0，27.0Hz，1H)，2.39(dd，J＝5.0，27.0Hz，1H)，3.14(s，2H)，3.90(dd，J＝5.0，19.0Hz，1H)，7.06(m，1H)，7.13(m，1H)，7.15(s，1H)，7.40(d，8.5Hz，1H)，7.6(d，8.5Hz，1H)

ESI-MS计算值：C₁₄H₁₆N₂O₅＝292.11

ESI-MS分析值：C₁₄H₁₆N₂O₅＝290.9[M-H]^-

实施例9：使用5-硝基水杨醛的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将7.6mg(0.045mmol)的5-硝基水杨醛和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，而反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶2.1。

实施例10：使用吡哆醛盐酸盐的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将9.1mg(0.045mmol)的吡哆醛盐酸盐和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶1.3。

实施例11：使用吡哆醛5-磷酸一水合物的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将12.8mg(0.048mmol)的吡哆醛5-磷酸一水合物和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶1.1。

实施例12：使用水杨醛的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将5.3mg(4.6μL，0.043mmol)的水杨醛和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶0.6。

实施例13：使用3，5-二氯水杨醛的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将8.1mg(0.042mmol)的3，5-二氯水杨醛和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶1.5。

实施例14：使用2S，4R-莽那亭钾盐二水合物作为起始物质通过异构-结晶产生2R，4R-莽那亭钾盐一水合物

将2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至20％乙醇的水溶液，并在60℃完全溶解。将相对于2S，4R-莽那亭的5摩尔百分比5-硝基水杨醛和相对于2S，4R-莽那亭的30摩尔百分比乙酸添加至该溶解溶液，并搅拌48小时。将终浓度70％的乙醇添加至该反应溶液(2S，4R-莽那亭∶2R，4R-莽那亭＝1∶2.1)，接着对其添加作为晶种的相对于反应溶液中的2R，4R-莽那亭的一百分比2R，4R-莽那亭钾盐一水合物，并将混合物在60℃搅拌48小时以进行异构-结晶。通过过滤分离结晶的晶体，并将其在减压下干燥而获得目标2R，4R-莽那亭钾盐一水合物。

实施例15：使用乙醛酸的异构反应

将0.15g(0.38mmol)的2S，4R-莽那亭钾盐二水合物添加至10.0g的70％乙醇水溶液，并在60℃完全溶解。将5.1mg(0.069mmol)的乙醛酸和7.5μL(0.13mmol)乙酸添加至该溶解溶液，并在60℃搅拌48小时。通过HPLC分析并量化反应溶液，反应溶液中2S，4R-莽那亭和2R，4R-莽那亭的摩尔比为1∶0.07。

实施例16：源自AJ1616菌株的L-氨基酸氨基转移酶(LAT)突变体的产生和对于多种酮酸的比活性的测量

(1)通过定点诱变产生突变的LAT-表达质粒

依照由Stratagene提供的QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit的实验方案通过定点诱变来产生表达源自AJ1616菌株的突变LAT的质粒。合成了一组引物，其设计为使得突变(取代)导入靶核苷酸残基，并与双链DNA的各链成为互补。产生的突变体和用于产生所述突变体的引物的核苷酸序列分别示于表5和6。使用pET22-AJ1616LAT-His(C)作为模板在下述PCR条件下产生突变体质粒：

通过用藉由识别甲基化DNA进行切割的限制性酶Dpn I(37℃，一小时)处理来切割模板pET22-AJ1616LAT-His(C)，然后用所得的反应溶液转化大肠杆菌JM109。从转化体收集质粒，并通过对核苷酸测序来确证已导入靶核苷酸残基的突变(取代)。通过制备S258G突变体质粒，接着使用导入I289A突变的引物重复同样操作来构建作为S258G/I289A双重突变体的ID136。通过制备ID166(T288G)突变体质粒，接着使用导入K39R突变的引物重复同样操作来构建作为K39R/T288G双重突变体的ID189。通过制备T288G突变体质粒，接着使用导入Q287E/T288G突变的引物重复同样操作来构建作为Q287E/T288G双重突变体的ID296。

表5：制备的突变体

ID	突变体
		ID136	S258G/I289A
ID166	T288G
		ID189	K39R/T288G
ID296	Q287E/T288G

表6：用于导入突变的引物的核苷酸序列

(2)突变的LAT的表达和纯化

用获得的突变体AJ1616LAT表达质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)以产生突变体AJ1616LAT表达菌株。将生长于LB-amp(100mg/L)平板上的突变体AJ1616LAT表达菌株pET22-AJ1616LATmut-His(C)/大肠杆菌JM109(DE3)的微生物细胞接种于100mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express InstantTB Medium(Novagen)，并使用坂口烧瓶在37℃振荡培养16小时。在培养完成之后，通过离心从所得的培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗涤并悬于其中，然后对其进行声处理。通过离心从破坏的悬液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。将所得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑平衡的His标记的蛋白纯化柱His TALON superflow 5ml Catridge(Clontech)，并吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)，然后，使用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mMNaCl和150mM咪唑以5mL/分钟的流速洗脱吸收的蛋白。合并所得级分，并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩合并的级分。用20mM Tris-HCl(pH7.6)稀释浓缩的级分以用作突变体AJ1616LAT溶液。如果需要，通过增加培养基的量和连接的His TALON柱的数目来进行纯化。

(3)蛋白浓度的测量

使用由Nacalai Tesque提供的蛋白测定CBB溶液(使用时稀释5倍)测量蛋白浓度。通过使用含有0.05、0.1、0.25和0.5mL/mL BSA的溶液作为标样准备标准曲线来计算蛋白浓度。

(4)通过比色法测量对于L-Asp/α-KG、L-Asp/PA和L-Asp/±MHOG的活性

测量了AJ1616LAT对多种底物的活性。使用100mM L-Asp作为转氨反应的氨基供体底物，并通过比色法测量对于10mM多种酮酸的比活性。

对于L-Asp/α-KG(α-酮戊二酸)的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na，10mM α-KG-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自猪心的苹果酸脱氢酶(Sigma)作为MDH。对于L-Asp/α-KG的活性示于表9中氨基转移酶活性的“α-KG”栏。

对于L-Asp/PA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na，10mM PA-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH(同上)中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。对于L-Asp/PA的活性示于表9中氨基转移酶活性的“PA”栏。

对于L-Asp/(±)-MHOG(4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸)的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na，10mM(±)-MHOG，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH，2U/mL MDH和10U/mL LDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。添加LDH以去除(±)-MHOG中的痕量污染的PA。对于L-Asp/(±)-MHOG的活性示于表9中氨基转移酶活性的“(±)-MHOG”栏。

(5)对于L-Asp/4R-IHOG和L-Asp/IPA的活性的测量

测量了从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的活性，即目标活性，和从IPA形成L-Trp作为副产物的活性。使用100mM L-Asp作为转氨反应的氨基供体底物。进行了对10mM酮酸的转氨反应。通过UPLC或HPLC对形成的氨基酸的量进行定量，并计算比活性。

对于L-Asp/4R-IHOG(10mM)的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na，10mM 4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)终止反应。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表9中氨基转移酶活性的“4R-IHOG”栏。

对于L-Asp/IPA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na，10mM IPA，50μMPLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)(在制备反应溶液之后用1N NaOH将pH调整至8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的Trp进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)终止反应。对于L-Asp/IPA的活性显示于表9中氨基转移酶活性的“IPA”栏。

使用由Waters提供的ACQUITY UPLC系统对形成的莽那亭和Trp进行定量。测量条件如下所示。在0.2mL中的反应进行15分钟，然后终止。将终止反应后的反应溶液离心，然后对约0.2mL上清进行UPLC分析。采用通过使用系列稀释(其中样品和空白的浓度落入0.01至0.05mM的范围)的测量获得的结果作为活性值。

表7

可分别在1.1分钟，1.5分钟和1.3分钟分别对2S，4R-莽那亭，2S，4S-莽那亭和Trp进行定量。

在下述分析条件下使用HPLC的定量亦与上述一同进行。

HPLC条件(对于莽那亭，Trp，IPA，IAA(吲哚乙酸盐)，IAD(吲哚醛)的定量条件)

柱：CAPCELL PAK C18TYPE MGII 3μm，4.6mm×150mm(Shiseido)

柱温度：40℃

检测波长：280nm

流速：1.0mL/分钟

流动相：A：20mM KH₂PO₄/CH₃CN＝100/5，B：CH₃CN

表8

(6)测量AJ1616菌株LAT突变体针对多种酮酸的比活性的结果

针对10mM酮酸的比活性的结果示于表9，这是用产生的突变体和L-Asp作为氨基供体测量的。使用4R-IHOG作为底物形成2S，4R-莽那亭的目标活性在任何产生的突变体中得到增强。关于相对于目标活性副反应的相对值，产生副产物L-Trp的活性，产生副产物MHG(4-羟基-4-甲基谷氨酸)的活性，和产生副产物L-Ala的活性，在任何突变体中相对于目标活性(形成2S，4R-莽那亭的活性)减少。

表9：突变体相对于多种酮酸的比活性

实施例17：大肠杆菌JM109ΔaspC菌株的构建和含有表达的脱氨酶的培养液的产生

通过下述方法构建大肠杆菌JM109ΔaspC。将大肠杆菌JM109/pKD46在30℃在LB-amp(100mg/L)平板上培养过夜。将获得的微生物细胞接种于50mL的LB(含有100mg/L的Amp和10mM L-阿拉伯糖)。将其在30℃使用坂口烧瓶振荡培养。当OD₆₁₀为约0.6时，培养温度改变为37℃，并继续振荡培养一小时。通过离心从所得的培养基收集微生物，用10％甘油洗涤，并再次通过离心收集。将其悬于10％甘油作为感受态细胞使用。

用pMW118-attL-cat-attR作为模板使用引物aspC-L1(5’-TTTGAGAACATTACCGCCGCTCCTGCCGACCCGATTCTGGGCtgaagcctgcttttttat-3’：SEQIDNO：36)和引物aspC-R1(5’-CAGCACTGCCACAATCGCTTCGCACAGCGGAGCCATGTTATCcgctcaagttagtataaa-3：SEQ ID NO：37)进行通过PCR的扩增。将所得的PCR产物从琼脂糖提取出以用作供aspC基因破坏的DNA片段。使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

