KR100673283B1 - 글루탐산 유도체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

감미제 등의 성분으로서 기대되는 모나틴 등의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 효율적으로 제조하는 방법이다.

화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 당해 반응을 실시한다.

화학식 1

화학식 2

글루탐산 유도체, 모나틴, 감미제, α-케토산, 효소

Description

글루탐산 유도체의 제조방법{Process for production of glutamic acid derivatives}

본 발명은, 효소반응을 이용한 글루탐산 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 출발원료로서 아미노산의 일종인 트립토판을 사용하여 감미제로서 유용한 모나틴(monatin)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

하기 화학식 6의 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-글루탐산(3-(1-아미노-1,3-디카복시-3-하이드록시-부탄-4-일)-인돌)(이하, 「모나틴」이라고 칭한다)은, 남아프리카의 관목 슈렐로치톰 이리시폴리어스(Schlerochitom ilicifolius)의 뿌리에 함유되는 아미노산의 일종이며, 수크로즈의 수백배의 감미를 가지고 있는 점에서, 특히 저칼로리 감미료로서 기대되는 화합물이다[참조: 일본공개특허공보 제(소) 64-25757호].

4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-글루탐산

상기 모나틴은, 2위치와 4위치에 부제탄소를 가지고 있으며, 모나틴의 천연형의 입체이성체는 (2S,4S) 배위이다. 그 외, 비천연형의 입체이성체의 존재에 관하여, 합성적으로 제조된 3종의 입체이성체의 존재가 확인되었다. 그리고, 천연형의 상기 모나틴뿐만 아니라, 그 밖의 입체이성체 모두가 각각 고배율의 감미 강도를 가지며, 이의 1종 또는 복수 혼합물 모두 감미제 또는 감미제 성분(감미료)으로서의 이용이 기대된다.

모나틴의 제조방법에 관해서는, 과거에 5가지 예가 보고되어 있다. 상세한 것은 하기 (1) 내지 (5)의 선행기술문헌에 기재한 바와 같다.

(1) 미국특허 제5994559호 명세서

(2) 테트라헤드론 레터즈(Tetrahedron Letters), 2001년, 42권, 39호, 6793 내지 6796 페이지

(3) 오가닉 레터즈(Organic Letters), 2000년, 2권, 19호, 2967 내지 2970 페이지

(4) 신세틱 커뮤니케이션(Synthetic Communication), 1994년, 24권, 22호, 3197 내지 3211 페이지

(5) 신세틱 커뮤니케이션(Synthetic Communication), 1993년, 23권, 18호, 2511 내지 2526 페이지

그러나, 어떠한 방법도 다단계의 공정을 필요로 하며, 공업적 생산 수준에서의 모나틴의 합성방법은 아직 확립되어 있지 않다. 따라서, 이와 같은 모나틴 및 이의 동족체를 포함하는 글루탐산 유도체를 공업적으로 제조하는데 있어서 간편하면서 고수율적인 제조방법의 개발이 요청된다.

따라서, 본 발명은, 감미료 등의 성분으로서 기대되는 모나틴 및 이의 동족체 등의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)의 효율적인 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

상기 문제를 감안하여 연구를 거듭한 결과, 본 발명자 등은 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 2의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 생성하는데 성공하고, 이러한 발견에 근거하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

위의 화학식 1 및 화학식 2에서,

R¹ 및 R²는 서로 독립하여 각각 수소원자, 탄소수 1 내지 8의 알킬 그룹, 탄소수 1 내지 8의 알콕시 그룹, 탄소수 2 내지 9의 카복시알킬 그룹, 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹, 복소환 함유 탄화수소 그룹 및 하이드록실 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타내며;

단, R¹ 및 R² 중의 하나가 수소원자를 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자, 메틸 그룹 또는 에틸 그룹을 나타내지 않으며; 또한, R¹ 및 R²중의 하나가 하이드록실 그룹을 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자 또는 메틸 그룹을 나타내지 않으며; R¹이 방향족환 또는 복소환을 포함하는 경우, 당해 방향족환 또는 복소환은 또한 할로겐원자, 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹으로 치환될 수 있다.

본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법에 의해, 화학식 7의 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(이하, IHOG)으로부터 효소반응을 이용하여, 화학식 6의 모나틴을 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다.

화학식 6

4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-글루탐산

또한, 본 발명자 등은, 본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법을 이용하여 아미노산의 일종인 트립토판을 출발원료로 하는 하기의 반응 ① 내지 ③으로 이루어지는 새로운 모나틴의 제조방법을 개발하였다. 하기의 반응 ① 내지 ③으로 이루어지는 모나틴의 제조방법에 있어서, 본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법은 반응 ③에 상당한다. 반응 ① 내지 ③으로 이루어지는 모나틴의 제조 경로를 반응식 8에 나타낸다.

반응 ①: 효소의 존재하에 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산을 합성

반응 ②: 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산) 사이의 알돌 축합에 의해 전구체 케토산(IHOG)을 합성

반응 ③: 효소의 존재하에 IHOG의 2위치를 아미노화하여 모나틴을 합성

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 2의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 생성하는 것을 특징으로 하는 글루탐산 유도체의 제조방법.

화학식 1

화학식 2

위의 화학식 1 및 화학식 2에서,

R¹ 및 R²는 서로 독립하여, 각각 수소원자, 탄소수 1 내지 8의 알킬 그룹, 탄소수 1 내지 8의 알콕시 그룹, 탄소수 2 내지 9의 카복시알킬 그룹, 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹, 복소환 함유 탄화수소 그룹 및 하이드록실 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타내며;

단, R¹ 및 R² 중의 하나가 수소원자를 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자, 메틸 그룹 또는 에틸 그룹을 나타내지 않으며; 또한, R¹ 및 R² 중의 하나가 하이드록실 그룹을 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자 또는 메틸 그룹을 나타내지 않으며; R¹이 방향족환 또는 복소환을 포함하는 경우, 당해 방향족환 또는 복소환은 또한 할로겐원자, 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹에 의해 치환될 수 있다.

[2] 상기 R¹은, 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹이고, 상기 R²는, 하이드록실 그룹인 것을 특징으로 하는, [1] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[3] 상기 효소는, 데하이드로게나제 또는 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[4] 상기 효소는, 트랜스아미나제이고, 또한, 반응계에 아미노 공여체로서, 1종 또는 복수종의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는, [3] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[5] 상기 아미노산은, 글루탐산, 아스파라긴산, 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 티로신, 발린, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 오르니틴, 세린, 시스테인, 히스티딘 및 리신으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, [4] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[6] 상기 효소는, L-아미노산 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, [3] 내지 [5] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[7] 상기 효소는, D-아미노산 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, [3] 내지 [5] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[8] 반응계에 L-아미노산을 D-아미노산으로 변환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는, [7] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[9] 상기 L-아미노산 트랜스아미나제는, 에어로모나스(Aeromonas) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 베이예린키아(Beijerinckia) 속, 에세리키아(Escherichia) 속, 프로테우스(Proteus) 속 및 모르가넬라(Morganella) 속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물에서 유래하는 효소인 것을 특징으로 하는, [6] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[10] 상기 미생물은, 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 베이예린키아 인디카(Beijerinckia indica), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri) 및 모 르가넬라 모르가니(Morganella morganii)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, [9] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[11] 상기 D-아미노산 트랜스아미나제는, 바실러스 속 또는 파에니바실러스 속에 속하는 미생물로 부터 유래하는 효소인 것을 특징으로 하는, [7] 또는 [8] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[12] 상기 미생물은, 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 풀비파시엔스(Bacillus pulvifaciens), 바실러스 마세란스(Bacillus macerans), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 파에니바실러스 라바에 아종 풀비파시엔스(Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens) 및 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, [11] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[13] 상기 효소는, D-아미노산 트랜스아미나제 유전자를 도입한 미생물에 의해 생산된 효소인 것을 특징으로 하는, [1] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[14] 상기 미생물은, 에세리키아 콜리인 것을 특징으로 하는, [13] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[15] 상기 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자는, 바실러스 스패리쿠스 또는 바실러스 마세란스로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, [13] 또는 [14] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[16] 적어도 하기 [I] 및 [II]의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법:

[I] 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 화학식 4의 치환 α-케토산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 4의 치환 α-케토산을 생성하는 공정;

[위의 화학식 3 및 화학식 4에서,

R은, 탄소수 2 내지 8의 알킬 그룹, 탄소수 1 내지 8의 알콕시 그룹, 탄소수 2 내지 9의 카복시알킬 그룹, 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹, 복소환 함유 탄화수소 그룹 및 하이드록실 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타내며;

R이 방향족환 또는 복소환을 포함하는 경우, 당해 방향족환 또는 복소환은, 추가로 할로겐원자, 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹에 의해 치환될 수 있다.]

[II] 화학식 4의 치환 α-케토산으로부터 화학식 5의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 5의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 생성하는 공정;

[위의 화학식 5에서,

R은, 화학식 3에서 정의한 바와 동일하다.]

[17] 상기 R은, 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹인 것을 특징으로 하는, [16] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[18] 상기 [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에르위니아(Erwinia) 속, 플라보박테리움(Flavobacterium) 속, 크산토모나스(Xanthomonas) 속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물에서 유래하는 것을 특징으로 하는, [16] 또는 [17] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[19] 상기 미생물은, 슈도모나스 태트롤렌스(Pseudomonas taetrolens), 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens), 슈도모나스 데스몰리티카(Pseudomonas desmolytica), 에르위니아 종(Erwinia sp.), 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum), 또는 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri)인 것을 특징으로 하는, [18] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[20] 상기 미생물은, 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683, 또는 슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791인 것을 특징으로 하는, [19] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법.

[21] 상기 [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 하기의 단백질중 하나인 것을 특징으로 하는, [16] 또는 [17] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법:

(a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질;

(c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질.

[22] 상기 [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 하기의 단백질중 하나를 암호화하는 유전자가 증폭 발현된 재조합체로부터 수득되는 효소인 것을 특징으로 하는, [16] 또는 [17] 기재의 글루탐산 유도체의 제조방법;

(a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질;

(c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

(d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질.

[23] 적어도 하기 [A] 내지 [C]의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법:

[A] 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성하는 공정;

[B] 인돌-3-피루브산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산을 생성하는 공정;

[C] 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산으로부터 모나틴을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 상기 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산을 반응시킴으로써, 모나틴을 생성하는 공정.

[24] 상기 [A]의 공정은, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성시켜 이를 반응액으로 하여, 당해 반응액에 탈기처리, 탈산소처리 및 최대 pH 2 이하로의 pH 조정 중 어느 하나를 실시하여 인돌-3-피루브산을 채취하는 공정인 것을 특징으로 하는 [23] 기재의 모나틴의 제조방법.

[25] 상기 탈기처리 또는 탈산소처리는, 상기 반응액 중에 포함되는 기체의 전부 또는 일부를 불활성 기체로 치환하는 방법인 것을 특징으로 하는, [24] 기재의 모나틴의 제조방법.

[26] 상기 불활성 기체는, 질소, 아르곤 및 헬륨중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, [25] 기재의 모나틴의 제조방법.

[27] 상기 pH 조정은, 상기 반응액에 대한 산 첨가에 의한 것이며, 당해 pH 조정의 결과 생성된 인돌-3-피루브산을 결정석출시켜, 이를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, [24] 내지 [26] 기재의 모나틴의 제조방법.

[28] 상기 산은, 황산, 염산, 질산 및 인산 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, [27] 기재의 모나틴의 제조방법.

[29] 상기 [A]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 아미노산 옥시다제 활성 및 카탈라제 활성을 갖는 미생물로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, [23] 내지 [28] 기재의 모나틴의 제조방법.

[30] 상기 [A]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 아크로모박터 (Achromobacter) 속, 프로테우스 속 및 모르가넬라 속 중 어느 하나로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, [23] 내지 [29] 기재의 모나틴의 제조방법.

[31] 상기 효소는, 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) AJ2425, 프로테우스 레트게리 IFO13501,및 모르가넬라 모르가니 IFO3168중 어느 하나로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, [30] 기재의 모나틴의 제조방법.

[32] 상기 [A]의 공정은, 아크로모박터 속, 프로테우스 속, 모르가넬라 속, 슈도모나스 속 및 네우로스포라(Neurospora) 속으로부터 선택되고 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물의 배양물을, 트립토판에 작용시켜 인돌-3-피루브산을 생성시켜 인돌-3-피루브산을 채취하는 공정인 것을 특징으로 하는, [23] 기재의 모나틴의 제조방법.

[33] 상기 [B]의 공정을, 당해 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는, [23] 내지 [32] 기재의 모나틴의 제조방법

[34] 상기 [B]의 공정을, 화학합성법에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는, [23] 내지 [32] 기재의 모나틴의 제조방법.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명자 등이 개발한 글루탐산 유도체의 제조방법은, 효소반응을 이용하여 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 것이며, 예를 들면 아미노 그룹 전이반응을 촉매하는 효소 또는 당해 효소를 생산하는 미생물을 작용시킴으로써 글루탐산 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

화학식 1

화학식 2

또한, 본 발명자 등이 개발한 트립토판을 출발원료로 하는 모나틴의 제조방법은, 하기의 반응 ① 내지 ③으로 이루어진다. 하기의 반응 ① 내지 ③으로 이루어지는 모나틴의 제조방법은, 반응 ③으로서 본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법을 이용한 것이다.