用纯化的DNA片段转化感受态细胞，并在37℃在LB-Cm(20mg/L)平板上选择目标转化体。通过菌落PCR确证attL-cat-attR插入转化体的aspC基因区。使用的引物为引物aspC-up(5’-AACCTCTTGGCAACGGTAAAAAAGCTGAAC-3’：SEQ ID NO：38)、引物attL-1(5’-TAGTGACCTGTTCGTTGC-3’：SEQ ID NO：39)、引物aspC-down(5’-GCCTGCGCAAAGTCGTATGTTTGGTCTGGA-5’：SEQ ID NO：40)和引物attR-1(5’-TTACGTTTCTCGTTCAGC-3’：SEQ ID NO：41)。将Z-taq(TAKARA)用于PCR。

将获得的转化体接种于3mL LB(Cm 20mg/L)，并在37℃振荡培养6小时。通过离心从所得的培养基收集微生物细胞，用10％甘油洗涤，并通过离心再次收集微生物细胞。将这些细胞悬于10％甘油以用作感受态细胞。

用pMW-intxis-ts转化感受态细胞以去除插入在基因组DNA中的Cm抗性基因。在30℃在LB-Amp(100mg/L)平板上选择目标转化体。将获得的转化体在LB平板上在42℃培养过夜，然后将微生物细胞分别在LB-Amp(100mg/L)平板和LB-Cm(20mg/L)平板上划线，并在37℃进行培养。确证转化体在含有Amp的平板和含有Cm的平板上均不生长。此外，Cm抗性基因的去除通过使用引物(5’-AACCTCTTGGCAACGGTAAAAAAGCTGAAC-3’：SEQ ID NO：38)和引物aspC-down(5’-GCCTGCGCAAAGTCGTATGTTTGGTCTGGA-5’：SEQID NO：40)的菌落PCR得以确证。将Z-tag(TAKARA)用于PCR。

将获得的菌株命名为aspC缺陷株，大肠杆菌JM109ΔaspC。通过用脱氨酶表达质粒pTB2转化大肠杆菌JM109ΔaspC构建了脱氨酶表达株pTB2/大肠杆菌JM109ΔaspC。将该细菌菌株在LB-amp(100mg/L)上在37℃培养过夜。将获得的微生物细胞接种至100mL的TB-amp(100mg/L)并使用坂口烧瓶在37℃振荡培养16小时。所得的培养基已经用作Ps_aad培养液。

实施例18：草酰乙酸脱羧酶表达菌株的构建

向GenScript索求合成源自恶臭假单胞菌KT2440菌株的OAA脱羧酶基因，并获得了其中含有OAA脱羧酶的片段已插入pUC57的质粒DNA。对于在大肠杆菌中表达进行了密码子使用频率的优化(参见SEQ ID NO：42和43)。用NdeI和XhoI切割该质粒，插入用NdeI和XhoI切割的pET22b，并将所得的质粒命名为pET22-PpODC-His(C)。用所得的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得PpODC-His(C)表达菌株pET22-PpODC-His(C)/大肠杆菌BL21(DE3)。将生长于LB-amp(100mg/L)平板上的PpODC-His(C)表达菌株pET22-PpODC-His(C)/大肠杆菌BL21(DE3)的微生物细胞接种于100mL的Overnight Express Instant TBMedium(Novagen)，并使用坂口烧瓶在30℃振荡培养16小时。在培养完成之后，从所得的培养基收集微生物细胞，并用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗涤，并悬于其中，然后对其进行声处理。通过离心从破坏所得的悬液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。将所得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑平衡的His标记的蛋白纯化柱His TALON superflow 5ml Catridge(Clontech)，并吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)，然后，使用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和150mM咪唑以5mL/分钟的流速洗脱吸收的蛋白。合并所得级分，并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩获得的溶液。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释获得的溶液以用作PpODC溶液。

在如下所示的条件下测量ODC活性。

ODC活性的测量在下述条件下进行。

在25℃的10mM OAA，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mMNADH和10U/mL LDH。活性依照340nm处吸光度的减少来计算。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。以1mL的规模进行反应和分析，并采用其中测量值[(样品Δ340nm/分钟)-(空白Δ340nm/分钟)]落在0.05至0.15的范围上的系列稀释中的活性值。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)和0.01％BSA稀释酶。

实施例19：从100mM L-Trp(WT，ID136，ID166)的2S，4R-莽那亭一锅法合成反应

在下述条件下使用纯化的突变体AJ1616LAT进行了22小时的反应。使用试管以1mL的体积进行反应。在14、18和22小时之后进行取样。用TE缓冲液稀释样品，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心型过滤器(centrifugationtype filter)10kDa进行超滤，并分析滤过物。使用HPLC进行分析。

反应条件：100mM L-Trp，50mM PA-Na，300mM L-Asp-Na，1mMMgCl2，50μM PLP，100mM Tris-HCl，20mM KPB，pH 7.0，40％Ps_aad培养液，0.2mg/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，2U/mL纯化的突变体AJ1616 LAT酶(对10mM 4R-IHOG)，和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃在140rpm。

下面描述制备进行反应的酶的方法。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例6中所述的方法进行SpAld表达株的釜培养，并进一步在60℃进行一小时的热处理。通过离心从热处理之后所得的100mL培养基收集微生物细胞，并用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗涤，并悬于其中，然后对其进行声处理。通过离心从破坏所得的悬液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。添加硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)使得可溶级分含有1M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)。将该溶液上样于用1M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 26/10Phenyl Sepharose HP(由GE HealthcareBiosciences提供，CV＝53mL)，并吸收于载体。用1M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的未吸收蛋白，然后，以8mL/分钟的流速通过将硫酸铵浓度从1M线性变化至0M来洗脱吸收的蛋白。合并其中检测出活性的级分，并使用Amicon Ultra-15 10k(Millipore)浓缩获得的溶液。用20mM Tris-HCl(pH7.6)稀释所得的浓缩的溶液以用作SpAld溶液。使用PHOG降解活性测量方法以供测量醛缩酶活性(在25℃在2mM PHOG，50mM KPB，1mM MgCl₂，0.25mMNADH和16U/mL LDH(pH 7.0)中测量，由340nm处吸光度的减少来计算活性)。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。

突变体AJ1616LAT：将生长于LB-amp(100mg/L)平板的突变体AJ1616LAT表达菌株pET22-AJ1616LATmut-His(C)/大肠杆菌JM109(DE3)的微生物细胞接种于100mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TBMedium(Novagen)，并使用坂口烧瓶在37℃振荡16小时。在培养完成之后，从所得的培养基收集微生物细胞，并用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mMNaCl和10mM咪唑洗涤，并悬于其中，然后对其进行声处理。通过离心从破坏所得的悬液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。将所得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑平衡的His标记的蛋白纯化柱His TALON superflow 5ml Catridge(Clontech)，并吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)，然后，使用20mM Tris-HCl(pH7.6)，300mM NaCl和150mM咪唑以5mL/分钟的流速洗脱吸收的蛋白。合并所得级分，并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩获得的溶液。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液以用作突变体AJ1616LAT溶液。如果需要，通过增加培养基的量和连接的His TALON柱的数目来进行纯化。

OAA DCase：使用来自假单胞菌属菌种的草酰乙酸脱羧酶(Sigma)。使用生产商所述的值作为酶的量(U)。

SOD：使用来自猪肝的超氧化物歧化酶(Sigma)。使用生产商所述的值作为酶的量(U)。

作为一锅法反应的结果，在使用产生的ID136和ID166突变酶的情况下，与野生酶相比，增强了2S，4R-莽那亭的收率(表10)。

表10：在使用100mM Trp作为底物的一锅法反应中2S，4R-莽那亭的收率

实施例20：从100mM Trp(ID166，400mL规模)的2S，4R-莽那亭的一锅法合成反应

在下述条件下使用纯化的AJ1616 LAT-ID166进行6小时的反应。所述反应使用1升体积的釜以400mL的体积进行。进行适当的取样，将样品用TE缓冲液稀释，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心类型过滤器10kDa对其进行超滤，并分析滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：100mM L-Trp，50mM PA-Na，300mM L-Asp-Na，1mM MgCl₂，50μM PLP，20mM KPB(pH 7.6)，pH＜7.6(1M H₂SO₄)，40％Ps_aad培养液，10％SpAld培养液，5U/mL的PpODC，4U/mL的AJ1616 LAT-ID166(对10mM4R-IHOG)和100U/mL的SOD，在25℃，500rpm，20mL/分钟(1/20vvm)通气。

使用pTB2/大肠杆菌JM109ΔaspC培养液作为Ps_aad培养液。使用实施例19中所述的经热处理的培养液作为SpAld培养液。使用实施例18中所述的纯化的酶作为PpODC。使用来自猪肝的超氧化物歧化酶(Sigma)作为SOD。

结果，在6小时之后确证了86mM 2S，4R-莽那亭的累积(图4)。在校正溶液量之后计算出的相对于L-Trp的收率为89％。

实施例21：从150mM L-Trp(ID189，80mL规模)的2S，4R-莽那亭的一锅法合成反应。

在下述条件下使用纯化的AJ1616 LAT-ID189进行27小时的反应。所述反应使用250mL体积的釜以80mL的体积进行。进行适当的取样，将样品用TE缓冲液稀释，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心类型过滤器10kDa对其进行超滤，并分析滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：150mM L-Trp，50mM PA-Na，400mM L-Asp-Na，1mM MgCl₂，50μM PLP，20mM KPB(pH 7.6)，pH＜7.6(1M H₂SO₄)，40％Ps_aad培养液，10％SpAld培养液，5U/mL的PpODC，4U/mL的AJ1616 LAT-ID189(对10mM4R-IHOG)和100U/mL的SOD，在25℃(380rpm)，4mL/分钟(1/20vvm)通气。