반응 ①: 효소의 존재하에, 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산을 합성

반응 ②: 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산) 사이의 알돌 축합에 의해 전구체 케토산(IHOG)을 합성

반응 ③: 효소의 존재하에, IHOG의 2위치를 아미노화하고 모나틴을 합성

반응식 8

반응 ① 내지 ③중, 반응 ① 및 반응 ③은 효소를 사용한 반응이지만, 반응 ②의 실시방법에 관해서는 특별히 한정되지 않으며, 화학합성계 및 효소계중 어떠한 것을 사용하여 실시하더라도 양호하다.

본 발명의 모나틴의 제조방법은, 트립토판을 출발물질로 하여 모나틴을 제조하는 방법에 한정되는 것이 아니며, 상기 반응 ① 내지 ③중, 반응 ③을 필수공정으로서 포함하면 된다. 즉, 시판중인 인돌-3-피루브산을 출발물질로서 반응 ② + 반응 ③에 의해 모나틴을 제조하는 방법, 및 전구체 케토산(IHOG)을 출발물질로서 반응 ③에 의해 모나틴을 제조하는 방법 등도 본 발명에 포함된다. 따라서, 하기의 (가) 내지 (다)의 방법 모두가 본 발명의 모나틴의 제조방법에 해당한다.

(가) 반응 ① + 반응 ② + 반응 ③

(나) 반응 ② + 반응 ③

(다) 반응 ③만

또한, 상기 모나틴의 제조방법에 있어서 반응 ②는, 모나틴의 전구체 케토산(IHOG)의 합성에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법에서 기질로서 사용되는 치환 α-케토산의 제조에도 이용할 수 있다. 즉, 반응식 10에 나타내는 바와 같이, 반응 ②를 사용하여 수득된 화학식 4의 치환 α-케토산을 사용하여, 반응 ③에 의해 화학식 5의 글루탐산 유도체를 제조하는 방법(반응 ② + 반응 ③)도 본 발명의 글루탐산 유도체의 제조방법에 포함된다.

이하, 본 발명에 관해서,

[A] 반응 ①

[B] 반응 ②

[C] 반응 ③

의 순서로 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

[A] 반응 ①

반응식 11에 나타내는 반응 ①은, 인돌-3-피루브산의 제조에 관한 반응이다. 본 발명에 있어서의 반응 ①은, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성시켜 이를 반응액으로 하여, 당해 반응액에 탈기처리, 탈산소처리 및 최대 pH 2 이하로의 pH 조정 중 어느 하나를 실시하여 인돌-3-피루브산을 채취하는 것을 특징으로 한다.

종래, 인돌-3-피루브산의 화학적 제조방법으로서는, Giovanna De Luca 등에 의해, 트립토판을 출발원료로 하여, 양성자 수용체 탈수용 염기의 존재하에, 피리딘 알데히드와 반응시킴으로써, 인돌-3-피루브산을 수율 50 내지 62%로 수득하는 방법이 공지되어 있다[참조: 일본 국제공개특허공보 제(소) 62-501912호, 국제공개 제87/00169호 팜플렛]. 당해 방법에 있어서는, 필요로 하는 염기와 피리딘 알데히드가 고가이며, 수율이 낮으며, 그 결과, 제조 비용이 대단히 높은 문제가 있었다. 또한, Politi Vincenzo 등에 의해, 인돌과 에틸-3-브로모피루베이트 에스테르옥심을 원료에 사용한 축합반응 후, 산 가수분해로 처리함으로써, 인돌-3-피루브산을 수율 64%로 수득하는 방법이 공지되어 있다[참조: 유럽특허공보 421946호]. 당해 방법에 있어서는, 실리카 겔을 사용하는 정제공정이 필요하며, 수율이 낮고, 원료 도 고가이며, 공업적 제조에서는 대단히 비용이 높은 문제점이 있었다.

한편, 효소적 제조방법으로서는, 트랜스아미나제를 사용하는 방법이 공지되어 있다[참조: 반응식 12].

L-트립토판(L-Trp)에 칸디다 말토사(Candida maltosa)로 부터 유래하는 L-트립토판 트랜스아미나제를 작용시켜, 40mM L-Trp와 80mM 2-케토글루타르산으로부터 인돌-3-피루브산을 생성시키고, 이온교환수지 등으로 정제하여, 수율 72%로 수득하는 방법[참조: Bobe Ruediger 등, 동독 특허 DD297190]이나, 아스파라긴산 트랜스아미나제를 L-Trp와 2-케토글루타르산으로 작용시켜 인돌-3-피루브산을 생성시키고, 당해 반응액을 석유 에테르 추출후, 칼럼 크로마토그래피로 분취하여 인돌-3-피루브산을 정제하고, 이를 채취하는 방법[참조: 마리오·마테라쯔쯔이 등, 일본공개특허공보 제(소) 59-95894호]에 관해서 보고되어 있다. 이러한 트랜스아미나제를 사용하는 방법은, 수율이 낮고, L-Trp 외에 아미노 그룹 수용체로서 2-케토글루타르산 등의 케토산을 원료로서 필요로 하며, 또한 생성되는 인돌-3-피루브산과 등몰의 아미노 그룹 수용체에 대응하는 아미노산을 부수적으로 생성한다. 또한, 수율을 향상시키기 위해서 L-Trp에 대하여 과잉량의 케토산을 반응계에 투입하기 때문에, 반응후에 반응하지 않는 케토산이 잔존한다. 이러한 이유에 의해, 반응액으로부터 목적하는 인돌-3-피루브산을 채취하기 위해서는, 이온교환수지 등을 사용한 정제공정이 필요하고, 조작이 번잡하여 비용이 높아지고 있다.

또한, L-Trp으로부터 인돌-3-피루브산으로의 제법으로서는, L-아미노산 옥시다제를 사용하는 방법이 공지되어 있다. 단, L-아미노산 옥시다제에 의한 트립토판의 산화반응[참조: 반응식 13]시에 부수적으로 생성된 과산화수소에 의해서 인돌-3-피루브산이 인돌아세트산으로 분해되기[참조: 반응식 14] 때문에, 카탈라제를 반응계에 첨가하여 과산화수소를 분해하는[참조: 반응식 15] 방법이 제안되어 있다[참조: 미국특허 제5002963호 명세서; 테트라헤드론 레터즈(Tetrahedron Letters), 1987년, 28권, 12호 1277 내지 1280 페이지]

즉, 뱀독-유래된 L-아미노산 옥시다제와 소 간장-유래된 카탈라제를 담체에 고정화시킨 고정화효소 칼럼을 사용하여, L-Trp를 포함하는 용액을 통과시켜 반응시키고, 생성된 인돌-3-피루브산을 이온 교환 칼럼에 흡착시켜 메탄올로 용출한 후, 건조·채취시키는 방법이다. 그러나, 본 방법에서는 0.5g의 출발 L-Trp에서 0.2g의 인돌-3-피루브산 밖에 취득할 수 없으며 수율이 40%로 낮으며 또한, 효소의 고정화나 이온교환수지 정제 등의 공정이 번잡하고, 또한 반응하지 않은 L-Trp의 회수·재이용 공정도 필요하기 때문에 비용이 높은 문제점을 갖고 있었다.

한편, 미생물로 부터 유래된 L-아미노산 옥시다제에 관해서, John A. Duerre 등에 의해, 프로테우스 레트게리로 부터 유래된 L-아미노산 옥시다제를 대략 정제하여, L-Trp의 산화활성을 산소 소비량을 검출하는 활성측정법에 의해서 검출하고 있다[참조: 저널 오브 박테리올로지(Journal of Bacteriology), 1975년, 121권, 2호, 656 내지 663 페이지]. 또한, 후루야마 등에 의해, 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) P-501로 부터 유래된 L-페닐알라닌옥시다제가 L-Trp에도 작용한다는 것이, 산소 소비량을 검출하는 활성측정법에 의해서 확인되고 있다[참조: 노다산켄(野田産硏), Kiyofumi Maruyama, 저널 오브 바이오케미스트리(Journal of Biochemistry), 1990년, 108, 327 내지 333 페이지].

그러나, 이러한 보고에서는 모두 효소반응중의 L-트립토판 소비량, 산소 소비량 내지 생성된 과산화수소량을 측정함으로써 옥시다제 활성을 검출하고 있고, 인돌-3-피루브산을 직접 정량하지 않고 있다. 이것은 아미노산 옥시다제에 의한 반응에서 생성되는 과산화수소에 의해서 인돌-3-피루브산이 인돌아세트산으로 분해되기 때문이라고 생각된다. 한편, 미생물 균체 내지 균체 처리물을 사용하여 인돌-3-피루브산을 생성시킨 예는 없으며, 미생물에 의해서 트립토판이 어떻게 대사되어, 어떠한 분해산물이 생성되는가는 알 수 없었다.

또한, 생성된 인돌-3-피루브산의 채취법에 관해서, 상기의 관련기술 중에서, 트랜스아미나제를 사용하는 방법 내지 뱀독-유래된 L-아미노산 옥시다제를 사용하는 방법에 있어서는, 반응 수율이 낮으며, 부산물인 케토산 내지 반응하지 않은 L-트립토판이 반응액 중에 혼재하기 때문에, 인돌-3-피루브산의 채취에 크로마토그래피 분리공정을 필요로 하고 있으며, 조작이 번잡하고 비용이 높은 문제를 갖고 있었다.

본 발명자 등은 상기의 사정을 감안하여 염가이면서 간편하게 인돌-3-피루브산을 제조하는 방법을 제공하기 위해 검토를 거듭한 결과, 아미노산 옥시다제 및 카탈라제 활성을 갖는 미생물을 트립토판에 작용시켜, 인돌-3-피루브산이 생성되면 이를 채취할 수 있으며, 바람직하게는, 이것이 생성된 반응액에 대하여 불활성 기체 치환 등 또는 pH 조정에 의해 목적물의 분해를 억제하면서 인돌-3-피루브산을 생성하여 채취할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자 등은 검토를 거듭하는 중에 인돌-3-피루브산이 과산화수소에 의해 인돌아세트산으로 분해되는 것 외에도, 용액 중에서 산소 등의 공격을 받아 구조를 알 수 없는 분해물을 생성하며, 인돌-3-피루브산을 포함하는 용액이 착색되어 버리는 문제점이나 그 해결법을 밝혀냈다.

즉, 본 발명에 있어서는, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성시키고 이를 반응액으로 하여, 당해 반응액에 탈기처리, 탈산소처리 및 최대 pH 2 이하로의 pH 조정중 어느 하나를 실시하여 인돌-3-피루브산을 채취한다.

인돌-3-피루브산은 용액상태에서는 분해 또는 착색이 진행되어 버리지만, 상기 산 첨가법에 의하면 생성된 인돌-3-피루브산의 채취공정의 초기단계에서 인돌- 3-피루브산이 결정화되기 때문에, 그 밖의 정제·처리법에 비해 분해·착색이 억제되는 유리한 점을 갖는다.

또한, 인돌-3-피루브산의 분해물인 인돌아세트산은 산성 조건하에서의 직접 결정석출에 의해 항상 쉽게 제거되는 것은 아니지만, 상기 불활성 기체 치환에 의하면, 인돌아세트산의 부수적 생성을 억제시키는 효과가 있기 때문에, 상기 산성 하에서의 결정석출은 불활성 기체 치환과 조합됨으로써, 고순도의 인돌-3-피루브산의 채취에 대해 높은 효과를 갖는다.

또한, 본 발명에 있어서의 반응 ①은, 별도의 형태로서, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물의 배양물을, 트립토판에 작용시켜 인돌-3-피루브산을 생성시키고 인돌-3-피루브산을 채취하는 것을 특징으로 한다.

지금까지, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물의 배양물에 관해서, 이것을 트립토판에 작용시켜 인돌-3-피루브산을 생성시켜 이를 채취하였다는 보고는 없으며, 따라서 상기 방법은 신규의 유용한 인돌-3-피루브산의 효소법에 의한 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 반응 ①의 실시의 형태에 관해서,

(A-1) 반응 ①에 사용하는 효소

(A-2) 반응 ①의 반응조건

의 순서로 설명한다.

(A-1) 반응 ①에 사용하는 효소

반응 ①에 사용하는 효소로서는, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 활성을 갖는 효소이면 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있다. 반응 ①에 사용하는 효소로서는, 아미노산 옥시다제 활성과 카탈라제 활성을 갖는 효소가 바람직하다.