结果，在27小时之后确证了105mM 2S，4R-莽那亭的累积(图5)。在校正溶液量之后计算出的相对于L-Trp的收率为78％(图5)。

实施例22：2S，4R-莽那亭的分离

将2.59g的ZN炭添加至通过用(MWCO：3000)处理实施例20中的435.45g的酶反应溶液(批号101213J4)而获得的435.66g的渗透溶液，并在室温(约26℃)搅拌混合物1小时。用Kiriyama过滤器(5C)过滤活性炭，并将所得的滤过物转移至1升四颈烧瓶。将烧瓶浸于5℃的培养箱中，用35％盐酸中和溶液将pH调整至3.5，并使用机械搅拌器(120rpm)搅拌。然后添加48mg晶种，接着使用pH控制器和蠕动泵添加1N盐酸以维持目标pH，因为当晶体开始沉淀时，pH升高。过滤通过搅拌24小时获得的浆料溶液，用10mL水洗涤晶体，并在减压下在40℃干燥湿晶体以产生6.81g的2S，4R-莽那亭。获得的晶体的品质通过HPLC和¹H-NMR分析得以确证。

HPLC面积纯度(210nm)：98.4％

¹H-NMR(在D₂O+K₂CO₃中)

2.08-2.14(1H，dd)，2.35-2.39(1H，dd)，3.09-3.17(2H，dd)，3.85-3.88(1H，dd)，7.04-7.15(3H，m)，7.39-7.41(1H，m)，7.64-7.66(1H，d)。

实施例23：2R，4R-莽那亭的合成

将3.10g(10.4mmol)在实施例22中获得的2S，4R-莽那亭和1.165g(10.4mmol)的50％KOH溶解于3.27g水，并进一步对其添加1.3g的EtOH，0.0869g(0.052mmol)的5-硝基水杨醛和0.187g(3.12mmol)乙酸。在25小时之后，添加了20.5g的EtOH和10mg晶种(2R，4R-莽那亭)，并继续搅拌混合物46.5小时。将所得的浆料溶液冷却至室温，然后过滤。用4g的85％EtOH-水洗涤晶体，并在减压下在40℃干燥湿晶体以产生2.3g的粗2R，4R-莽那亭。将2.1g所得的粗2R，4R-莽那亭溶解于6mL水，添加0.2g的BA碳，并将混合物在室温(约25℃)搅拌一小时，然后用0.45μm膜过滤器进行过滤。将滤过物在减压下浓缩至6.38g。将12g的EtOH在45℃滴注至浓缩的滤过物，然后搅拌一小时。此外，将13.5g的EtOH在一小时内定量滴注，然后在45℃搅拌16小时，接着冷却至25℃。过滤所得的浆料溶液，用3g的85％EtOH-水洗涤晶体，并在40℃在减压下干燥湿晶体而获得1.9g(5.46mmol)的2R，4R-莽那亭。通过HPLC分析获得的晶体、母液和洗涤溶液以分析收率和品质。

HPLC面积纯度(210nm)：99.9％

¹H-NMR(在D₂O中)

1.93-2.00(1H，dd)，2.57-2.61(1H，dd)，2.99-3.02(1H，d)，3.19-3.22(1H，d)，3.55-3.56(1H，dd)，7.04-7.15(3H，m)，7.39-7.41(1H，m)，7.64-7.66(1H，d)。

表11

实施例24：从150mM L-Trp(ID296，80mL规模)的2S，4R-莽那亭的一锅法合成反应。

在下述条件下使用纯化的AJ1616 LAT-ID296进行51小时的反应。所述反应使用250mL体积的釜以80mL的体积进行。进行适当的取样，将样品用TE缓冲液稀释，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心类型过滤器10kDa对其进行超滤，并分析滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：150mM L-Trp，50mM PA-Na，400mM L-Asp-Na，1mM MgCl₂，50μM PLP，20mM KPB(pH 7.6)，pH＜7.6(1M H₂SO₄)，40％Ps_aad培养液，10％SpAld培养液，5U/mL的PpODC，4U/mL的AJ1616LAT-ID296(对10mM4R-IHOG)和100U/mL的SOD，在25℃(380rpm)，4mL/分钟(1/20vvm)通气。

结果，在39小时之后确证了113mM 2S，4R-莽那亭的累积(图6)。在校正溶液量之后计算出的相对于L-Trp的收率为86％(图6)。

实施例25：源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶的纯化

如下所述从放射根瘤菌AJ3976可溶级分纯化形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶。该反应在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM 4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中进行。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭进行定量。

表12-1

(1)可溶级分的制备

将放射根瘤菌AJ3976的微生物细胞涂布于LB琼脂培养基，并在30℃培养两日。

将一环获得的微生物细胞接种于500mL坂口烧瓶中的160mL酶产生培养基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L葡萄糖，3g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，0.1g/L七水合硫酸镁，和5g/L硫酸铵)，然后将其在30℃振荡培养20小时。通过离心从1920mL所得的培养基收集微生物细胞，用20mMTris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中，并在4℃进行30分钟声处理。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

(2)阴离子交换层析

将上述可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 26/10Q Sepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝53mL)，并吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)，然后通过以2mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收于载体的蛋白。在每个洗脱的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约250mMNaCl的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(3)疏水层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并对其分别添加了硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)使得硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)的浓度分别为1.0M和20mM。将该溶液上样于用1.0M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 16/10Phenyl Sepharose HP (由GE Health Care Bioscience提供，CV＝20mL)，并吸收于载体。用1.0M硫酸铵，20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的未吸收蛋白，然后通过以3mL/分钟的流速将硫酸铵的浓度从1.0M线性改变至0M来洗脱2S，4R-莽那亭形成酶。在每个获得的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约0.9M硫酸铵的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(4)凝胶过滤层析

合并并使用Amicon Ultra-15 30K(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl稀释所得的浓缩溶液。将所得的溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱HiLoad 16/60Superdex 200pg(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝120mL)，并以1mL/分钟的流速洗脱蛋白。该操作确证2S，4R-莽那亭形成活性位于分子量估计为约100kDa的位置处。

(5)SDS-PAGE

对获得的级分进行SDS-PAGE，并在47kDa附近检测出源自活性级分的单一条带。将该条带作为形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶的候选而进行N端氨基酸序列的分析。

实施例26：源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶的N端氨基酸序列的确定

对实施例25中获得的纯化的酶溶液进行N端氨基酸序列分析，并获得了N端氨基酸序列AFLADILSRVKPSATIAVTQ(SEQ ID NO：44)。N端氨基酸序列与源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58的天冬氨酸氨基转移酶(AAK87940)的N端氨基酸序列显示高同源性。

实施例27：源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶基因的克隆

将放射根瘤菌AJ3976的微生物细胞以与实施例25中相同的方式培养。通过离心从培养基收集微生物细胞，并从其提取基因组DNA。

使用获得的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有氨基转移酶基因的DNA片段。参照根癌土壤杆菌菌株C58的基因组DNA序列由氨基转移酶基因上游100bp和下游100bp的DNA序列设计引物。使用引物Ag-u100-f(5’-ctggtgcagataagccggcttttgacc-3′：SEQ ID NO：45)和引物Ag-d100-r(5’-ccaccttcatcatgctgctgtttctcg-3’：SEQ ID NO：46)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

确定了约1400bp的扩增的DNA片段的核苷酸序列，并显示其为含有与源自根癌土壤杆菌菌株C58的天冬氨酸氨基转移酶基因(Atu2196)具有高同源性的1203bp的ORF(SEQ ID NO：47和48)的核苷酸序列。其DNA序列的同源性为92％，而其氨基酸序列的同源性为97％。

该氨基酸序列与实施例26中获得的N端氨基酸序列一致。因此，认为可获得具有2S，4R-莽那亭形成活性的氨基转移酶基因。

实施例28：在大肠杆菌中表达源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶

(1)用于源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶的表达质粒的构建

用放射根瘤菌AJ3976的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有源自放射根瘤菌AJ3976的氨基转移酶基因的DNA片段。使用了引物3976AT-Nde-f(5’-ggaattccatATGGCCTTCCTTGCCGACATTCTCT-3’：SEQ ID NO：49)和引物3976-xho-r (5’-actccgctcgagACGGCAATCGGCGCAGAAACGCTGA-3’：SEQID NO：50)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

用限制性酶NdeI和XhoI处理所得的DNA片段，并将其连接于同样用NdeI和XhoI处理的pET-22b(Novagen)。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌落选择目标质粒，并将该质粒命名为pET-22-3976AT-His。在该质粒中，表达源自放射根瘤菌AJ3976、具有添加至C端的His标记的氨基转移酶(3976AT-His)。

(2)从表达3976AT-His的大肠杆菌菌株纯化3976AT-His

将构建的表达质粒pET-22-3976AT-His导入大肠杆菌BL21(DE3)。将一环所得的转化体接种于500mL坂口烧瓶中的160mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)，并将所述坂口烧瓶在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从约1000mL所得的培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑洗涤并悬于其中，并在4℃声处理30分钟。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

将获得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑平衡的His标记蛋白纯化柱HisPrep FF 16/10(由Pharmacia(GEHealth Care Bioscience)供应，CV＝20mL)。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mMNaCl和20mM咪唑洗去未吸附于载体的蛋白(未吸附蛋白)。然后通过以3mL/分钟的流速将咪唑的浓度从20mM线性改变至250mM来洗脱吸收的蛋白。

合并并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩获得的级分。用20mMTris-HCl(pH 7.6)稀释所述浓缩溶液，并将该溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 16/10Q Sepharose HP(由GE HealthCare Bioscience提供，CV＝20mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以3mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收的蛋白。

在每个洗脱的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并合并并使用AmiconUltra-1530K(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液并用作3976AT-His溶液。

实施例29：测量AJ3976LAT对于多种酮酸的比活性的结果

(1)通过比色法测量对于L-Asp/α-KG、L-Asp/PA和L-Asp/(±)-MHOG的活性

测量了AJ3976LAT对多种底物的活性。使用100mM L-Asp作为转氨反应的氨基供体底物，并通过比色法测量对于10mM不同酮酸的比活性。

对于L-Asp/α-KG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mMα-KG-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mLMDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自猪心的苹果酸脱氢酶(Sigma)作为MDH。对于L-Asp/α-KG的活性示于表13中氨基转移酶活性的“α-KG”栏。

对于L-Asp/PA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM PA-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH(同上)中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。对于L-Asp/PA的活性示于表13中氨基转移酶活性的“PA”栏。