반응 ①에 있어서, 「아미노산 옥시다제 활성」이란, 반응식 13에 나타내는 반응을 촉매하는 활성이다. 일반적으로, L-아미노산 옥시다제는 L-아미노산으로부터 대응하는 케토산을 생성하고, D-아미노산 옥시다제는 D-아미노산으로부터 대응하는 케토산을 생성한다. 즉, 본 발명에 있어서, L-트립토판을 원료로 하는 경우에는, L-아미노산 옥시다제 활성을 갖는 미생물을, D-트립토판을 원료로 하는 경우는, D-아미노산 옥시다제 활성을 갖는 미생물을 각각 사용할 수 있다. DL-트립토판으로부터 제조할 수 있다. 여기에 D-아미노산 옥시다제 및 L-아미노산 옥시다제를 작용시키면 정량적으로 목적하는 인돌-3-피루브산을 생성할 수 있으며, 또한 D-아미노산 옥시다제 또는 L-아미노산 옥시다제를 작용시키면 50%의 수율로 목적하는 인돌-3-피루브산을 생성할 수 있다.

또한, 「카탈라제 활성」이란, 하기 반응식 15에 나타내는 반응을 촉매하는 활성이다.

반응식 13

반응식 15

반응 ①에 있어서의 아미노산 옥시다제 활성을 갖는 효소에 관해서는, 아미노산의 산화활성에 따른 산소 소비량을 검출하는 측정법[참조: 저널 오브 박테리올로지(Journal of Bacteriology), 1975년, 121권, 2호, 656 내지 663 페이지], 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 정량하는 방법[참조: M. Gabler 등, 엠자임 앤드 마이크로바이알 테크놀로지(Emzyme and Microbial Technology), 2000년, 27, 605 내지 611 페이지]등 각종 공지된 방법이나, 본 발명에 있어서 후술하는 트립토판으로부터 생성되는 인돌-3-피루브산을 직접 정량하는 방법 등 어떠한 방법을 사용하더라도 선택할 수 있다.

반응 ①에 있어서의 카탈라제 활성을 갖는 효소는, 카탈라제 반응에 의한 과산화수소의 감소를 230 내지 250nm의 흡광도의 변화로 측정하는 방법, 반응액의 잔존 과산화수소량을 KMnO₄로 정량하는 방법, 반응에서 발생하는 산소를 마노미터(manometer)로 측정하는 방법 등, 각종 공지된 방법으로 선택할 수 있다. 일례를 들면, 문헌[참조: M. Gabler 등, 엠자임 앤드 마이크로바이알 테크놀로지(Emzyme and Microbial Technology), 2000년, 27, 605 내지 611 페이지]에 기재된 잔존 과산화수소를 퍼옥시다제의 작용에 의해 o-디아니시딘(o-dianisidine) 등의 전자 공여체를 산화시켜 분광학적으로 정량하는 방법을 들 수 있다. 이들 중 어떠한 방법을 사용하더라도, 카탈라제 활성을 갖는 효소를 선택할 수 있다.

또한, 반응 ①에 사용하는 효소는, 하기의 실시예 1에 기재된 방법에 따라서, 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산을 생성시키는 활성을 검출함으로써도 선택할 수 있다.

반응 ①에 사용하는 효소를 생산하는 미생물은, 예를 들면 아크로모박터 속, 프로테우스 속, 모르가넬라 속, 슈도모나스 속 및 네우로스포라 속으로부터 선택할 수 있다. 당해 미생물로서는, 아미노산 옥시다제 활성과 카탈라제 활성을 갖는 미생물인 것이 바람직하고, 구체적으로는 아크로모박터 속, 프로테우스 속, 모르가넬라 속 등을 예시할 수 있고, 이 중에서도 아크로모박터 종 AJ2425, 프로테우스 레트게리 IFO13501 및 모르가넬라 모르가니 IFO3168를 바람직한 미생물로서 들 수 있다.

또한, 아크로모박터 종(Achromobacter sp. AJ2425)은 하기와 같이 기탁되어 있다:

아크로모박터 종 AJ2425주

(가) 수탁번호: FERM BP-8244(FERM P-18786으로부터, 2002년 11월 22에 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 2002년 3월 20일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6(우편번호 305-8566))

또한, 재단법인 발효연구소(IFO)에 기탁된 미생물에 관해서는, 일본국 오사 카시 요도가와쿠 쥬산본마치 2-17-85(우편번호 532-8686)의 재단법인 발효연구소에서 분양, 입수할 수 있다.

이러한 미생물은 토양, 식물 등 자연계에서 새롭게 분리된 균주일 수 있으며, 또한 변이유발 약제 처리나 재조합 DNA 기술 등에 의해 인위적으로 육종된 균주이더라도 양호하다.

반응 ①에 사용하는 효소를 생산하는 미생물의 배양방법은, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 배지, 즉 탄소원, 질소원, 무기염류, 미량 금속염류, 비타민류 등을 포함하는 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 탄소원으로서는, 상기 미생물이 이용할 수 있으면 어떠한 것이라도 사용할 수 있고, 구체적으로는, 글루코스, 수크로즈, 덱스트린 등의 당류, 솔비톨, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이들의 염류, 파라핀 등의 탄화수소 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

질소원으로서는, 황산암모늄, 염화암모늄, 요소, 효모 엑기스, 고기엑기스, 옥수수 침지여액, 카세인 가수분해물 등, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 구체적인 배지조성으로서, 예를 들면 글루코스 1.0%, 황산암모늄 0.3%, 분말효모 엑기스 1.0%, 펩톤 1.0%, KH₂PO₄ 0.1%, K₂HPO₄ 0.3%, MgSO₄ ·7H₂O 0.05%, FeSO₄·7H₂O 0.001%, 및 MnSO₄·4H₂O 0.001%(pH 7.0)를 포함하는 배지 등을 들 수 있다.

또한, 배지에는 L-아미노산 또는 D-아미노산 등을 효소 유도제로서 첨가함으로써, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 능력이 높은 균체를 수득할 수 있 는 경우가 있다.

또한, 기질의 균체내로의 투과성을 높이기 위해서, 트라이톤 X(Triton X) 및 트윈(Tween) 등의 계면활성제나 톨루엔, 크실렌 등의 유기용매를 이용할 수 있다.

배양 온도에 관해서는, 통상적으로 이용하는 미생물이 생육하는 범위, 예를 들면 20 내지 45℃ 정도의 온도, 바람직하게는 25 내지 37℃ 정도의 온도범위에서 반응이 이루어진다. 배지의 pH값에 관해서는, 바람직하게는 3 내지 10 정도, 보다 바람직하게는 4 내지 8 정도의 범위로 조절된다. 통기조건에 관해서는, 이용하는 미생물의 생육에 적합한 조건으로 설정되지만, 호기조건이 바람직하다. 배양시간에 관해서는, 통상적으로 12 내지 120시간 정도, 바람직하게는 16 내지 96시간 정도 동안 반응이 이루어진다.

(A-2) 반응 ①의 반응조건

반응 ①은, 효소의 존재하에서, 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산을 생성시키고 이를 반응액으로 하여, 당해 반응액에 탈기처리, 탈산소처리 및 최대 pH 2 이하로의 pH 조정중 어느 하나를 실시하여 인돌-3-피루브산을 채취하는 것을 특징으로 한다.

반응 ①에 있어서, 「효소의 존재하에서」란, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환시킬 수 있는 상태로, 효소가 반응계에 존재하는 것을 의미한다. 즉, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환할 수 있는 한은 어떠한 형태로 효소가 반응계에 존재하더라도 양호하며, 예를 들면, 효소를 단독으로 반응계에 첨가할 수 있거나, 당해 효소활성을 갖는 미생물(효소 생산균, 재조합 DNA에 의해서 형질전환된 세포), 당해 미생물의 배양물(액체배양, 고체배양 등), 배지(배양물로부터 균체를 제거한 것), 당해 배양물의 처리물을 반응계에 첨가할 수 있다. 미생물의 배양물을 사용하는 경우는, 미생물을 배양시키면서 동시에 반응 ①을 진행시킬 수 있으며, 미리 효소를 수득하기 위해서 배양된 배양물을 사용하여 반응 ①을 실시하더라도 양호하다. 또한, 여기서의「처리」란, 균체내의 효소를 회수하는 것을 목적으로 하여 실시하는 처리를 의미하여, 예를 들면 초음파, 유리 비드, 프렌치 프레스, 동결건조 처리나 용균효소, 유기 용매, 계면활성제 등에 의한 처리 등을 들 수 있다. 또한, 이러한 처리를 실시한 처리물을, 통상적 방법(액체 크로마토그래피나 황산암모늄 분획 등)에 의해서 제조한 조 분획 효소나 정제 효소로서, 필요로 하는 능력을 갖는 것이면, 이것을 사용하더라도 양호하다.

또한, 상기 배양물 또는 그 처리물을 이용할 때, 이들을 카라기난(carrageenan) 겔이나 폴리아크릴아미드에 포함시키거나, 또는 폴리에테르 설폰이나 재생 셀룰로스 등의 막에 고정화하여 사용하는 것도 가능하다.

균체 또는 균체 처리물의 사용량에 관해서는, 주어진 반응의 경우에 있어서, 목적하는 효과를 발휘하는 양(유효량)이면 양호하며, 이러한 유효량에 관해서는 당업자라면 간단한 예비실험에 의해 용이하게 결정할 수 있으며, 예를 들면, 세정 습윤 균체의 경우, 반응액 100ml당 1 내지 40g이다.

기질이 되는 트립토판은, L-체, D-체, DL-체 중 어느 것이라도 사용할 수 있지만, 입수의 용이함과 가격의 관점에서 L-체가 채용된다. 트립토판은, 목적하는 반응이 억제되지 않는 농도의 범위에서, 일괄하여 간헐적으로, 또는 연속적으로 첨가된다. 첨가방법에 관해서는, 균주의 배양중에 직접 첨가하더라도 양호하고, 배양후 일단 균체를 분리하고, 분리하여 수득된 균체 또는 그 처리물과 혼합하여 사용할 수 있다. 첨가시에 기질은 수용액 또는 슬러리형의 상태로 첨가되지만, 용해도의 증가나 분산의 촉진을 목적으로 하여, 반응에 영향을 주지 않는 유기용매나 계면활성제와 혼합하여 첨가하더라도 양호하다.

본 발명에 있어서 사용하는 반응에 관해서는, 바람직하게는 pH 3-10 정도, 보다 바람직하게는 pH 5-9 정도의 pH값 범위에서, 바람직하게는 10-60℃ 정도, 보다 바람직하게는 20-40℃ 정도의 온도범위에서, 바람직하게는 0.5-120시간 정도, 보다 바람직하게는 0.5-24시간 정도의 반응시간으로, 교반하에 또는 정치하에 실시할 수 있다. 기질의 사용농도에 관해서는, 특별히 제한되지 않지만, 0.1-10% 정도의 농도가 바람직하게 채용된다.

한편, 배양액 또는 반응액 중의 잔존하는 트립토판, 생성된 인돌-3-피루브산, 또는 부수적으로 생성된 인돌아세트산의 정량에 관해서는, 고속 액체 크로마토그래피에 의한 주지 방법을 사용하여 신속하게 이들을 용이하게 측정할 수 있다.

이렇게 하여 수득된 인돌-3-피루브산을 축적한 배양액(반응액)을, 탈기 또는 탈산소처리함으로써 인돌-3-피루브산의 분해를 억제할 수 있다. 탈기처리 및 탈산소처리 방법으로는, 당해 반응액 중에 포함되는 기체(전부 또는 일부)를 불활성 기체, 예를 들면 질소 및 아르곤 등으로 치환하는 방법을 들 수 있다.

여기서, 「탈기처리」란, 당해 반응액을 불활성 기체로 치환하는, 또는 당해 반응액을 흡입장치(aspirator)나 진공 펌프 등을 사용하여 감압 조건하에 실시하는 등의 조작에 의해서, 반응액 중에 존재하는 산소, 과산화수소 등의 인돌-3-피루브산과 반응하는 성분을 제거 또는 그 농도를 저하시키는 조작을 의미한다. 또한, 「탈산소처리」란, 반응액 중의 용존 산소를 제거하거나, 또는 그 농도를 저하시키는 조작이다. 구체적으로 용액중의 산소를 제거하는 방법으로는, 불활성 기체에 의해 산소를 제거하는 방법, 탈산소제를 용액중에 첨가하는 방법을 예로서 들 수 있다.

당해 반응액을 불활성 기체로 치환함으로써, 반응액 중에 잔존하는 산소를 제거하여 반응을 정지시킴과 동시에, 생성된 인돌-3-피루브산이나 잔존하는 트립토판의 분해를 방지할 수 있다. 여기서, 「불활성 기체」란, 인돌-3-피루브산과 직접 또는 간접적으로 반응하지 않고, 산소 또는 미량 잔존하는 과산화수소 등의 인돌-3-피루브산이나 트립토판과 반응하는 성분을 감소시키는 효과가 있는 기체를 의미한다. 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 불활성 기체의 예로서, 질소, 아르곤, 헬륨 등을 예시할 수 있다. 불활성 기체 치환은, 반응이 종료된 직후에 실시하더라도 양호하며, 세정 균체를 사용한 반응인 경우에는, 균체 분리후에 실시하더라도 양호하다.

불활성 기체의 투입방법으로는, 기상부를 불활성 기체로 치환하여, 기상부중의 산소 농도를 저하시키는 방법이나, 용액중에 불활성 기체를 도입하여 용존 산소를 제거하는 방법 등을 들 수 있으며, 특별히 투입 방법은 한정되지 않는다. 기상부의 산소 농도에 관해서는, 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하가 채용된다. 용액중의 산소 농도에 관해서는, 1ppm 이하, 바람직하게는 O.1ppm 이하, 더욱 바람직하게는 0.01ppm 이하인 것이 바람직하다.

또한 아황산나트륨 등 용존 산소 농도를 저하시키는 효과가 공지되어 있는 공지의 물질을 반응액에 적절하게 첨가함으로써도, 반응 정지 및 인돌-3-피루브산의 분해 억제를 실시하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 탈산소제로는, 아황산이온을 사용할 수 있다. 아황산이온원으로는, 아황산나트륨, 아황산칼륨, 아황산암모늄, 아황산암모늄 등의 염 또는 아황산, 또는 하이드로설파이트를 사용할 수 있다. 아황산이온 또는 하이드로설파이트로서, 바람직하게는 20ppm 이상 1% 이하, 보다 바람직하게는 100ppm 이상 0.5% 이하의 농도로 이들을 사용하는 것이 바람직하다.

상기의 불활성 기체 치환처리와 탈산소제를 용액중에 첨가하는 방법은, 이들을 조합하여 실시할 수 있거나, 어느 하나만을 실시할 수 있다.

반응에 의해서 생성된 인돌-3-피루브산은, 통상적인 방법에 의해 배양액 또는 반응액 중에서 채취하여 사용할 수 있다. 배양액 또는 반응액 중에서의 채취는, 이러한 경우에 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 주지의 수단, 예를 들면 여과, 원심분리, 진공농축, 이온교환 또는 흡착 크로마토그래피, 결정화 등의 조작을 필요에 따라서 적절하게 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 바람직한 하나의 형태로서, 당해 반응액을 산성조건으로 조정함으로써, 인돌-3-피루브산을 결정석출 또는 침전시켜 인돌-3-피루브산을 반응 종료 혼합물로부터 직접 분리하여 채취할 수 있다. 반응액의 pH 조정에 관해서는, 그 pH값을, 바람직하게는 2 이하, 보다 바람직하게는 1 이하로 하면 양호하다. 본 발명에 있어서는, 인돌-3-피루브산의 생성 수율은 높이면서, 부수적으로 생성된 케토산이나 미반응 L-트립토판의 용액중 농도는 낮출 수 있기 때문에, 산성 조건하에서 인돌-3-피루브산을 직접 결정석출시킴으로써, 정제공정을 간략화할 수 있다. 본 발명에 있어서, 더욱 바람직한 하나의 형태로서, 당해 반응액에 황산, 염산 등의 산을 적절하게 첨가함으로써, 인돌-3-피루브산을 직접 결정석출시킬 수 있다. 이러한 방법에 있어서는, 인돌-3-피루브산의 생성 수율은 높이면서, 부생 케토산이나 미반응 트립토판의 용액중 농도는 낮출 수 있기 때문에, 산성 조건하에서 인돌-3-피루브산을 직접 결정석출시킴으로써, 정제공정을 간략화할 수 있다.

산성조건으로 조정함에 있어서, 사용하는 산의 종류로서는, 당해 반응액이 산성이 되는 효과를 갖는 방법이면 특별히 제한은 없다. 사용하는 산의 예로서는 염산, 황산, 질산, 인산 등을 들 수 있다. 당업자라면 본 발명의 실시를 방해하지 않는 범위에서 결정석출 온도, 산의 사용량, 결정석출 시간, 산의 첨가방법 등을 적절하게 선택할 수 있다.

결정석출 온도로서 바람직하게는 -20 내지 100℃ 정도, 보다 바람직하게는 0 내지 60℃ 정도를 선택할 수 있다. 산의 사용량으로서 바람직하게는 반응액의 pH 값을 2 이하, 보다 바람직하게는 1 이하로 조정할 수 있는 양을 선택할 수 있다. 산 첨가후의 용액중의 수소 이온 농도가 바람직하게는 0.01 내지 10mol/L, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1mol/L 정도가 되도록 산을 첨가하여 사용할 수 있다.

결정석출 시간으로서 바람직하게는 1 내지 100시간 정도, 보다 바람직하게는 1 내지 24시간 정도를 선택할 수 있다.

[B] 반응 ②

본 발명의 반응 ②는, 인돌-3-피루브산과 피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 모나틴의 전구체 케토산(IHOG)을 합성하는 반응이다. 그러나, 반응 ②는, IHOG의 합성뿐만 아니라, 하기의 반응 ③에 기질로서 사용하는 치환 α-케토산의 합성에도 이용할 수 있다.

즉, 반응 ②는, 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 화학식 4의 치환 α-케토산을 생성하는 반응에도 널리 이용할 수 있다.

화학식 3

화학식 4

반응 ②에 의해서 수득된 화학식 4의 치환 α-케토산은, 하기의 반응 ③에 기질로서 사용할 수 있다.

화학식 3 및 화학식 4에 있어서, R은 탄소수 2 내지 8의 알킬 그룹, 탄소수 1 내지 8의 알콕시 그룹, 탄소수 2 내지 9의 카복시알킬 그룹, 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹, 복소환-함유 탄화수소 그룹 및 하이드록 실 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타낸다. R이 방향족환 또는 복소환을 포함하는 경우, 당해 방향족환 또는 복소환은 추가로 할로겐원자(요오드원자, 브롬원자, 염소원자, 불소원자 등), 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹에 의해 치환될 수 있다.

R은, 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹인 것이 바람직하고, 특히 3-인돌릴메틸 그룹인 것이 바람직하다. 즉, 화학식 3의 치환 α-케토산으로는, 페닐피루브산 또는 인돌-3-피루브산이 바람직하고, 특히 인돌-3-피루브산이 바람직하다. 인돌-3-피루브산으로서는, [A] 반응 ①의 항에서 설명한 방법에 의해 제조한 인돌-3-피루브산이 바람직하지만, 인돌-3-피루브산의 제조방법은 당연히 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.

화학식 3의 치환 α-케토산으로서 인돌-3-피루브산을 사용한 경우에는, 모나틴 제조의 중요한 중간체인 IHOG를 제조할 수 있다(반응식 16).

또한, 화학식 3의 치환 α-케토산으로서 페닐피루브산을 사용한 경우에는, 모나틴의 동족체인 4-페닐메틸-4-하이드록시 글루탐산(PHG)의 중간체 케토산인 PHOG(4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산)을 제조할 수 있다(반응식 17).

반응 ②의 실시의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 화학반응계 및 효소계 중 어느 것을 사용하더라도 양호하다. 이하, 반응 ②의 실시의 형태에 관해서, 화학반응계 및 효소계로 나누어,

(B-1) 화학반응계

(B-2) 효소계

(I) 반응 ②에 사용하는 효소

(1) 알돌라제를 암호화하는 DNA

(2) 알돌라제의 성질

(3) 알돌라제의 제조방법

(II) 반응 ②의 반응조건

의 순서로 설명한다.

(B-1) 화학반응계

화학반응계를 사용한 반응 ②는, 이하에 나타내는 방법이나 하기의 실시예 2를 이용하여 용이하게 실시할 수 있지만, 당연히 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산을 교차 알돌반응 및 탈탄산 반응으로 처리하여 화학식 4의 치환 α-케토산을 제조할 수 있다. 상기 알돌반응으로 처리하여 수득되는 화합물이, 반응계 내에서 형성되어 중요한 중간체가 되지만, 굳이 당해 화합물을 단리하지 않고 다음 공정인 탈탄산 반응으로 진행시킬 수 있다.

당해 알돌반응의 조건에는 특별히 곤란한 점은 없으며, 무기염기 또는 유기염기 존재하에서 적당한 용매 중에서 치환 피루브산 및 옥살로아세트산을 작용시키는 것만으로 용이하게 진행된다.

사용하는 용매의 종류로서는, 반응에 불활성인 것이면 특별히 제한은 없다.

당업자라면, 본 발명의 실시를 방해하지 않는 범위에서 반응온도, 염기의 사용량, 반응시간, 출발물질의 첨가방법을 적절하게 선택할 수 있다.

용매로서 바람직하게는, 물, 메탄올, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드 등의 극성용매 등을 들 수 있다.

사용하는 경우의 염기로서 바람직하게는, 무기염기, 예를 들면 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘 등의 알칼리금속 또는 알칼리토금속에 대응하는 수산화물, 또는 탄산화물이나, 유기염기, 예를 들면 트리에틸아민 등을 들 수 있다.

반응온도로는, 바람직하게는 -20 내지 100℃ 정도, 보다 바람직하게는 0 내지 60℃ 정도를 채용할 수 있다.

알돌반응 축합물을 탈탄산시키는 반응에 있어서는, 자발적인 탈탄산 반응에 의해서도 달성되지만, 반응액에 산 또는 금속이온 또는 이 두가지를 첨가함으로써 탈탄산 반응을 보다 효과적으로 실시할 수 있다. 이 경우에 사용하는 산으로는, 염산, 황산, 인산, 아세트산, p-톨루엔설폰산, 이온교환 수지 등의 고체산 등을 들 수 있고, 금속이온으로는, 니켈이온, 구리이온, 철이온 등의 전이금속 이온 등을 각각 들 수 있다. 반응온도로서 바람직하게는 -10 내지 100℃ 정도, 보다 바람직하게는 0 내지 60℃ 정도를 선택할 수 있다.

(B-2) 효소계

(I) 반응 ②에 사용하는 효소

반응 ②에 사용하는 효소로는, 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산과의 알돌 축합에 의해, 화학식 4의 치환 α-케토산을 합성하는 반응을 촉매할 수 있는 효소이면, 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있다. 즉, 당해 반응을 촉매하는 효소이면, 미생물로 부터 유래된 효소라도 양호하며, 유전자 재조합 기술에 의해 수득된 효소라도 양호하다.

본 발명자 등의 연구에 의해, 슈도모나스 속, 에르위니아 속, 플라보박테리움 속, 크산토모나스 속중에, 4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산 (PHOG)의 분해활성을 갖는 알돌라제를 생성하는 균주가 존재하는 것이 확인되었다.

이러한 미생물이 생산하는 알돌라제는, PHOG 1분자를 분해하여 페닐피루브산 1분자 및 피루브산 1분자를 생성하는 반응을 촉매하는 점에서, 본 발명자 등은 당해 알돌라제가 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 4-(인 돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)을 합성하는 반응을 촉매할 수 있다고 생각하였다. 이러한 생각에 근거하여, 본 발명자 등은 신규 알돌라제의 존재를 밝히기 위해 당해 균주의 배양 균체로부터 알돌라제를 단리하고 정제함과 동시에, 당해 효소가 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)의 알돌 축합에 의해 IHOG를 합성하는 것을 발견하였다.

종래, 2분자의 α-케토산 (및 치환 α-케토산)을 기질로 하는 알돌 축합을 촉매하는 미생물 효소로는, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균으로 부터 유래된 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제 및 이.콜리(E. coli), 비.서브틸리스(B. subtilis) 등에 존재하는 4-하이드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제의 2가지 예가 보고되어 있다. 전자의 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제는, 피루브산 2분자로부터 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타르산(4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate: 4-HMG)을 생성하는 반응 및 4-옥살로시트라말레이트(oxalocitramalate)로부터 옥살로아세트산 1분자와 피루브산 1분자를 생성하는 반응을 촉매하는 것이 보고되어 있다[참조: Kiyofumi Maruyama, 저널 오브 바이오케미스트리(Journal of Biochemistry), 1990년, 108, 327 내지 333 페이지]. 또한, 후자의 4-하이드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제는, 글리옥실산 1분자와 피루브산 1분자로부터 4-하이드록시-2-옥소글루타르산(4-Hydroxy-2-oxoglutarate: 4HG)을 생성하는 반응을 촉매하는 것이 공지되어 있다.

그러나, 이들 중 어느 균주로부터도 4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(이하, PHOG) 분해 활성이나, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트 산)으로부터 모나틴의 전구체 케토산(IHOG)을 합성하는 활성에 관한 보고·발견은 전혀 없으며, 이러한 균주가 생산하는 알돌라제를 상기의 모나틴의 합성 루트에 사용할 수 있는지에 관해서는 밝혀지지 않았다.

즉, 본 발명자의 발견 이전에 미생물 효소계를 사용하여 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 전구체 케토산(IHOG)을 합성시킨 예는, 지금까지 보고되어 있지 않다.