对于L-Asp/(±)-MHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-MHOG，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH，2U/mLMDH(同上)和10U/mL LDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。添加LDH以去除以痕量存在于(±)-MHOG中的PA。对于L-Asp/(±)-MHOG的活性示于表13中氨基转移酶活性的“(±)-MHOG”栏。

(2)对于L-Asp/4R-IHOG、L-Asp/(±)-IHOG和L-Asp/IPA的活性的测量

单独测量了从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的活性，从(±)-IHOG形成2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭的活性，即目标活性，和从IPA形成L-Trp作为副产物的活性。使用100mM L-Asp作为氨基供体底物。进行了对10mM酮酸的转氨反应。通过UPLC对形成的氨基酸的量进行定量以计算比活性。

对于L-Asp/4R-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠(pH 4.5)溶液作为终止反应的溶液。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表13中氨基转移酶活性的“4R-IHOG”栏。

对于L-Asp/(±)-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-IHOG，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表13中氨基转移酶活性的“(±)-IHOG”栏。

对于L-Asp/IPA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM IPA，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)(在制备反应溶液之后用1N NaOH将pH调整至8.0)测量。通过UPLC分析对形成的Trp进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/IPA的活性显示于表13中氨基转移酶活性的“IPA”栏。

使用由Waters提供的ACQUITY UPLC系统对形成的莽那亭和Trp进行定量。测量条件如下所示。0.2mL的反应溶液反应15分钟，然后终止反应。对终止反应之后的反应溶液进行离心，然后对约0.2mL上清进行UPLC分析。

表12-2

(3)测量AJ3976LAT对于多种酮酸的比活性的结果

当使用3976-AT-His和使用L-Asp作为氨基供体时，测量对于10mM酮酸的比活性的结果示于表13。

表13：对于多种酮酸的AJ3976LAT的比活性

实施例30：用于使用pET-22-3976AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)合成2S，4R-莽那亭的反应

将一环实施例28中制备的pET-22-3976AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)的微生物细胞接种于试管中的3mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight ExpressInstant TB Medium(Novagen)，并将所述试管在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从1mL培养基收集微生物细胞，并悬于1mL的BugBusterMaster Mix(Novagen)。将所得的悬液在室温温育15分钟以裂解微生物细胞。通过离心去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

使用获得的可溶级分进行用于从4R-IHOG合成2S，4R-莽那亭的反应。向0.1mL反应溶液[100mM L-Asp-Na-1aq，10mM 4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)]，添加0.05mL上述可溶级分，并在25℃使所述混合物反应一小时。在反应完成之后，形成的2S，4R-莽那亭定量为0.84mM。通过UPLC分析定量2S，4R-莽那亭。分析条件与实施例29中相同。

实施例31：源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶的纯化。

如下所述从根瘤菌属菌种AJ12469的可溶级分纯化形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶。2S，4R-莽那亭的合成反应和定量以与实施例25中相同的方式进行。

(1)可溶级分的制备

将根瘤菌属菌种AJ12469的微生物细胞涂布于LB琼脂培养基，并在30℃培养两日。

将一环所得的微生物细胞接种于500mL坂口烧瓶中的160mL酶产生培养基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L葡萄糖，3g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，0.1g/L七水合硫酸镁，5g/L硫酸铵)，然后将其在30℃振荡培养16小时。通过离心从1920mL所得的培养基收集微生物细胞，用20mMTris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中，并在4℃进行30分钟声处理。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

(2)阴离子交换层析

将上述可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 26/10Q Sepharose HP(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝53mL)以吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)，然后通过以8mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收于载体的蛋白。在每个洗脱级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约200mM NaCl的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(3)疏水层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并对其分别添加了硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)使得硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.6)的浓度分别为1.5M和20mM。将所得的溶液上样于用1.5M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 16/10Phenyl Sepharose HP (由GE Health CareBioscience提供，CV＝20mL)以吸收于载体。用1.5M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的未吸收蛋白，然后通过以3mL/分钟的流速将硫酸铵的浓度从1.5M线性改变至0M来洗脱2S，4R-莽那亭形成酶。在每个获得的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约0.8M硫酸铵的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(4)凝胶过滤层析

合并并使用Amicon Ultra-1530K(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM NaCl稀释所得的浓缩溶液。将所得的溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱HiLoad 16/60Superdex 200pg(由GE Health Care Bioscience提供，CV＝120mL)，并以1mL/分钟的流速洗脱蛋白。该操作确证2S，4R-莽那亭形成活性位于分子量估计为约100kDa的位置处。

(5)阴离子交换层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并将所得溶液上样于阴离子交换层析柱Mono Q 5/5(由Pharmacia(GE Healthcare Bioscience)供应，CV＝1mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以0.5mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收的蛋白。在每个洗脱级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约300mM NaCl的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(6)SDS-PAGE

对获得的级分进行SDS-PAGE，并在接近47kDa处检测出源自活性级分的条带。将该条带作为形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶的候选而进行N端氨基酸序列的分析。

实施例32：源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶的N端氨基酸序列的确定

对实施例31中获得的纯化的酶溶液进行N端氨基酸序列分析，并获得了N端氨基酸序列AFLADILSRVKPSATIAVTQ(SEQ ID NO：51)。N端氨基酸序列与源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58的天冬氨酸氨基转移酶(AAK87940)显示高同源性。

实施例33：源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶基因的克隆

将根瘤菌属菌种AJ12469的微生物细胞以与实施例31中相同的方式培养。通过离心从培养基收集微生物细胞，并从其提取基因组DNA。

用获得的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有氨基转移酶基因的DNA片段。参照根癌土壤杆菌菌株C58的基因组DNA序列由氨基转移酶基因上游100bp和下游100bp的DNA序列设计引物。使用引物Ag-u100-f(5’-ctggtgcagataagccggcttttgacc-3′：SEQ ID NO：45)和引物Ag-d100-r(5’-ccaccttcatcatgctgctgtttctcg-3’：SEQ ID NO：46)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

确定了约1400bp的扩增的DNA片段的核苷酸序列，并显示其为含有与源自根癌土壤杆菌菌株C58的天冬氨酸氨基转移酶基因(Atu2196)具有高同源性的1203bp的ORF核苷酸序列(SEQ ID NO：52和53)。其DNA序列的同源性为97％，而其氨基酸序列的同源性为99％。

该氨基酸序列与实施例32中获得的N端氨基酸序列一致。因此，认为可获得具有2S，4R-莽那亭形成活性的氨基转移酶基因。

实施例34：在大肠杆菌中表达源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶

(1)用于源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶的表达质粒的构建

用根瘤菌属菌种AJ12469的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有源自根瘤菌属菌种AJ12469的氨基转移酶基因的DNA片段。使用了引物12469AT-Nde-f (5’-ggaattccatATGGCCTTCCTTGCCGACATTCTCT-3’：SEQID NO：54)和引物12469-xho-r(5’-actccgctcgagGCGGCAATCGGCGCAGAAACGCTGA-3’：SEQ ID NO：55)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

用限制性酶NdeI和XhoI处理所得的DNA片段，并将其连接于同样用NdeI和XhoI处理的pET-22b(Novagen)。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌落选择目标质粒，并将该质粒命名为pET-22-12469AT-His。在该质粒中，表达源自根瘤菌属菌种AJ12469、具有添加至C端的His标记的氨基转移酶(12469AT-His)。

(2)从表达12469AT-His的大肠杆菌菌株纯化12469AT-His

将构建的表达质粒pET-22-12469AT-His导入大肠杆菌BL21(DE3)。将一环转化体接种于500mL坂口烧瓶中的160mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)，并将所述坂口烧瓶在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从约1000mL所得的培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑洗涤并悬于其中，并在4℃声处理30分钟。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

将获得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑平衡的His标记蛋白纯化柱HisPrep FF 16/10(由Pharmacia(GEHealth Care Bioscience)提供，CV＝20mL)以将蛋白吸收于载体。用20mMTris-HCl(pH 7.6)，100mM NaCl和20mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以3mL/分钟的流速将咪唑的浓度从20mM线性改变至250mM来洗脱吸收的蛋白。

合并并使用Amicon Ultra-1530k(Millipore)浓缩获得的级分。用20mMTris-HCl(pH 7.6)稀释所述浓缩溶液，并将其上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 16/10 Q Sepharose HP(由GE Health CareBioscience提供，CV＝20mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以3mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收的蛋白。

在每个洗脱的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并合并并使用AmiconUltra-15 30k(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液以用作12469AT-His溶液。

实施例35：测量AJ12469LAT对于多种酮酸的比活性的结果

(1)通过比色法测量对于L-Asp/α-KG、L-Asp/PA和L-Asp/(±)MHOG的活性

测量了AJ12469LAT对于多种底物的活性。使用100mM L-Asp作为转氨反应的氨基供体底物通过比色法测量对于10mM酮酸的比活性。

对于L-Asp/α-KG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mMα-KG-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mLMDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自猪心的苹果酸脱氢酶(Sigma)作为MDH。对于L-Asp/α-KG的活性示于表15中氨基转移酶活性的“α-KG”栏。

对于L-Asp/PA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM PA-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH(同上)中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。对于L-Asp/PA的活性示于表15中氨基转移酶活性的“PA”栏。

对于L-Asp/(±)-MHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-MHOG，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH，2U/mLMDH(同上)和10U/mL LDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。添加LDH以去除(±)-MHOG中的痕量污染的PA。对于L-Asp/(±)-MHOG的活性示于表15中氨基转移酶活性的“(±)-MHOG”栏。

(2)对于L-Asp/4R-IHOG、L-Asp/(±)-IHOG和L-Asp/IPA的活性的测量

分别测量了从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的活性，从(±)-IHOG形成2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭的活性，即目标活性，和从IPA形成L-Trp作为副产物的活性。使用100mM L-Asp作为转氨反应的氨基供体底物进行了对10mM酮酸的转氨反应，并通过UPLC对形成的氨基酸的量进行定量以计算比活性。

对于L-Asp/4R-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表15中氨基转移酶活性的“4R-IHOG”栏。

对于L-Asp/(±)-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-IHOG，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/(±)-IHOG的活性显示于表13中氨基转移酶活性的“(±)-IHOG”栏。

对于L-Asp/IPA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM IPA，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)(在制备反应溶液之后用1N NaOH将pH调整至8.0)测量。通过UPLC分析对形成的Trp进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/IPA的活性显示于表15中氨基转移酶活性的“IPA”栏。

使用由Waters提供的ACQUITY UPLC系统对形成的莽那亭和Trp进行定量。测量的条件如下所示。0.2mL的反应溶液反应15分钟，然后终止反应。对终止反应之后的反应溶液进行离心，然后对约0.2mL上清进行UPLC分析。

表14

(3)测量AJ12469LAT对于多种酮酸的比活性的结果

当使用12469-AT-His和使用100mM L-Asp作为氨基供体时，测量对于10mM酮酸的比活性的结果示于表15。

表15：AJ12469LAT对于多种酮酸的比活性

实施例36：用于使用pET-22-12469AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)合成2S，4R-莽那亭的反应

将一环实施例34中制备的pET-22-12469AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)的微生物细胞接种于试管中的3mL含有100mg/L氨苄青霉素的OvernightExpress Instant TB Medium(Novagen)，并将所述试管在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从1mL培养基收集微生物细胞，并悬于1mL的BugBuster Master Mix(Novagen)。将所得的悬液在室温温育15分钟以裂解微生物细胞。通过离心去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

使用获得的可溶级分进行用于从4R-IHOG合成2S，4R-莽那亭的反应。向0.1mL反应溶液[100mM L-Asp-Na-1aq，10mM 4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)]，添加0.05mL上述可溶级分，并在25℃使所述混合物反应一小时。在反应完成之后，形成的2S，4R-莽那亭定量为0.87mM。通过UPLC分析定量2S，4R-莽那亭。分析的条件与实施例29中相同。

实施例37：源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶的纯化。

如下从产氨棒杆菌AJ1444的可溶级分纯化形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶。2S，4R-莽那亭的合成反应和定量以与实施例25中相同的方式进行。

(1)可溶级分的制备

将产氨棒杆菌AJ1444的微生物细胞涂布于LB琼脂培养基，并在30℃培养两日。

将一环所得的微生物细胞接种于500mL坂口烧瓶中的160mL酶产生培养基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，1g/L葡萄糖，3g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，0.1g/L七水合硫酸镁，5g/L硫酸铵)，在30℃振荡培养16小时。通过离心从约1760mL培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗涤并悬于其中，并通过添加玻璃珠和使用多珠振荡器(Yasui KikaiCorporation)进行破坏。通过离心从破坏所得的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

(2)硫酸铵沉淀

将硫酸铵添加至上述可溶级分使得硫酸铵的终浓度为90％(w/w)，并通过离心获得硫酸铵沉淀。

(3)疏水层析

将上述硫酸铵沉淀溶解于1.0M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)。将该溶液上样于用1.0M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的疏水层析柱HiLoad 26/10Phenyl Sepharose HP (由GE Health Care Bioscience提供，CV＝53mL)以将蛋白吸收于载体。用1.0M硫酸铵和20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的未吸收蛋白。然后，通过以3mL/分钟的流速将硫酸铵的浓度从1.0M线性改变至0M来洗脱2S，4R-莽那亭形成酶。在每个获得的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约0.2M硫酸铵的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(4)阴离子交换层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并针对20mMTris-HCl(pH 7.6)透析过夜。将所得溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡阴离子交换层析柱HiLoad 16/10Q Sepharose HP(由GE HealthcareBioscience提供，CV＝20mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以2.25mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收的蛋白。在每个洗脱级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约400mM NaCl的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(5)凝胶过滤层析

合并并使用Amicon Ultra-1510k(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mM NaCl稀释所得的浓缩溶液。将所得的溶液上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mM NaCl平衡的凝胶过滤柱HiLoad 16/60Superdex 200pg(由GE Health CareBioscience提供，CV＝120mL)，并以1.2mL/分钟的流速洗脱蛋白。该操作确证2S，4R-莽那亭形成活性位于分子量估计为约85kDa的位置处。

(5)阴离子交换层析

合并了其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分，并将所得溶液上样于阴离子交换层析柱Mono Q 5/5(由Pharmacia(GE Healthcare Bioscience)提供，CV＝1mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以1mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱吸收的蛋白。在每个级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并在对应于约400mMNaCl的级分中检测出2S，4R-莽那亭形成活性。

(7)SDS-PAGE

对获得的级分进行SDS-PAGE，并在43kDa附近检测出源自活性级分的条带。将该条带作为形成2S，4R-莽那亭的氨基转移酶的候选而进行N端氨基酸序列的分析。

实施例38：源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶的N端氨基酸序列的确定

对实施例37中获得的纯化的酶溶液进行N端氨基酸序列分析，并获得了N端氨基酸序列MSXIAQXILDQ(SEQ ID NO：112)。该N端氨基酸序列与源自纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)ATCC6940的天冬氨酸氨基转移酶(ZP_03935516)和源自产氨棒杆菌DSM20306的天冬氨酸氨基转移酶(ZP_06838515)显示高同源性。

实施例39：源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶基因的克隆

将产氨棒杆菌AJ1444的微生物细胞以与实施例37中相同的方式培养。通过离心从所得的培养基收集微生物细胞，并从其提取基因组DNA。

用获得的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有氨基转移酶基因的DNA片段。参照产氨棒杆菌DSM20306的基因组DNA序列由氨基转移酶基因下游50bp的DNA序列设计的引物Co-d50-r(5’-cttccttggaacaagtcgaggaagac-3’：SEQ ID NO：56)，和参照在源自纹带棒杆菌ATCC6940的天冬氨酸氨基转移酶(ZP_03935516)和源自产氨棒杆菌DSM20306的天冬氨酸氨基转移酶(ZP_06838515)之间具有高同源性的部分序列设计的引物Co-800-f(5’-gctatcgcacaattccaccgcacctt-3’：SEQ ID NO：57)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

确定了约400bp的扩增的DNA片段的核苷酸序列，并基于该核苷酸序列设计引物Co-890-r(5’-acatcgttaagcaagcgaaccaccag-3’：SEQ ID NO：58)和引物Co-1060-r (5’-gaaagacaagcgaatgtggtgctcg-3’：SEQ ID NO：59。使用LAPCR体外Cloning Kit(Takara)进行PCR。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

结果，确定了含有1134bp的ORF(SEQ ID NO：60和61)的核苷酸序列，其与源自产氨棒杆菌DSM20306的天冬氨酸氨基转移酶基因(HMPREF0281_02480)具有高同源性。其DNA序列的同源性为76％，而其氨基酸序列的同源性为82％。

该氨基酸序列与实施例38中获得的N端氨基酸序列一致。因此，认为可获得具有2S，4R-莽那亭形成活性的氨基转移酶基因。

实施例40：在大肠杆菌中表达源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶

(1)用于源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶的表达载体的构建

用产氨棒杆菌AJ1444的基因组DNA作为模板通过PCR扩增含有源自产氨棒杆菌AJ1444的氨基转移酶基因的DNA片段。使用了引物1444AT-Nde-f(5’-ggaattccatATGAGCCACATCGCTCAACGCATCC-3’：SEQ ID NO：62)和引物1444-xho-r (5’-actccgctcgagGGACTTTTCGAAGTATTGGCGAATG-3’：SEQID NO：63)。在下述条件下使用KOD-plus-ver.2(Toyobo)进行PCR。

用限制性酶NdeI和XhoI处理所得的DNA片段，并将其连接于同样用NdeI和XhoI处理的pET-22b(Novagen)。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性大肠杆菌菌落选择目标质粒，并将该质粒命名为pET-22-1444AT-His。在该质粒中，表达源自产氨棒杆菌AJ1444、具有添加至C-末端的His标记的氨基转移酶(1444AT-His)。

(2)从表达1444AT-His的大肠杆菌菌株纯化1444AT-His

将构建的表达质粒pET-22-1444AT-His导入大肠杆菌BL21(DE3)。将一环转化体接种于500mL坂口烧瓶中的160mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB Medium(Novagen)，并将所述坂口烧瓶在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从约1000mL培养基收集微生物细胞，用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗涤并悬于其中，并在4℃声处理30分钟。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

将获得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑平衡的His标记蛋白纯化柱His TALON Superflow 5mL Centrifuge(Clontech)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以5mL/分钟的流速用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗脱吸收的蛋白。

合并并使用Amicon Ultra-1530k(Millipore)浓缩获得的级分。用20mMTris-HCl(pH 7.6)稀释所述浓缩溶液，并将其上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)平衡的阴离子交换层析柱HiLoad 16/10Q Sepharose HP(由GE Health CareBioscience提供，CV＝20mL)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后通过以3mL/分钟的流速将NaCl的浓度从0mM线性改变至500mM来洗脱未吸收的蛋白。

在每个洗脱的级分中测量2S，4R-莽那亭形成活性，并合并并使用AmiconUltra-1530k(Millipore)浓缩其中检测出2S，4R-莽那亭形成活性的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液以用作1444AT-His溶液。

实施例41：测量AJ1444LAT对于多种酮酸的比活性的结果

(1)通过比色法测量对于L-Asp/α-KG、L-Asp/PA、L-Asp/(±)MHOG、L-Glu/PA和L-Glu/(±)-MHOG的活性

测量了AJ1444LAT对于多种底物的活性。使用100mM L-Asp或L-Glu作为转氨反应的氨基供体底物通过比色法测量对于10mM酮酸的比活性。

对于L-Asp/α-KG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mMα-KG-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mLMDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自猪心的苹果酸脱氢酶(Sigma)作为MDH。对于L-Asp/α-KG的活性示于表17中氨基转移酶活性的“α-KG”栏。

对于L-Asp/PA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM PA-2Na，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH和2U/mL MDH(同上)中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。对于L-Asp/PA的活性示于表17中氨基转移酶活性的“PA”栏。

对于L-Asp/(±)-MHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-MHOG，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.25mM NADH，2U/mLMDH(同上)和10U/mL LDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自肠膜明串珠菌的D-乳酸脱氢酶(Oriental Yeast)作为LDH。添加LDH以去除(±)-MHOG中的痕量污染的PA。对于L-Asp/(±)-MHOG的活性示于表17中氨基转移酶活性的“(±)-MHOG”栏。