또한, 본 발명자 등은 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683으로 부터 유래된 알돌라제를 정제하여 알돌라제의 아미노산 서열을 결정하였다. 또한, 알돌라제의 아미노산 서열로부터 연역한 30염기쌍 정도의 DNA 분자를 합성하고, 이것을 사용하여 PCR법에 의해 당해 알돌라제를 암호화하는 DNA의 일부를 단리·취득하며, 추가로 당해 DNA 단편을 프로브로서 이용하여, 슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제를 암호화하는 전장 DNA를, 슈도모나스 태트롤렌스 염색체 유전자 라이브러리로부터 단리하는데 성공하였다.

상기 방법에 의해서 특정된 본 발명의 알돌라제를 암호화하는 DNA를 서열목록의 서열번호 1에 나타낸다. 또한, 서열목록의 서열번호 2 및 3에, 서열목록의 서열번호 1의 염기 서열이 암호화하는 알돌라제의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열목록의 서열번호 2는, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기 서열 중, 염기번호 456 내지 1118의 염기 서열이 암호화하는 알돌라제의 아미노산 서열이다. 또한, 서열목록의 서열번호 3은, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기 서열중, 염기번호 444 내지 1118의 염기 서열이 암호화하는 알돌라제의 아미노산 서열이다. 서열목 록의 서열번호 2 및 3에 기재된 어느 알돌라제도 알돌라제 활성을 가지며, 인돌-3-피루브산 1분자와 피루브산 (또는 옥살로아세트산) 1분자로부터 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)을 합성하는 반응을 촉매한다.

(1) 알돌라제를 암호화하는 DNA

서열목록의 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 알돌라제 유전자는 상기한 바와 같이 슈도모나스 태트롤렌스(Pseudomonas taerolens) ATCC4683주의 염색체 DNA에서 단리된 것이다. 서열목록의 서열번호 1의 염기 서열은, 공지의 슈도모나스 오크라세애(Pseudomonas ochraceae) 세균으로 부터 유래된 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제(유전자명 proA)[참조: Maruyama K., et.al., 바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리(Biosci. Biotechnol. Biochem.), 2001년, 65(12), 2701 내지 2709 페이지]와 아미노산 서열에 있어서, 29%의 상동성을 나타낸다. 또한, 여기서의 상동성은 유전자 해석 소프트「genetyx ver.6」[참조: GENETYX사 제조]를 사용하고, 각종 파라미터는 초기 설정대로 하여 산출한 값이다.

알돌라제 생산균으로부터 알돌라제를 암호화하는 DNA를 취득하는 방법에 관해서 설명한다.

처음에 정제된 알돌라제의 아미노산 서열을 결정한다. 이 때, 에드맨법[참조: Edman, P., 액타 케미스트리 스칸드(Acta Chem. Scand.), 1950년, 4, 227 페이지]를 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또한 Applied Biosystems사 제 조의 서열분석기(sequencer)를 사용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본 발명의 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683주로 부터 유래된 알돌라제에 관해서, 프로테아제로 한정 분해한 후에 역상 HPLC로 펩타이드 단편을 분취하고, 이러한 단편중 2개에 관해서 내부 아미노산 서열을 결정한 결과, 서열목록 서열번호 4 및 5에 나타내는 서열이 밝혀졌다.

밝혀진 아미노산 서열에 근거하여, 이것을 암호화하는 DNA의 염기 서열을 연역할 수 있다. DNA의 염기 서열을 연역하기 위해서는, 유니버셜 코돈(universal codon)을 채용한다.

연역된 염기 서열에 근거하여, 30염기쌍 정도의 DNA 분자를 합성한다. 당해 DNA 분자를 합성하는 방법은 테트라헤드론 레터즈[참조: Tetrahedron Letters, 1981년, 22, 1859 페이지]에 개시되어 있다. 또한, Applied Biosystems사 제조의 합성장치를 사용하여 당해 DNA 분자를 합성할 수 있다. 당해 DNA 분자는 알돌라제를 암호화하는 전장 DNA를 알돌라제 생산균 염색체 유전자 라이브러리에서 단리할 때에 프로브로서 이용할 수 있다. 또는, 본 발명의 알돌라제를 암호화하는 DNA를 PCR법으로 증폭시킬 때에 프라이머로서 이용할 수 있다. 단, PCR법을 사용하여 증폭되는 DNA는 알돌라제를 암호화하는 전장 DNA를 포함하고 있지 않기 때문에, PCR법을 사용하여 증폭되는 DNA를 프로브로서 사용하여, 알돌라제를 암호화하는 전장 DNA를 알돌라제 생산균 염색체 유전자 라이브러리에서 단리한다.

PCR법의 조작에 관해서는, 문헌[참조: White, T. J. et al., 트렌즈 인 제네틱스 5 (Trends Genet. 5), 1989년, 185 페이지]에 기재되어 있다. 염색체 DNA를 제조하는 방법, 또한 DNA 분자를 프로브로서 사용하여 유전자 라이브러리에서 목적하는 DNA 분자를 단리하는 방법에 관해서는, 문헌[참조: 몰레큘러 클로닝 제2판(Molecular Cloning, 2nd edition), Cold Spring Harbor press, 1989년] 등에 기재되어 있다.

단리된 알돌라제를 암호화하는 DNA의 염기 서열을 결정하는 방법은, 문헌[참조: 어 프랙티컬 가디드 투 몰레큘러 클로닝(A Practical Guide to Molecular Cloning), John Wiley & Sons, Inc., 1985년]에 기재되어 있다. 또한, Applied Biosystems사 제조의 DNA 서열분석기를 사용하여 염기 서열을 결정할 수 있다. 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683주로 부터 유래된 알돌라제를 암호화하는 DNA를 서열목록 서열번호 1에 나타낸다.

또한, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 IHOG를 합성하는 반응을 촉매하는 알돌라제를 암호화하는 DNA는, 서열목록의 서열번호 1에 나타내어지는 DNA 뿐만이 아니다. 즉, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 IHOG를 합성하는 반응을 촉매하는 알돌라제를 생성하는 슈도모나스 속 중, 종 및 주별로 염기 서열의 차이가 관찰될 것이기 때문이다.

또한, 당연히 알돌라제 생산균의 염색체 DNA에서 단리된 알돌라제를 암호화하는 DNA에 인공적으로 변이를 가한 DNA라도, 알돌라제를 암호화하는 경우에는, 반응 ②에 이용할 수 있다. 인공적으로 변이를 가하는 방법으로서 빈번하게 사용되는 것으로서, 문헌[참조: 메서드 인 엔자이몰로지(Method. in Enzymol.), 1987년, 154 페이지]에 기재되어 있는 부위특이적 돌연변이도입법이 있다.

또한, 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하여 알돌라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA도 반응 ②에 이용할 수 있다. 여기서「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건을 명확하게 수치화하는 것은 곤란하지만, 일례를 들면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리 하이브리드화하지만, 그것보다 상동성이 낮은 DNA끼리 하이브리드화하지 않는 조건[여기서 말하는 상동성(homology)은, 비교하는 서열간에 일치하는 염기의 수가 최대가 되는 배열법으로 하여 연산된 값인 것이 바람직하다], 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 37℃, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는 65℃, 0.1 ×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 것에 상당하는 염농도로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. 또한, 「알돌라제 활성」이란, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 IHOG를 합성하는 활성이면 양호하다. 단, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기 서열과 상보적인 염기 서열과 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 염기 서열의 경우에는, 33℃, pH 9의 조건하에서 서열목록의 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 알돌라제 활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다.

또한, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 DNA가 암호화하는 알돌라제와 실질적 으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA도 반응 ②에 이용할 수 있다. 즉,

(a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA,

(b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,

(c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA, 및

(d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA도 본 발명의 DNA이다.

여기서, 「1 또는 수 개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조나 알돌라제 활성을 크게 손상시키지 않는 범위의 것으로서, 구체적으로는 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개이다. 또한, 「알돌라제 활성」이란, 상기한 바와 같이, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 IHOG를 합성하는 활성을 의미한다. 단, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열의 경우에는, 33℃, pH 9의 조건하에서 서열목록의 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 알돌라제 활성을 유지하고 있는 것이 바람직하다.

(2) 알돌라제의 성질

다음에, 정제된 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683주로 부터 유래된 알돌라제의 성질에 관해서 설명한다.

슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683주로 부터 유래된 알돌라제는, 상기한 유전자의 단리와 분석으로부터 밝혀지는 바와 같이, 서열목록 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 그러나, 당연히 서열목록의 서열번호 2 및 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 알돌라제 활성을 갖는 단백질도 반응 ②에 이용할 수 있다.

즉, 하기 (a) 내지 (d)의 단백질을 반응 ②를 촉매하는 효소로서 이용할 수 있다:

(a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질,

(b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질,

(c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 및

(d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아 미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질

여기서, 「수 개」및「알돌라제 활성」의 정의는 (1) 알돌라제를 암호화하는 DNA에 관한 항의 설명과 동일하다.

이러한 알돌라제는 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 알돌 축합에 의해 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)을 합성하는 반응을 촉매한다.

상기의 알돌라제의 알돌라제 활성의 측정은, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 생성하는 IHOG량을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정함으로써 실시하는 것이 가능하다.

구체적으로는, 100mM 완충제, 50mM 인돌-3-피루브산, 250mM 피루브산, 1mM MgCl₂, 1%(v/v) 톨루엔으로 이루어지는 반응액에 알돌라제를 첨가하며, 33℃에서 4시간 동안 진탕 반응시켜 HPLC에서 생성된 IHOG량을 정량함으로써, 알돌라제 활성을 추정할 수 있다.

IHOG의 정량은, 예를 들면, 지엘사이언스(GL Science)사 제조의「Inertsil 0DS-2」(5㎛, 4.6 ×250mm)을 이용한 HPLC 분석으로 정량할 수 있다. 분석조건의 일례를 이하에 나타낸다:

이동상: 40%(v/v) 아세토니트릴/5mM 인산 2수소테트라부틸암모늄 용액

유속: 1ml/min

칼럼온도: 40℃

검출: UV 210nm.

다음에, 슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제에 관해서, 상기 분석방법으로 측정한 효소화학적 성질을 이하에 설명한다.

슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제는, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)의 알돌 축합에 의해 IHOG를 합성하는 반응을 촉매할 수 있다. 2분자의 α-케토산 (또는 치환 α-케토산)을 기질로 하는 알돌 축합을 촉매하는 미생물 효소로는, 지금까지 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균으로 부터 유래된 4-하이드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라제 및 이.콜리(E. coli), 비.서브틸리스(B. subtilis) 등에 존재하는 4-하이드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제의 2가지 예가 보고되어 있지만, 전자에 관해서는 PHOG 또는 IHOG에 작용하는 것과 같은 발견·보고는 전혀 없으며, 이러한 효소를 이용하여 PHOG(및 IHOG)을 합성하는 것이 가능한가에 관해서는 전혀 밝혀지지 않았다. 또한, 후자에 관해서는 PHOG 분해활성이 확인되지 않으며, 이러한 효소를 사용하더라도 PHOG(및 IHOG)의 합성은 불가능하였다. 즉, 슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제는, 지금까지 보고된 알돌라제와 다르며, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)의 알돌 축합에 의해 IHOG를 합성하는 반응을 촉매할 수 있는 점에 특징을 갖는 것이다.

슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제의 가장 적합한 pH는 33℃에서 약 9 부근에 있다.

슈도모나스 태트롤렌스로 부터 유래된 알돌라제의 분자량을 겔 여과법에 의해 측정한 결과, 약 146kDa이고, SDS-PAGE법에 의해 측정한 결과 약 25kDa이기 때문에, 본 발명의 알돌라제는 분자량 약 25kDa 서브유닛의 6량체 구조를 취할 것으로 추정된다.

(3) 알돌라제의 제조방법

다음에 알돌라제의 제조방법에 관해서 설명한다. 본 발명의 반응 ②에 사용하는 알돌라제의 제조방법으로는, (i) 알돌라제 생산균을 미생물 배양함으로써 알돌라제를 생성 축적시키는 방법과, (ii) 재조합 DNA 기술에 의해 알돌라제를 생성하는 형질전환체를 형성시켜, 당해 형질전환체를 배양함으로써 알돌라제를 생성 축적시키는 방법의 두가지가 있다.

(i) 미생물 배양에 의해 생성 축적하는 방법

알돌라제 생산균을 미생물 배양함으로써 알돌라제를 생성 축적시키는 방법에 있어서, 알돌라제의 취득원이 되는 미생물로는 슈도모나스 속, 에르위니아 속, 플라보박테리움(Flavobactcrium) 속, 크산토모나스 속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

슈도모나스 속, 에르위니아 속, 플라보박테리움 속, 크산토모나스 속 중, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터 전구체 케토산(IHOG)을 합성하는 반응을 촉매하는 알돌라제를 생성하는 미생물이면, 어떠한 것이라도 본 발명에 사용할 수 있지만, 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683, 슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791, 슈도모나스 데스몰리티카 AJ1582, 에르위니아 종 AJ2917, 크산토모나스 시트리 AJ2797, 플라보박테리움 레나눔 AJ2468가 보다 바람직하다. 이 중, 특히 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683, 슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791가 바람직하다. 이러한 미생물의 기탁처를 하기에 나타낸다.

(1) 슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791주

(가) 수탁번호: FERM BP-8246(2002년 11월 22일에 FERM P-18881로부터 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 2002년 6월 10일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6)

(2) 슈도모나스 데스몰리티카 AJ1582주

(가) 수탁번호: FERM BP-8247(2002년 11월 22일에 FERM P-18882로부터 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 2002년 6월 10일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6)

(3) 에르위니아 종 AJ2917주

(가) 수탁번호: FERM BP-8245(2002년 11월 22일에 FERM P-18880으로부터 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 2002년 6월 10일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6)

(4) 플라보박테리움 레나눔 AJ2468주

(가) 수탁번호: FERM BP-1862

(나) 수탁일: 1985년 9월 30일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6)

(5) 크산토모나스 시트리 AJ2797주

(가) 수탁번호: FERM BP-8250 (2002년 11월 27일에 FERM P-4347로부터 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 1985년 9월 30일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6)

알돌라제의 취득원이 되는 미생물의 배양 형태는 액체배양, 고체배양 중 어느 것이라도 가능하지만, 공업적으로 유리한 방법은, 심부(深部) 통기 교반배양법이다. 영양배지의 영양원으로는, 미생물 배양에 통상적으로 사용되는 탄소원, 질소원, 무기염 및 그 밖의 미량 영양원을 사용할 수 있다. 사용 균주가 이용할 수 있는 영양원이면 전부 사용할 수 있다.

통기 조건으로서는, 호기 조건을 채용한다. 배양 온도로는 균이 발육하며, 알돌라제가 생산되는 범위이면 양호하다. 따라서, 엄밀한 조건은 없지만, 통상 10 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 배양 시간은, 기타 배양조건에 따라서 변화한다. 예를 들면, 알돌라제가 가장 많이 생산되는 시간까지 배양하면 양호하며, 통상적으로 5 내지 7시간, 바람직하게는 10시간 내지 3일 정도이다.

배양후, 균체를 원심분리(예를 들면, 10,000 ×g, 10분)에 의해 집균한다. 알돌라제의 대부분은 균체내에 존재하기 때문에 당해 균체를 파쇄 또는 용균시킴으로써 알돌라제를 가용화한다. 균체 파쇄에는, 초음파 파쇄, 프렌치 프레스 파쇄, 유리 비드 파쇄 등의 방법을 사용할 수 있으며, 또한 용균시키는 경우에는, 난백 리소자임이나 펩티다제 처리 또는 이들을 적절하게 조합한 방법이 사용된다.

알돌라제 생산균으로 부터 유래된 알돌라제를 정제하는 경우, 효소 가용화액을 출발재료로서 정제하게 되지만, 미파쇄 또는 미용균 잔사가 존재하는 것 같으면, 가용화액을 다시 원심분리조작으로 처리하여 침전하는 잔사를 제거하는 편이 정제에 유리하다.

알돌라제의 정제에는, 통상적으로 효소를 정제하는데 사용되는 모든 통상적인 방법, 예를 들면 황산암모늄 염석법, 겔 여과 크로마토그래피법, 이온교환 크로마토그래피법, 소수성 크로마토그래피법, 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피 등을 채용할 수 있다. 그 결과, 보다 비활성이 높은 알돌라제 함유 분획을 수득할 수 있다.

(ii) 재조합 DNA 기술에 의한 제법

다음에, 재조합 DNA 기술에 의해 알돌라제를 제조하는 방법에 관해서 설명한 다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 효소, 생리활성물질 등의 유용한 단백질을 제조하는 예는 다수 공지되어 있으며, 재조합 DNA 기술을 사용함으로써, 천연에 미량으로 존재하는 유용한 단백질을 대량 생산할 수 있다.

벡터 DNA와 접합되는 DNA는, 알돌라제를 발현할 수 있으면 양호하다.

여기서, 벡터 DNA에 접합되는 알돌라제 유전자의 일례로서는, (1) 알돌라제를 암호화하는 DNA의 항에서 설명한 DNA 등을 사용할 수 있다.

단백질을 재조합 DNA 기술을 사용하여 대량 생산하는 경우, 당해 단백질을 생산하는 형질전환체 내에서 당해 단백질이 서로 모여, 단백질의 봉입체(inclusion body)를 형성하는 것이 바람직하다. 이러한 발현생산 방법의 이점은, 목적하는 단백질을 균체내에 존재하는 프로테아제에 의한 소화로부터 보호하는 점 및 목적하는 단백질을 균체 파쇄에 이어지는 원심분리조작에 의해서 간단히 정제할 수 있는 점 등이다.

이와 같이 하여 수득되는 단백질 봉입체는, 단백질 변성제에 의해 가용화되며, 주로 그 변성제를 제거하는 것에 따른 활성 재생 조작을 거친 다음, 정확하게 접힌(folding) 생리적으로 활성인 단백질로 변환된다. 예를 들면, 사람 인터류킨-2의 활성 재생[참조: 일본 공개특허공보 제(소) 61-257931호] 등 많은 예가 있다.

단백질 봉입체로부터 활성형 단백질을 수득하기 위해서는, 가용화·활성 재생 등의 일련의 조작이 필요하며, 직접 활성형 단백질을 생산하는 경우보다도 조작이 복잡하게 된다. 그러나, 균체의 생육에 영향을 미치는 단백질을 균체내에서 대 량 생산시키는 경우는, 불활성 형태로 단백질 봉입체를 균체내에 축적시킴으로써, 이의 영향을 억제할 수 있다.

목적하는 단백질을 봉입체로서 대량 생산시키는 방법으로서, 강력한 프로모터의 제어하에, 목적하는 단백질을 단독으로 발현시키는 방법 외, 대량 발현하는 것이 공지되어 있는 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 방법이 있다.

또한, 융합 단백질로서 발현시킨 후에, 목적하는 단백질을 잘라내기 위해서, 제한 프로테아제의 인식서열을 적당한 위치에 배치해 두는 것도 유효하다.

단백질을 재조합 DNA 기술을 사용하여 대량 생산하는 경우, 형질전환되는 숙주세포로는, 세균세포, 방선균세포, 효모세포, 곰팡이세포, 식물세포, 동물세포 등을 사용할 수 있다. 숙주-벡터계가 개발되어 있는 세균세포로서는 에세리키아속 세균, 슈도모나스속 세균, 코리네박테리움속 세균, 바실러스속 세균 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 에세리키아·콜리가 사용된다. 에세리키아·콜리를 사용하여 단백질을 대량 생산하는 기술에 관해서 많은 발견이 있기 때문이다. 이하, 형질전환된 대장균을 사용하여 알돌라제를 제조하는 방법을 설명한다.

알돌라제를 암호화하는 DNA를 발현시키는 프로모터로는, 통상적으로 대장균에 있어서의 이종 단백질 생산에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 예를 들면, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, PL 프로모터 등의 강력한 프로모터를 들 수 있다.

알돌라제를 융합 단백질 봉입체로서 생산시키기 위해서는, 알돌라제 유전자의 상류 또는 하류에 기타 단백질, 바람직하게는 친수성인 펩타이드를 암호화하는 유전자를 연결하여 융합 단백질 유전자로 한다. 이러한 기타 단백질을 암호화하는 유전자로는, 융합 단백질의 축적량을 증가시켜 변성·재생 공정후에 융합 단백질의 용해성을 높이는 것이면 양호하며, 예를 들면, T7 유전자 10, β-갈락토시다제 유전자, 데하이드로폴레이트 환원 효소 유전자, 인터페론 γ유전자, 인터류킨-2유전자, 프로치모신(prochymosin) 유전자 등을 후보로서 들 수 있다.

이러한 유전자와 알돌라제를 암호화하는 유전자를 연결할 때에는, 코돈의 판독 프레임이 일치하도록 한다. 적당한 제한효소부위로 연결하거나 또는 적당한 서열의 합성 DNA를 이용하면 양호하다.

또한, 생산량을 증대시키기 위해서는, 융합 단백질 유전자의 하류에 전사종결서열인 터미네이터를 연결하는 것이 바람직하다. 당해 터미네이터로는, T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터, 대장균 trpA 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다.

알돌라제 또는 알돌라제와 다른 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 대장균에 도입하기 위한 벡터로는, 소위 다중 복제형인 것이 바람직하고, Col E1 유래의 복제 개시점을 갖는 플라스미드, 예를 들면 pUC계의 플라스미드나 pBR322계의 플라스미드, 또는 그 유도체를 들 수 있다. 여기서, 「유도체」란, 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위 등에 의해 개변된 플라스미드를 의미한다. 또, 여기서 말하는 개변이란, 돌연변이제나 UV 조사 등에 의한 돌연변이처리, 또는 자연변이 등에 의한 개변도 포함한다.

또한, 형질전환체를 선별하기 위해서, 당해 벡터가 암피시린 내성 유전자 등 의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드로서, 강력한 프로모터를 갖는 발현 벡터가 시판되고 있다[참조: pUC계(다까라슈죠(주) 제조), pPROK계(클론테크 제조), pKK233-2(클론테크 제조) 등].

프로모터, 알돌라제 또는 알돌라제와 다른 단백질과의 융합 단백질을 암호화하는 유전자, 터미네이터의 순서로 연결한 DNA 단편과, 벡터-DNA를 연결하여 재조합 DNA를 수득한다.

당해 재조합 DNA를 사용하여 대장균을 형질전환하며, 당해 대장균을 배양하면, 알돌라제 또는 알돌라제와 다른 단백질과의 융합 단백질이 발현 생산된다. 형질전환되는 숙주는, 이종 유전자의 발현에 통상적으로 사용되는 균주를 사용할 수 있지만, 특히 에세리키아·콜리 JM109(DE3)주, JM109주가 바람직하다. 형질전환을 실시하는 방법 및 형질전환체를 선별하는 방법은 문헌[참조: 몰레큘러 클로닝 제2판(Molecular Cloning, 2nd edition), Cold Spring Harbor press, 1989년] 등에 기재되어 있다.

융합 단백질로서 발현시킨 경우, 혈액응고인자 Xa, 칼리클레인 등의 알돌라제 내에 존재하지 않는 서열을 인식서열로 하는 제한 프로테아제를 사용하여 알돌라제를 잘라 낼 수 있도록 해도 양호하다.

생산배지로는, M9-카사미노산 배지, LB 배지 등, 대장균을 배양하기 위해서 통상적으로 사용하는 배지를 사용할 수 있다. 또한, 배양조건, 생산유도조건은, 사용한 벡터의 마커, 프로모터, 숙주균 등의 종류에 따라서 적절하게 선택한다.

알돌라제 또는 알돌라제와 다른 단백질과의 융합 단백질을 회수하기 위해서, 이하의 방법 등이 사용된다. 알돌라제 또는 이의 융합 단백질이 균체내에 가용화되어 있으면, 균체를 회수한 후, 균체를 파쇄 또는 용균시켜 조(粗) 효소액으로서 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 통상의 침전, 여과, 칼럼 크로마토그래피 등의 수법에 의해 알돌라제 또는 그 융합 단백질을 정제하여 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 알돌라제 또는 융합 단백질의 항체를 이용한 정제법도 이용할 수 있다.

단백질 봉입체가 형성되는 경우에는, 변성제로 이것을 가용화한다. 균체 단백질과 함께 가용화해도 양호하지만, 이후의 정제 조작을 고려하면, 봉입체를 취득하여 이것을 가용화하는 것이 바람직하다. 봉입체를 균체로부터 회수하기 위해서는, 종래 공지된 방법으로 실시하면 양호하다. 예를 들면, 균체를 파괴하여 원심분리조작 등에 의해서 봉입체를 회수한다. 단백질 봉입체를 가용화시키는 변성제로는, 구아니딘염산(예를 들면, 6M, pH 5 내지 8)이나 요소(예를 들면 8M) 등을 들 수 있다.

이러한 변성제를 투석 등에 의해 제거하면, 활성을 갖는 단백질로서 재생된다. 투석에 사용하는 투석 용액으로는, 트리스염산 완충액이나 인산완충액 등을 사용하면 양호하며, 농도로서는 20mM 내지 0.5M, pH로서는 5 내지 8을 들 수 있다.

재생 공정시의 단백질 농도는, 500㎍/ml 정도 이하로 억제하는 것이 바람직하다. 재생된 알돌라제가 자기-가교되는 것을 억제하기 위해서, 투석온도는 5℃ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 변성제 제거방법으로서, 이러한 투석법 외에, 희석법, 한외여과법 등이 있으며, 어떠한 것을 사용하더라도 활성의 재생을 기대할 수 있다.