对于L-Glu/PA的活性：在25℃在100mM L-Glu-Na，10mM PA，50μMPLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NH4Cl，0.25mM NADH和10U/mLGDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。使用来自猪肝的L-谷氨酸脱氢酶(Sigma)作为GDH。对于L-Glu/PA的活性示于表17中氨基转移酶活性的“PA”栏。

对于L-Glu/(±)-MHOG的活性：在25℃在100mM L-Glu-Na，10mM(±)-MHOG，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NH₄Cl，0.25mMNADH和10U/mL GDH中测量。由340nm处吸光度的减少来计算活性。对于L-Glu/(±)-MHOG的活性示于表17中氨基转移酶活性的“(±)-MHOG”栏。

(2)对于L-Asp/4R-IHOG、L-Asp/(±)-IHOG、L-Asp/IPA、L-Glu/4R-IHOG和L-Glu/IPA的活性的测量

分别测量了从4R-IHOG形成2S，4R-莽那亭的活性，从(±)-IHOG形成2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭的活性，即目标活性，和从IPA形成L-Trp作为副产物的活性。使用100mM L-Asp或L-Glu作为转氨反应的氨基供体底物进行了对10mM酮酸的转氨反应。通过UPLC对形成的氨基酸的量进行定量以计算比活性。

对于L-Asp/4R-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表17中氨基转移酶活性的“4R-IHOG”栏。

对于L-Asp/(±)-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM(±)-IHOG，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)中测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/4R-IHOG的活性显示于表17中氨基转移酶活性的“(±)-IHOG”栏。

对于L-Asp/IPA的活性：在25℃在100mM L-Asp-Na-1aq，10mM IPA，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)(在制备反应溶液之后用1N NaOH将pH调整至8.0)测量。通过UPLC分析对形成的Trp进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Asp/IPA的活性显示于表17中氨基转移酶活性的“IPA”栏。

对于L-Glu/4R-IHOG的活性：在25℃在100mM L-Glu-Na，10mM4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)测量。通过UPLC分析对形成的2S，4R-莽那亭和2S，4S-莽那亭进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Glu/4R-IHOG的活性显示于表17中氨基转移酶活性的“4R-IHOG”栏。

对于L-Glu/IPA的活性：在25℃在100mM L-Glu-Na，10mM IPA，50μMPLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)(在制备反应溶液之后用1N NaOH将pH调整至8.0)测量。通过UPLC分析对形成的Trp进行定量。使用200mM柠檬酸钠溶液(pH 4.5)作为终止反应的溶液。对于L-Glu/IPA的活性显示于表17中氨基转移酶活性的“IPA”栏。

表16

(3)测量AJ1444LAT对于多种酮酸的比活性的结果

当使用1444-AT-His和使用L-Asp作为氨基供体时，测量对于10mM酮酸的比活性的结果示于表17。

表17：AJ1444LAT对于多种酮酸的比活性

实施例42：用于使用pET-22-1444AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)合成2S，4R-莽那亭的反应

将一环实施例40中制备的pET-22-1444AT-His/大肠杆菌BL21(DE3)的微生物细胞接种于试管中的3mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight ExpressInstant TB Medium(Novagen)，并将所述试管在37℃振荡16小时。在培养完成之后，通过离心从1mL培养基收集微生物细胞，并悬于1mL的BugBusterMaster Mix(Novagen)。将所得的悬液在室温静置15分钟以裂解微生物细胞。通过离心去除微生物细胞碎片，并将所得的上清用作可溶级分。

使用获得的可溶级分进行用于从4R-IHOG合成2S，4R-莽那亭的反应。向0.1mL反应溶液[100mM L-Asp-Na-1aq，10mM 4R-IHOG(以痕量含有4S-IHOG)，50μM PLP和100mM Tris-HCl(pH 8.0)]，添加0.05mL上述可溶级分，并在25℃使所述混合物反应一小时。在反应完成之后，形成的2S，4R-莽那亭的量定量为0.13mM。通过UPLC分析定量2S，4R-莽那亭。分析的条件与实施例29中相同。

实施例43：用于从20mM L-Trp合成2S，4R-莽那亭的一锅法反应(AJ3976LAT，AJ12469LAT，AJ1444LAT)

在下述条件下使用纯化的3976AT-His、12469AT-His和1444AT-His进行了12小时的反应。使用试管以1mL的体积进行反应。对反应溶液适当地进行取样。用TE缓冲液稀释样品，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器(centrifugal filter)10kDa(Millipore)进行超滤，并分析所得的滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：20mM L-Trp，40mM PA-Na，160mM L-Asp-Na-1aq，1mMMgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，20mM KPB(pH 7.0)，20％Ps_aad培养液，30U/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，2U/mL纯化的LAT酶(对10mM 4R-IHOG)，和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃在120rpm。

用于制备进行反应的酶的方法如下所示。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例19中所述的方法制备

AJ3976LAT、AJ12469LAT和AJ1444LAT：根据实施例28、34和40中所述的方法制备。

OAADCase：使用来自假单胞菌属菌种的草酰乙酸脱羧酶(Sigma)。使用生产商所述的值作为酶量(U)。

SOD：使用来自猪肝的超氧化物歧化酶(Sigma)。使用生产商所述的值作为酶量(U)。

作为一锅法反应的结果，在使用AJ3976LAT、AJ12469LAT和AJ1444LAT进行4小时之后，分别形成了12mM、11mM和13mM的2S，4R-莽那亭，且其从L-Trp的收率分别为58％、53％和64％。

实施例44：从50mM Trp(AJ3976，80mL规模)合成2S，4R-莽那亭的一锅法反应

在下述条件下使用纯化的3976AT-HIs进行12小时的反应。所述反应使用250mL体积的微型釜以80mL的体积进行。对反应溶液进行适当的取样，将样品用TE缓冲液稀释，然后使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器10kDa(Millipore)对其进行超滤，并分析所得的滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：50mM L-Trp，50mM PA-Na，200mM L-Asp-Na-1aq，1mMMgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl(pH 7.6)，20mM KPB(pH 7.6)，0.0025％GD113K，pH＜7.6(1M H₂SO₄)，20％Ps_aad培养液，30U/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，2U/mL纯化的LAT酶(对10mM4R-IHOG)和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃，350-400rpm，8mL/分钟(1/10vvm)通气。

制备用于反应的酶的方法如下所述。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例19中所述的方法制备

AJ3976LAT：根据实施例28中所述的方法制备。

作为一锅法反应的结果，在8小时之后，确证累积了28mM的2S，4R-莽那亭，且在校正了溶液量之后，计算出从L-Trp的收率为56％。

实施例45：在大肠杆菌中表达计算机模拟(in silico)选择的氨基转移酶

(1)用于计算机模拟选择的氨基转移酶的表达质粒的构建

对通过向计算机模拟选择的氨基转移酶的遗传序列的5’端和3’端赋予NdeI识别序列和XhoI识别序列而获得的DNA序列进行由GenScript提供的Optimum Gene Codon Optimization Analysis而获得表达效率已在大肠杆菌中优化的合成DNA。氨基转移酶的类型如下所述。

源自Deinococcus Geothermalis DSM 11300(Dge，ABF45244)的推定的氨基转移酶(SEQ ID NO：64和65)，源自谷氨酸棒杆菌R(Cgl，BAF53276)的假设蛋白(SEQ ID NO：66和67)，Lysn，源自嗜热栖热菌HB27(TtHB，AAS80391)的α-氨基己二酸氨基转移酶(SEQ ID NO：68和69)，源自海栖热袍菌(Tma1，AAD36207)的氨基转移酶(推定)(SEQ ID NO：70和71)，源自掘越氏火球菌Ot3(PhoH，1X0M)的人犬尿素氨基转移酶II同源物(SEQ ID NO：72和73)，源自Phormidium Lapideum(Pla，BAB86290)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ IDNO：74和75)，源自嗜热栖热菌(Tth，BAD69869)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQID NO：76和77)，源自掘越氏火球菌Ot3(PhoA，1DJU)的芳族氨基转移酶(SEQ ID NO：78和79)，源自詹氏甲烷球菌(Mja，AAB98679)的Mj0684(SEQID NO：80和81)，源自海栖热袍菌(Tma2，AAD36764)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：82和83)，源自酿酒酵母(Sce，CAY81265)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：84和85)，源自直肠真杆菌(Ere，ACR74350)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：86和87)，源自短小芽孢杆菌SAFR-032(Bpu，ABV62783)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：88和89)，源自解纤维芽孢杆菌DSM 2522(Bce，ADU30616)的推定的转录调节物(GntR家族)(SEQ ID NO：90和91)，源自芽孢杆菌属菌种(菌株YM-2)(Bsp，AAA22250)的天冬氨酸氨基转移酶aspC(SEQ ID NO：92和93)，源自苜蓿中华根瘤菌1021(SmeB，CAC47870)的天冬氨酸氨基转移酶aatB(SEQ ID NO：94和95)，源自热自养甲烷嗜热杆菌菌株Delta H(Mth，AAB85907)的支链氨基酸氨基转移酶(SEQID NO：96和97)，源自嗜酸乳杆菌(Lba，AAV43507)的天冬氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：98和99)，源自苜蓿中华根瘤菌1021(SmeA，CAC46904)的天冬氨酸氨基转移酶aatA(SEQ ID NO：100和101)，源自掘越氏火球菌OT3(PhoS，BAA30413)的假设的丝氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO：102和103)，源自腾冲热厌氧杆菌MB4(Tte，AAM24436)的PLP依存性氨基转移酶(SEQ IDNO：104和105)，源自解纤维梭菌H10(Cce，ACL75101)的推定的转录调节物(GntR家族)(SEQ ID NO：106和107)，源自红平红球菌PR4(Rer，BAH31070)的天冬氨酸氨基转移酶AspT(SEQ ID NO：108和109)，以及源自降解噬糖菌2-40(Sde，ABD82545)的转录调节物(SEQ ID NO：110和111)。

表18：氨基酸序列百分比同一性的比较

用限制性酶NdeI和XhoI处理合成的DNA，并连接于同样用NdeI和XhoI处理的pET-22b(Novagen)。用该连接溶液转化大肠杆菌JM109。从氨苄青霉素抗性菌落选择目标质粒，并将这些质粒命名为pET-22-AT-His。在这些质粒中，表达了具有His标记添加至C端(AT-His)的氨基转移酶。

(2)从表达AT-His的大肠杆菌菌株纯化AT-His

将每个构建的pET-22-AT-His导入大肠杆菌BL21(DE3)，并将一环转化体接种于500mL坂口烧瓶中100mL含有100mg/L氨苄青霉素的OvernightExpress Instant TB Medium (Novagen)，并将坂口烧瓶振荡15小时。对于Lba，振荡在25℃进行，对于Dge，Pla，Tth，Tma2，Sce，Ere，Bpu，Bce，Bsp，SmeA，PhoS，Rer和Sde在30℃进行，对于Cgl，TtHB，PhoH，PhoA，SmeB，Tte和Cce在37℃进行，而对于Tma1，Mja和Mth在42℃进行。在培养完成之后，通过离心从培养基收集微生物细胞，用Tris-HCl(pH 7.6)，300mMNaCl和10mM咪唑洗涤并悬于其中，并进行声处理。通过离心从经声处理的细胞悬液去除微生物细胞碎片，并使用所得的上清作为可溶级分。

将获得的可溶级分上样于用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑平衡的His标记蛋白纯化柱His TALON Superflow 5mL Centrifuge(Clontech)以将蛋白吸收于载体。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和10mM咪唑洗去未吸收于载体的蛋白(未吸收蛋白)。然后使用20mMTris-HCl(pH 7.6)，300mM NaCl和150mM咪唑以5mL/分钟的流速洗脱吸收的蛋白。合并并使用Amicon Ultra-1510k(Millipore)浓缩获得的级分。用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释浓缩的溶液以用作LAT溶液。如果需要，通过增加培养的培养基量和连接的His TALON柱的数目进行进一步纯化。

实施例46：用于从20mM L-Trp合成2S，4R-莽那亭的一锅法反应

在下述条件下使用纯化的多种AT-His将每个反应进行15小时。所述反应使用试管以1mL的体积进行。在反应完成之后，每个样品用TE缓冲液稀释，使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器10kDa(Millipore)进行超滤，并分析所得的滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：20mM L-Trp，40mM PA-Na，160mM L-Asp-Na-1aq，1mMMgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，20mM KPB(pH 7.0)，20％Ps_aad培养液，30U/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，1mg/mL纯化的LAT酶和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃，120rpm。

用于制备进行反应的酶的方法如下所示。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例19中所述的方法制备

多种LAT：根据实施例45中所述的方法制备。

一锅法反应的结果示于表19，使用Tth，Bpu，SmeA和Sde分别形成了11mM，16mM，6mM和8mM的2S，4R-莽那亭，且其从L-Trp的收率分别为55％，78％，28％和42％。

表19：在使用20mM Trp作为底物的一锅法反应中2S，4R-莽那亭的收率

实施例47：用于从20mM L-Trp合成2S，4R-莽那亭的一锅法反应(Tth，Bpu，SmeA和Sde)

在下述条件下使用纯化的多种AT-His进行反应15小时。所述反应使用试管以1mL的体积进行。在反应完成之后，每个样品用TE缓冲液稀释，使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器10kDa(Millipore)进行超滤，并分析所得的滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：20mM L-Trp，40mM PA-Na，160mM L-Asp-Na-1aq，1mMMgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，20mM KPB(pH 7.6)，20％Ps_aad培养液，30U/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，3mg/mL纯化的LAT酶(12mg/mL的Tth，1mg/mL的Bpu)和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃，在120rpm。

用于制备进行反应的酶的方法如下所示。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例19中所述的方法制备

多种LAT：根据实施例45中所述的方法制备。

一锅法反应的结果示于表20，使用Tth，Bpu，SmeA和Sde分别形成了18mM，17mM，11mM和12mM的2S，4R-莽那亭，且其从L-Trp的收率分别为92％，87％，54％和61％。

表20：在使用20mM Trp作为底物的一锅法反应中2S，4R-莽那亭的收率

缩写	从Trp的收率(％)
		Tth	92
Bpu	87
		SmeA	54
Sde	61

实施例48：用于从100mM L-Trp合成2S，4R-莽那亭的一锅法反应(Tth，Bpu，SmeA和Sde)

在下述条件下使用纯化的多种AT-His，Tth，Bpu，SmeA和Sde进行反应18小时。所述反应使用试管以1mL的体积进行。在反应完成之后，每个样品用TE缓冲液稀释，使用Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器10kDa(Millipore)进行超滤，并分析所得的滤过物。使用HPLC和毛细管电泳进行分析。

反应条件：100mM L-Trp，50mM PA-Na，300mM L-Asp-Na-1aq，1mMMgCl₂，50μM PLP，100mM Tris-HCl，20mM KPB(pH 7.6)，40％Ps_aad培养液，60U/mL纯化的SpAld酶，10U/mL商业上可获得的OAADCase酶，3mg/mL纯化的LAT酶(对于Tth为12mg/mL)和200U/mL商业上可获得的SOD酶，在25℃，在150rpm。

制备用于反应的酶的方法如下所述。

Ps_aad培养液：根据实施例17中所述的方法制备。

纯化的SpAld酶：根据实施例19中所述的方法制备

多种LAT：根据实施例45中所述的方法制备。

一锅法反应的结果示于表21，使用Tth，Bpu，SmeA和Sde分别形成了72mM，46mM，6.4mM和20mM的2S，4R-莽那亭，且其从L-Trp的收率分别为72％，46％，6.4％和20％。

表21：在使用100mM Trp作为底物的一锅法反应中2S，4R-莽那亭的收率

缩写	从Trp的收率(％)
		Tth	72
Bpu	46
		SmeA	6.4
Sde	20

(关于微生物的信息)

本文中所述的由保藏号指明的微生物可从特定保藏机构获得。表22中所述的微生物在下述日期保藏于独立行政法人工业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市1丁目1番地1中央第6)，并赋予下述保藏号。如表22中所述，尽管之前赋予了不同的名称，由于重新分类的结果，这些微生物目前以下述方式归类。

表22.

此外，尽管之前赋予了不同的名称，由于重新分类的结果，表23中所述的微生物目前以下述方式归类。细菌菌株寡养单胞菌属菌种AJ13127与由保藏号FERM-BP 5568指明的已知的细菌菌株相同。

表23.

工业实用性

如上所述，本发明的方法用于产生可用作增甜剂的莽那亭。

序列表自由文本

SEQ ID NO：1：源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：2：源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：3：源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因(核苷酸编号231-1538)的核苷酸序列及其上游和下游区

SEQ ID NO：4：源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶的片段的氨基酸序列

SEQ ID NO：5：源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶的片段的氨基酸序列

SEQ ID NO：6：用于扩增含有源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(Bp-u200-f)

SEQ ID NO：7：用于扩增含有源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(Bp-d200-r)

SEQ ID NO：8：用于扩增含有源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(1616AT-Nde-f)

SEQ ID NO：9：用于扩增含有源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(1616-xho-r)

SEQ ID NO：10：用于转化见于源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因、由NdeI识别的DNA序列的正向引物(1616-delNde-f)

SEQ ID NO：11：用于转化见于源自高地芽孢杆菌的氨基转移酶基因、由NdeI识别的DNA序列的反向引物(1616-delNde-r)

SEQ ID NO：12：用于扩增含有SpAld基因的DNA片段的正向引物(SpAld-f-NdeI)

SEQ ID NO：13：用于扩增含有SpAld基因的DNA片段的反向引物(SpAld-r-HindIII)

SEQ ID NO：14：用于转化SpAld基因中的罕见密码子6L的正向引物(6L-f)

SEQ ID NO：15：用于转化SpAld基因中的罕见密码子6L的反向引物(6L-r)

SEQ ID NO：16：用于转化SpAld基因中的罕见密码子13L的正向引物(13L-f)

SEQ ID NO：17：用于转化SpAld基因中的罕见密码子13L的反向引物(13L-r)

SEQ ID NO：18：用于转化SpAld基因中的罕见密码子18P的正向引物(18P-f)

SEQ ID NO：19：用于转化SpAld基因中的罕见密码子18P的反向引物(18P-r)

SEQ ID NO：20：用于转化SpAld基因中的罕见密码子38P的正向引物(38P-f)

SEQ ID NO：21：用于转化SpAld基因中的罕见密码子38P的反向引物(38P-r)

SEQ ID NO：22：用于转化SpAld基因中的罕见密码子50P的正向引物(50P-f)

SEQ ID NO：23：用于转化SpAld基因中的罕见密码子50P的反向引物(50P-r)

SEQ ID NO：24：用于SpAld基因中的转化罕见密码子77P、81P和84R的正向引物(77P-81P-84R-f)

SEQ ID NO：25：用于转化SpAld基因中的罕见密码子77P、81P和84R的反向引物(77P-81P-84R-r)

SEQ ID NO：26：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体K39R的正向引物(K39R_FW)

SEQ ID NO：27：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体K39R的反向引物(K39R_RV)

SEQ ID NO：28：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体S258G的正向引物(S258G_FW)

SEQ ID NO：29：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体S258G的反向引物(S258G_RV)

SEQ ID NO：30：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体T288G的正向引物(T288G_FW)

SEQ ID NO：31：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体T288G的反向引物(T288G_RV)

SEQ ID NO：32：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体I289A的正向引物(I289A_FW)

SEQ ID NO：33：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体I289A的反向引物(I289A_RV)

SEQ ID NO：34：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体Q287E/T288G的正向引物(Q287E/T288G_FW)

SEQ ID NO：35：用于制备源自高地芽孢杆菌AJ1616的氨基转移酶突变体Q287E/T288G的反向引物(Q287E/T288G_RV)

SEQ ID NO：36：用于制备供破坏aspC基因的DNA片段的引物(aspC-L1)

SEQ ID NO：37：用于制备供破坏aspC基因的DNA片段的引物(aspC-R1)

SEQ ID NO：38：用于确证aatL-cat-attR在aspC基因区中插入的引物(aspC-up)