또한, 당해 알돌라제 유전자가 슈도모나스속 세균으로 부터 유래하는 것인 경우, 바람직한 하나의 형태로서, 슈도모나스속 세균을 숙주로 하여 당해 알돌라제를 발현·생산시킬 수 있다. 이 경우의 숙주세포로는, 예를 들면 Shi-En Lu 등은 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)에서의 재조합 발현법을 보고하고 있다[참조: FEMS 마이크로바이올로지 레터즈(FEMS Microbiology Letters), 2002년, 210, 115 내지 121 페이지]. 또한, Olsen, R. H. 등은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에서의 재조합 발현법에 관해서 보고하고 있다[참조: 저널 오브 박테리올로지(Journal of Bacteriology), 1982년, 150, 60 내지 69 페이지]. 또한 Grapner, S. 등은 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri)에서의 재조합 발현법에 관해서 보고하고 있다[참조; 바이오몰레큘러 엔지니어링(Biomol. Eng.), 2000년, 17, 11 내지 16 페이지). 단, 알돌라제 발현을 위한 숙주세포로서의 슈도모나스속 세균은 이들에 한정되는 것은 아니다.

다음에 알돌라제 유전자를 슈도모나스속 세균에 도입하기 위한 벡터에 관해서인데, 슈도모나스속 세균 세포내에서 기능하는 복제 개시점을 갖는 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면 Eza Kalyaeva 등은 슈도모나스 아에루기노사에서 기능하는 레플리콘 TFK를 갖는 플라스미드 pKLH 4.05를 보고하고 있다. 또한, 그램음성세균의 형질전환에 사용되는, 소위 넓은 숙주 범위의 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터로는, RK404[참조: Ditta, G. 등, 플라스미드(Plasmid), 1985년, 13, 149 내지 153 페이지]나 RSF1010[참조: Frey, J. 등, 진(Gene), 1982년, 24, 289 내지 296 페이지] 등이 슈도모나스속 세균에서도 기능한다는 것이 공지되어 있다.

알돌라제를 암호화하는 DNA로서, 서열목록 서열번호 1에 나타내는 DNA를 사용하는 경우에는 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 알돌라제가 생산된다.

(II) 반응 ②의 반응조건

다음에, 효소계를 사용한 경우의 반응 ②의 반응조건에 관해서 설명한다.

반응 ②를 촉매하는 효소로서는, 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산과의 알돌 축합에 의해, 화학식 4의 치환 α-케토산을 합성하는 반응을 촉매할 수 있는 효소이면, 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있다. 즉, 당해 반응을 촉매하는 효소이면, 미생물로 부터 유래된 효소이더라도 양호하며, 유전자 재조합 기술에 의해서 수득된 효소이더라도 양호하다.

이러한 효소로는, (I) 반응 ②에 사용하는 효소의 항에서 설명한 알돌라제가 바람직하다. 이 경우, 슈도모나스 속, 에르위니아 속, 플라보박테리움 속, 크산토모나스 속 중, 반응 ②를 촉매하는 알돌라제를 생성하는 균체를 배양하여 수득한 알돌라제를 사용할 수 있으며, 재조합 DNA 기술에 의해 당해 반응을 촉매하는 알돌라제를 생성하는 형질전환체를 생성시켜, 당해 형질전환체를 배양하여 수득한 알돌라제를 사용할 수 있다.

반응 ②에 있어서, 「효소의 존재하에서」란, 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 화학식 4의 치환 α-케토산을 합성하는 반 응을 촉매할 수 있는 상태로, 효소를 반응계에 존재시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 효소를 단독으로 반응계에 첨가할 수 있거나, 또는 효소활성을 갖는 미생물(알돌라제 생산균, 재조합 DNA에 의해서 형질전환된 세포), 당해 미생물의 배양물(액체배양, 고체배양 등), 배지(배양물로부터 균체를 제거한 것), 당해 배양물의 처리물을 반응계에 첨가할 수 있다. 미생물의 배양물을 사용하는 경우는, 미생물을 배양시킴과 동시에 반응 ②를 진행시킬 수 있으며, 미리 효소를 수득하기 위해서 배양된 배양물을 사용하여 반응 ②를 실시하더라도 양호하다. 또한, 여기서「처리」란, 균체내의 효소를 회수하는 것을 목적으로 하여 실시하는 처리를 의미하여, 예를 들면 초음파, 유리 비드, 프렌치 프레스, 동결건조 처리나 용균효소, 유기 용매, 계면활성제 등에 의한 처리 등을 들 수 있다. 또한, 이러한 처리를 실시한 처리물을, 통상적 방법(액체 크로마토그래피나 황산암모늄 분획 등)에 의해서 제조한 조분획 효소나 정제 효소로서, 필요로 하는 능력을 갖는 것이라면, 이것을 사용하더라도 양호하다.

예를 들면, 알돌라제 생산균 또는 재조합 DNA에 의해서 형질전환된 세포를 사용하여, 화학식 4의 치환 α-케토산을 제조하는 경우, 배양하면서 배양액 중에 직접 기질을 첨가할 수 있으며, 배양액으로부터 분리된 균체, 세정 균체 등 어느 것이라도 사용 가능하다. 또한, 균체를 파쇄 또는 용균시킨 균체 처리물을 그대로 사용하더라도 양호하며, 당해 균체 처리물로부터 알돌라제를 회수하여 조효소액으로서 사용할 수 있으며, 또한, 효소를 정제하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 배양물 또는 그 처리물을 이용할 때, 이들을 카라기난 겔이나 폴 리아크릴아미드에 포함시키거나, 또는 폴리에테르설폰이나 재생 셀룰로스 등의 막에 고정화하여 사용하는 것도 가능하다.

효소의 존재하에, 반응 ②를 진행시키기 위해서는, 화학식 3의 치환 α-케토산, 옥살로아세트산 또는 피루브산중 적어도 1종 및 반응 ②를 촉매하는 효소를 포함하는 반응액을 20 내지 50℃의 적당한 온도로 조정하여, pH 6 내지 12로 유지하면서, 30분 내지 5일 동안 정치, 진탕 또는 교반하면 양호하다.

당해 반응액에 Mg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Co²⁺ 등의 2가 양이온을 첨가함으로써 반응속도를 향상시킬 수 있다. 비용 등의 면에서, 바람직하게는 Mg²⁺을 사용하는 경우가 있다.

이러한 2가 양이온을 반응액에 첨가할 때는, 반응을 저해하지 않는 한도에서 어느 염을 사용하더라도 양호하지만, 바람직하게는 MgCl₂, MgSO₄, MnSO₄ 등을 사용하는 경우가 있다. 이러한 2가 양이온의 첨가 농도는 당업자이면 간단한 예비검토에 의해서 결정할 수 있지만, 0.01 내지 10mM, 바람직하게는 0.1 내지 5mM, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2mM의 범위에서 첨가할 수 있다.

이하, 반응 ②를 실시할 때의 바람직한 반응조건의 일례를 들면, 100mM 완충제, 50mM 인돌-3-피루브산, 250mM 피루브산, 1mM MgCl₂, 1%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액에, 효소원으로서 알돌라제 발현 이. 콜리(E. coli)의 세정 균체를 10%(w/v)가 되도록 첨가하고, 33℃에서 4시간 동안 진탕 반응시킴으로써, 4-(인돌- 3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)이 수득된다.

생성된 화학식 4의 치환 α-케토산은, 공지된 수법에 의해 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 이온교환 수지에 접촉시켜 염기성 아미노산을 흡착시키고, 이것을 용리한 후 결정석출하는 방법 또는 용리한 후 활성탄 등에 의해 탈색 여과하여 결정석출하는 방법 등을 들 수 있다.

반응 ②에 의해, 인돌-3-피루브산과 피루브산 (또는 옥살로아세트산)으로부터의 모나틴 합성에 있어서 중간체로서 유용한 전구체 케토산(IHOG)을 생성할 수 있다.

[C] 반응 ③

본 발명의 반응 ③은, 모나틴의 제조에 관한 반응이며, 전구체 케토산(IHOG)으로부터 모나틴을 합성하는 데 바람직하게 이용할 수 있다. 그러나, 반응 ③은, 당해 모나틴의 합성 뿐만 아니라, 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응에도 널리 이용할 수 있다.

화학식 1

화학식 2

위의 화학식 1 및 화학식 2에서,

R¹ 및 R²는 서로 독립하여, 각각 수소원자, 탄소수 1 내지 8의 알킬 그룹, 탄소수 1 내지 8의 알콕시 그룹, 탄소수 2 내지 9의 카복시알킬 그룹, 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹, 복소환-함유 탄화수소 그룹 및 하이드록실 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타낸다. 단, R¹ 및 R²중 하나가 수소원자를 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자, 메틸 그룹 또는 에틸 그룹을 나타내지 않는다. 또한, R¹ 및 R²중의 하나가 하이드록실 그룹을 나타내는 경우에는, 다른 하나는 수소원자 또는 메틸 그룹을 나타내지 않는다.

상기 화학식중 R¹의 치환기에 포함되는 방향족환 또는 복소환은, 추가로 할로겐원자, 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹 중 1종 이상을 가질 수 있다.

이 중에서도, R¹이, 탄소수 2 내지 4의 알킬 그룹, 탄소수 2 내지 4의 카복시알킬 그룹, 페닐메틸 그룹 및 3-인돌릴메틸 그룹으로부터 선택되며 [벤젠환 또는 인돌환은, 추가로 할로겐원자(요오드원자, 브롬원자, 염소원자, 불소원자 등), 하이드록실 그룹, 탄소수 3이하의 알킬 그룹, 탄소수 3이하의 알콕시 그룹 및 아미노 그룹의 1종 이상을 가질 수 있다], 또한, R²가 하이드록실 그룹인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 R¹이 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹이고, R²가 하이드록 실 그룹인 것이 바람직하다.

R¹이 3-인돌릴메틸 그룹, R²가 하이드록실 그룹인 경우, 즉, 화학식 1의 치환 α-케토산으로서 IHOG(4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산)을 사용한 경우, 화학식 2의 글루탐산 유도체로서 모나틴이 수득된다.

또한, R¹이 페닐메틸 그룹, R²가 하이드록실 그룹인 경우, 즉 화학식 1의 치환 α-케토산으로서 PHOG(4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산)을 사용한 경우, 화학식 2의 글루탐산 유도체로서 모나틴의 동족체인 4-페닐메틸-4-하이드록시-글루탐산(PHG)이 수득된다.

기질이 되는 화학식 1의 치환 α-케토산으로는, [B] 반응 ②의 항에서 설명한 방법에 의해 수득된 화학식 4의 치환 α-케토산을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, [A] 반응 ①의 항에서 설명한 방법에 의해 제조한 인돌-3-피루브산을 사용하여 [B] 반응 ② 방법에 의해 제조한 IHOG를 사용하는 것이 바람직하지만, 화학식 1의 치환 α-케토산의 제조방법은 당연히 이러한 방법에 한정되는 것이 아니다.

반응 ③은, 치환 α-케토산을 기질로서 대응하는 아미노산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소반응을 이용하는 것이며, 예를 들면 아미노 그룹 전이반응을 촉매하는 단백질 또는 당해 단백질을 생산하는 미생물을 작용시킴으로써 글루탐산 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 「아미노 그룹 전이반응」이란, 케톤 화합물 전구체를 대응하는 아미노 화합물로 전환시켜, 아미노 공여체 기질을 케톤 화합물로 전환시키는 반응이다.

이하에, 본 발명의 반응 ③의 실시의 형태에 관해서,

(C-1) 반응 ③에 사용하는 효소

(C-2) 반응 ③의 반응조건

의 순서로 상세하게 설명한다.

(C-1) 아미노산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소

반응 ③에 있어서, 치환 α-케토산을 기질로서 대응하는 아미노산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소, 예를 들면 아미노 그룹 전이반응을 촉매하는 효소로는 트랜스아미나제를 들 수 있고, 또한 케토산의 환원적 아미노화 반응을 촉매하는 효소로는, 데하이드로게나제를 들 수 있다. 반응 ③에 있어서 이용되는 트랜스아미나제는, 출발원료인 치환 α-케토산과 아미노 공여체로부터 대응하는 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소이면 양호하다. 이러한 효소의 작용에 의해, 화학식 1의 치환 α-케토산을 대응하는 글루탐산 유도체(화학식 2로 나타내어진다)로 변환시킬 수 있다.

이 때, 아미노 공여체에는, 아미노 그룹을 포함하는 화합물이 사용된다. 예를 들면, 천연 및 비천연의 L-아미노산이나 D-아미노산 등의 아미노 화합물을 들 수 있다. 즉, 글루탐산, 아스파라긴산, 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 티로신, 발린, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 오르니틴, 세린, 시스테인, 히스티딘, 리신 등을 아미노산의 예로서 들 수 있다. 반응에 첨가하는 아미노 공여체는 1종류라도 양호하고, 복수의 공여체의 혼합물이라도 양호하다.