SEQ ID NO：39：用于确证aatL-cat-attR在aspC基因区中插入的引物(attL-1)

SEQ ID NO：40：用于确证aatL-cat-attR在aspC基因区中插入的引物(aspC-down)

SEQ ID NO：41：用于确证aatL-cat-attR在aspC基因区中插入的引物(attR-1)

SEQ ID NO：42：源自恶臭假单胞菌的草酰乙酸脱羧酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：43：源自恶臭假单胞菌的草酰乙酸脱羧酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：44：源自放射根瘤菌的氨基转移酶的片段的氨基酸序列

SEQ ID NO：45：基于来自根癌土壤杆菌菌株C58的基因组DNA而设计的正向引物(Ag-u100-f)

SEQ ID NO：46：基于来自根癌土壤杆菌菌株C58的基因组DNA而设计的反向引物(Ag-d100-r)

SEQ ID NO：47：源自放射根瘤菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：48：源自放射根瘤菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：49：用于扩增含有源自放射根瘤菌的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(3976AT-Nde-f)

SEQ ID NO：50：用于扩增含有源自放射根瘤菌的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(3976-xho-r)

SEQ ID NO：51：源自根瘤菌属菌种的氨基转移酶的片段的氨基酸序列

SEQ ID NO：52：源自根瘤菌属菌种的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：53：源自根瘤菌属菌种的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：54：用于扩增含有源自根瘤菌属菌种的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(12469AT-Nde-f)

SEQ ID NO：55：用于扩增含有源自根瘤菌属菌种的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(12469-xho-r)

SEQ ID NO：56：基于来自产氨棒杆菌DSM20306的基因组DNA序列而设计的正向引物(Co-d50-r)

SEQ ID NO：57：基于对应于来自纹带棒杆菌ATCC6940(ZP_03935516)和来自产氨棒杆菌DSM20306的天冬氨酸氨基转移酶的基因组DNA序列之间的同源序列而设计的反向引物

SEQ ID NO：58：用于扩增含有源自产氨棒杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(Co-890-r)

SEQ ID NO：59：用于扩增含有源自产氨棒杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(Co-1060-r)

SEQ ID NO：60：源自产氨棒杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：61：源自产氨棒杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：62：用于扩增含有源自产氨棒杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的正向引物(1444AT-Nde-f)

SEQ ID NO：63：用于扩增含有源自产氨棒杆菌的氨基转移酶基因的DNA片段的反向引物(1444-xho-r)

SEQ ID NO：64：源自Deinococcus geothermalis的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：65：源自Deinococcus geothermalis的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：66：源自谷氨酸棒杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：67：源自谷氨酸棒杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：68：源自嗜热栖热菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：69：源自嗜热栖热菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：70：源自海栖热袍菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：71：源自海栖热袍菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：72：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：73：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：74：源自Phormidium lapideum的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：75：源自Phormidium lapideum的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：76：源自嗜热栖热菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：77：源自嗜热栖热菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：78：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：79：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：80：源自詹氏甲烷球菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：81：源自詹氏甲烷球菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：82：源自海栖热袍菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：83：源自海栖热袍菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：84：源自酿酒酵母的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：85：源自酿酒酵母的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：86：源自直肠真杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：87：源自直肠真杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：88：源自短小芽孢杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：89：源自短小芽孢杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：90：源自解纤维芽孢杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：91：源自解纤维芽孢杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：92：源自芽孢杆菌属菌种的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：93：源自芽孢杆菌属菌种的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：94：源自苜蓿中华根瘤菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：95：源自苜蓿中华根瘤菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：96：源自热自养甲烷嗜热杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：97：源自热自养甲烷嗜热杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：98：源自嗜酸乳杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：99：源自嗜酸乳杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：100：源自苜蓿中华根瘤菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：101：源自苜蓿中华根瘤菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：102：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：103：源自掘越氏火球菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：104：源自腾冲热厌氧杆菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：105：源自腾冲热厌氧杆菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：106：源自解纤维梭菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：107：源自解纤维梭菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：108：源自红平红球菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：109：源自红平红球菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：110：源自降解噬糖菌的氨基转移酶基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：111：源自降解噬糖菌的氨基转移酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：112：源自产氨棒杆菌的氨基转移酶的片段的氨基酸序列

Claims

1.一种用于产生2S，4R-莽那亭(2S，4R-Monatin)或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。

2.权利要求1的产生方法，进一步包括将酮酸与脱羧酶相接触而降解所述酮酸，其中所述酮酸是由于L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-氨基酸形成的。

3.权利要求1的产生方法，其中所述L-氨基酸是L-天冬氨酸。

4.权利要求3的产生方法，进一步包括将草酰乙酸与草酰乙酸脱羧酶相接触而不可逆地形成丙酮酸，其中所述草酰乙酸是通过L-氨基酸氨基转移酶的作用从L-天冬氨酸形成的。

5.权利要求1的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒杆菌属(Corynebacterium)、洛德酵母属(Lodderomyces)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、迪茨氏菌属(Dietzia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、Carnimonas属、西洋蓍霉属(Yarrowia)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、席蓝细菌属(Phormidium)、火球菌属(pyrococcus)、红球菌属(Rhodococcus)、酵母属(Saccharomyces)、噬糖菌属(Saccharophagus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)或栖热菌属(Thermus)的微生物。

6.权利要求5的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶来源于属于节杆菌属菌种(Arthrobacter sp.)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解纤维芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、挪威假丝酵母(Candida norvegensis)、平常假丝酵母(Candidainconspicua)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、长孢洛德酵母(Lodderomyces elongisporus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、微杆菌属菌种(Microbacterium sp.)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronocllolis)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、根瘤菌属菌种(Rhizobium sp.)、寡养单胞菌属菌种(Stenotrophomonas sp.)、海洋迪茨氏菌(Dietzia maris)、Ochrobactrumpseudogrignonense、缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)、伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp.)、Carnimonas sp.、解脂西洋蓍霉(Yarrowialypolytica)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、Deinococcus geothermalis、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、Phormidiumlapideum、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、降解噬糖菌(Saccharophagus degradans)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的微生物。

7.权利要求1的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶由与以EQ IDNO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：109或SEQ IDNO：111表示的氨基酸序列显示90％或更高同一性的氨基酸序列组成。

8.权利要求7的产生方法，其中所述L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，所述氨基酸残基选自下组：位置39、位置109、位置128、位置150、位置258、位置287、位置288、位置289、位置303、位置358和位置431处的氨基酸残基。

9.权利要求8的产生方法，其中所述一种或多种氨基酸残基的突变选自下组：

i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；

ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；

iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；

iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；

v)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；

vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；

vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；

viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；

ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；

x)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和

xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。

10.权利要求1的产生方法，其中使用表达L-氨基酸氨基转移酶的转化体将4R-IHOG与L-氨基酸氨基转移酶相接触。

11.权利要求1的产生方法，进一步包括使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合而形成4R-IHOG。

12.权利要求11的产生方法，通过使吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸与醛缩酶相接触而将吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸缩合。

13.权利要求11的产生方法，其中至少部分用于形成4R-IHOG的丙酮酸是来自由于草酰乙酸脱羧酶的作用而从草酰乙酸形成的丙酮酸。

14.权利要求11的产生方法，进一步包括使色氨酸脱氨基而形成吲哚-3-丙酮酸。

15.权利要求14的产生方法，其中所述色氨酸通过将色氨酸与脱氨酶相接触来脱氨基。

16.权利要求11或14的产生方法，其中2S，4R-莽那亭或其盐的产生是在一个反应器中进行的。

17.一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I)和(II)：

(I)进行权利要求1的方法而形成2S，4R-莽那亭；和

(II)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。

18.权利要求17的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。

19.权利要求17的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。

20.一种L-氨基酸氨基转移酶，其为选自(A)-(D)的蛋白：

(D)蛋白，其由在以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：53或SEQID NO：61表示的氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的突变，并具有L-氨基酸氨基转移酶活性的氨基酸序列组成，所述突变选自下组：氨基酸残基的缺失、取代、添加和插入。

21.权利要求20的L-氨基酸氨基转移酶，其中L-氨基酸氨基转移酶在以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸残基的突变，其中氨基酸残基选自下组：位置39，位置109，位置128，位置150，位置258，位置287，位置288，位置289，位置303，位置358和位置431处的氨基酸残基。

22.权利要求21的L-氨基酸氨基转移酶，其中所述一个或多个氨基酸残基的突变选自下组：

i)用精氨酸取代位置39处的赖氨酸；

ii)用甘氨酸取代位置258处的丝氨酸；

iii)用谷氨酸取代位置287处的谷氨酰胺；

iv)用甘氨酸取代位置288处的苏氨酸；

v)用丙氨酸取代位置289处的异亮氨酸；

vi)用甘氨酸取代位置109处的天冬氨酸；

vii)用酪氨酸取代位置150处的组氨酸；

viii)用亮氨酸取代位置303处的苯丙氨酸；

ix)用酪氨酸取代位置358处的天冬氨酸；

x)用苏氨酸取代位置431处的丝氨酸；和

xi)用甘氨酸取代位置128处的谷氨酸。

23.一种多核苷酸，选自下组(a)-(e)：

(e)多核苷酸，其编码权利要求20的L-氨基酸氨基转移酶。

24.一种表达载体，其包含权利要求23的多核苷酸。

25.一种转化体，其导入有权利要求24的表达载体。

26.一种用于产生L-氨基转移酶的方法，包括在培养基中培养权利要求25的转化体而获得所述L-氨基酸氨基转移酶。

27.一种产生2S，4R-莽那亭或其盐的方法，包括在L-氨基酸的存在下将4R-IHOG与权利要求20的L-氨基酸氨基转移酶相接触而形成2S，4R-莽那亭。

28.一种用于产生2R，4R-莽那亭或其盐的方法，包括下述(I’)和(II’)：

(I’)执行权利要求27的方法而形成2S，4R-莽那亭；和

(II’)异构化2S，4R-莽那亭而形成2R，4R-莽那亭。

29.权利要求28的产生方法，其中2S，4R-莽那亭在芳族醛的存在下异构化。

30.权利要求28的产生方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。