일반적으로, L-아미노산 트랜스아미나제는 L-아미노산 공여체의 아미노 그룹을 전구체 케토산으로 전이함으로써 목적하는 L-아미노산을 생성하며, D-아미노산 트랜스아미나제는 D-아미노산 공여체의 아미노 그룹을 전구체 케토산으로 전이함으로써 목적하는 D-아미노산을 생성한다. 이러한 효소의 선택에 의해, 생성해야 할 글루탐산 유도체의 광학이성체를 선택할 수 있다. 예를 들면, D-아미노산 트랜스아미나제를 D-알라닌, D-글루탐산, D-아스파라긴산 등의 D-아미노산 존재하에서 작용시킴으로써, 전구체 케토산으로부터 D-글루탐산 유도체를 선택적으로 생성시킬 수 있다.

상기와 같이, 본 발명이 과제로 하는 글루탐산 유도체의 하나인 모나틴은, 천연형(2S,4S) 배위 외에 3종의 광학이성체가 존재하고 있으며, 어느 것이나 수백배에서 수천배의 감미 강도를 갖는 것이 확인되고 있다. 본 발명에 있어서 하나의 바람직한 형태로서, 모나틴의 전구체 케토산에 대하여 D-아미노산 트랜스아미나제를 작용시킴으로써, 모나틴의 2R 배위를 입체선택적으로 생성시킬 수 있으며, 또한, L-아미노산 트랜스아미나제를 작용시킴으로써, 모나틴의 2S 배위를 선택적으로 생성시킬 수 있다. 더욱 바람직한 하나의 형태로서는, D-아미노산 트랜스아미나제를 사용함으로써, 고감미도 이성체인 2R 배위를 선택적으로 생성시킬 수 있다.

여기서, D-아미노산을 아미노 공여체로 사용할 때, 대응하는 L-아미노산을 반응액중에 첨가하여, 당해 아미노산을 라세미화하는 반응을 촉매하는 효소와 공존 시킴으로써, 당해 공여체를 D-아미노산 공여체로서 공급할 수 있다. 이와 같은 라세미화 효소로는 알라닌 라세마아제, 글루탐산 라세마아제, 아스파라긴산 라세마아제, 페닐알라닌 라세마아제 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 이 경우, L-알라닌, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-아스파라긴산, 또는 상기 L-아미노산의 라세미 혼합물을, D-글루탐산 유도체의 생성중에, 반응 용액에 첨가할 수 있다.

상기의 아미노 그룹 전이반응을 촉매하는 효소는, 당해 효소를 생산하는 미생물을 배양함으로써도 제조할 수 있다. 이러한 미생물로는, 예를 들면 에어로모나스(Aeromonas) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 알칼리게네스

(Alcaligenes) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 베이예린키아(Beijerinckia) 속, 에세리키아(Escherichia) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 모르가넬라(Morganella) 속, 및 파에니바실러스(Paenibacillus) 속에 속하는 미생물을 들 수 있다.

이러한 미생물로서, 구체적으로는 다음의 것을 예로서 들 수 있다. 즉, 화학식 1에 기재한 치환 α-케토산으로부터 화학식 2에 기재된 글루탐산 유도체를 생성하는 활성을 갖는 L-아미노산 트랜스아미나제 생산균으로서는 하기의 예를 들 수 있다:

·에어로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila) IFO3820

·아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) IF3058

·알칼리게네스 패칼리스 (Alcaligenes faecalis) ATCC8750

·베이예린키아 인디카 (Beijerinckia indica) ATCC9037

·에세리키아 콜리 (Escherichia coli) ATCC12814

·프로테우스 레트게리 (Proteus rettgeri) IFO13501

·모르가넬라 모르가니 (Morganella morganii) IFO3848

또는 D-아미노산 트랜스아미나제 생산균으로서는 하기의 예를 들 수 있다:

·바실러스 스패리쿠스 (Bacillus sphaericus) ATCC10208

·바실러스 풀비파시엔스 (Bacillus pulvifaciens) AJ1327

·파에니바실러스 라바에 아종 풀비파시엔스 (Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens) ATCC13537

·바실러스 마세란스 (Bacillus macerans) AJ1617

·파에니바실러스 마세란스 (Paenibacillus macerans) ATCC8244

·바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) AJ12699

·바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) ATCC10840

또한, 바실러스 마세란스 (Bacillus macerans) AJ1617에 관해서는 하기와 같이 기탁되어 있다:

바실러스 마세란스 AJ1617주

(가) 수탁번호: FERM BP-8243(FERM P-18653으로부터 2002년 11월 22일에 국제기탁으로 이관)

(나) 수탁일: 2001년 12월 13일

(다) 기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이 6).

이러한 미생물은, 토양, 식물 등 자연계에서 새롭게 분리된 균주이더라도 양 호하며, 또한 돌연변이도입 약제 처리나 재조합 DNA 기술 등에 의해 인위적으로 육종된 균주이더라도 양호하다.

본 발명의 하나의 바람직한 형태에 있어서, 목적하는 치환 α-케토산으로부터 글루탐산 유도체로의 아미노 그룹 전이반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자를 미생물 세포 중에 도입시킬 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 이용하여 효소, 생리활성물질 등의 유용한 단백질을 제조하는 예는 많이 공지되어 있으며, 재조합 DNA 기술을 사용함으로써, 천연에 미량으로 존재하는 유용한 단백질을 대량 생산할 수 있다. 도입되는 유전자로는, L-아미노산 트랜스아미나제 유전자나 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자를 들 수 있다. 일례를 들면, 바실러스 스패리쿠스나 바실러스 마세란스로부터의 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자가 미생물에 도입될 수 있다.

바실러스 스패리쿠스로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자에 관해서는, 유럽특허출원공개 0736604 및 문헌[참조: Taylor et al., 저널 오브 박테리올로지(Journal of Bacteriol.), 1998년, 180권, 16호, 4319 페이지]에 보고되어 있다.

또한, 바실러스 마세란스로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자로는, 서열목록 서열번호 17에 기재된 바실러스 마세란스로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자 DNA를 사용할 수 있다. 서열목록 서열번호 17에 기재된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자 DNA를 사용한 경우, 서열목록 서열번호 18에 기재된 D-아미노산 트랜스아미나제가 수득된다. 또, 당해 바실러스 마세란스로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제를 암호화하는 유전자 및 아미노산 서열은, 본 발명자 등에 의해 최초로 밝혀진 것이다.

D-아미노산 트랜스아미나제 유전자의 유래는 이것에 한정되는 것이 아니며, 목적하는 D-글루탐산 유도체를 생성하는 D-아미노산 트랜스아미나제를 암호화하는 유전자이면 양호하다.

재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질을 대량 생산하는 경우, 형질전환되는 숙주세포로서는, 세균세포, 방선균세포, 효모세포, 곰팡이세포, 식물세포, 동물세포 등을 사용할 수 있다. 이 중, 재조합 DNA 조작에 관한 정보가 있는 미생물로는 바실러스, 슈도모나스, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 스트렙토마이세스 및 에세리키아 콜리(Eshelichia coli) 등을 들 수 있다. 일반적으로는, 대장균을 사용하여 단백질을 대량 생산하는 기술에 관해서 많은 정보가 있기 때문에, 대장균, 바람직하게는 에세리키아 콜리가 사용된다.

이들 미생물에는, 목적하는 아미노 그룹 전이효소 유전자를 보유한 플라스미드, 파지 등의 벡터를 사용하여 도입할 수 있으며, 상동 재조합에 의해서 당해 세포의 염색체상에 목적 유전자를 도입시킬 수 있다. 바람직하게는, 소위 다중 복제형의 플라스미드 벡터를 들 수 있으며, 예를 들면 에세리키아 콜리로의 벡터로는 Col E1 유래의 복제 개시점을 갖는 플라스미드, 예를 들면 pUC계의 플라스미드나 pBR322계의 플라스미드, 또는 이의 유도체를 들 수 있다. 이러한 벡터에는 목적하는 아미노 그룹 전이효소 유전자를 발현시키는 프로모터로서, 통상적으로 대장균에 있어서 단백질 생산에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 이러한 프로모터의 예로서, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, PL 프로모터 등의 강력한 프로모터를 들 수 있다. 또한, 생산량을 증대시키기 위해서는, 단백질 유전자의 하류에 전사종결서열인 터미네이터를 연결하는 것이 바람직하다. 이러한 터미네이터로는, T7 터미네이터, fd 파지 터미네이터, T4 터미네이터, 테트라사이클린 내성 유전자의 터미네이터, 대장균 trpA 유전자의 터미네이터 등을 들 수 있다. 또한, 형질전환체를 선별하기 위해서, 당해 벡터는 암피시린 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하고, 이러한 플라스미드로서, 예를 들면, pUC계[참조: 다까라슈조(주) 제조], pPROK계[참조: 클론테크 제조], pKK233-2[참조: 클론테크 제조] 등과 같이 강력한 프로모터를 가지는 발현 벡터가 시판되고 있다.

반응 ③에 사용하는 효소를 생산하는 미생물의 배양 방법을 위하여, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 배지, 즉 탄소원, 질소원, 무기염류, 미량 금속염류, 비타민류 등을 포함하는 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 또한, 미생물의 종류 또는 배양 조건에 따라서는, 배지중에 O.1 내지 1.0g/dl 정도의 아미노산 등의 아미노 화합물을 첨가함으로써, 아미노 그룹 전이반응 활성을 촉진시킬 수 있다.

유전자 재조합 세포를 배양하는 경우는, 벡터의 선택 마커에 대응하여 암피시린, 카나마이신, 네오마이신, 클로람페니콜 등의 약제를 적절하게 첨가할 수 있다. 또한, 벡터에 보유되어 있는 프로모터에 따라, 유도제를 적량 첨가함으로써 당해 재조합 유전자의 발현량을 높일 수 있다. 일례를 들면, lac 프로모터의 하류에 목적하는 유전자를 연결하여 벡터를 구축한 경우는, 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 0.1 내지 5mM의 범위에서 적절하게 첨가하는 것도 가능하며, 또한, 이를 대신하여 갈락토스를 최종 농도 O.1 내지 5g/dl, 바람직하게는 0.5 내지 2g/dl로 적절하게 첨가할 수 있다.

상기 배지 성분으로서 사용되는 구체적 물질로서, 예를 들면, 탄소원으로는, 이용하는 미생물이 이용할 수 있으면 제한은 없으며, 예를 들면 글루코스, 수크로즈, 프룩토스, 글리세롤, 아세트산 등 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 질소원으로는, 황산암모늄, 염화암모늄, 요소, 효모 엑기스, 고기 엑기스, 옥수수 침지여액, 카세인 가수분해물 등 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 구체적인 배지조성으로서, 예를 들면 푸마르산 0.5g/dl, 효모 엑기스 1g/dl, 펩톤 1g/dl, 황산암모늄 O.3g/dl, K₂HPO₄ 0.3g/dl, KH₂PO₄ 0.1g/dl, FeSO₄·7H₂O 1mg/dl, 및 MnSO₄·4H₂O 1mg/dl(pH 7.0)를 포함하는 배지 등을 들 수 있다.

배양 온도는, 통상적으로 이용하는 미생물이 생육하는 범위내, 즉 10 내지 45℃에서 실시되지만, 바람직하게는 20 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 37℃의 범위이다. 또한, 배지의 pH값에 관해서는, 바람직하게는 2 내지 12, 보다 바람직하게는 3 내지 10, 더욱 바람직하게는 4 내지 8의 범위에서 조절된다. 통기 조건에 관해서는, 이용하는 미생물의 생육에 적합한 조건으로 설정되지만, 호기 조건이 바람직하다. 배양 시간에 관해서는, 통상적으로 12 내지 120시간, 바람직하게는 24 내지 96시간 정도이다.

(C-2) 반응 ③의 반응조건

반응 ③은, 효소의 존재하에서, 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 것을 특징으로 한다.

반응 ③에 있어서, 「효소의 존재하에서」란, 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성할 수 있는 상태로, 효소를 반응계에 존재시키는 것을 의미한다. 즉, 화학식 1의 치환 α-케토산을 화학식 2의 글루탐산 유도체로 변환시킬 수 있는 한은 어떠한 형태로 효소를 반응계에 존재시키더라도 양호하며, 예를 들면, 효소를 단독으로 반응계에 첨가하더라도 양호하며, 당해 효소 활성을 갖는 미생물(효소 생산균, 재조합 DNA에 의해서 형질전환된 세포), 당해 미생물의 배양물(액체배양, 고체배양 등), 배지(배양물로부터 균체를 제거한 것), 당해 배양물의 처리물을 반응계에 첨가하더라도 양호하다. 미생물의 배양물을 사용하는 경우는, 미생물을 배양시키면서 동시에 반응 ③을 진행시킬 수 있으며, 미리 효소를 수득하기 위해서 배양된 배양물을 사용하여 반응 ③을 실시할 수 있다. 또한, 여기서의「처리」란, 균체내의 효소를 회수하는 것을 목적으로 하여 실시하는 처리를 의미하며, 예를 들면 초음파, 유리비드, 프렌치 프레스, 동결건조 처리나 용균효소, 유기 용매, 계면활성제 등에 의한 처리 등을 들 수 있다. 또한, 이러한 처리를 실시한 처리물을, 통상적 방법(액체 크로마토그래피나 황산암모늄 분획 등)에 의해서 제조한 조분획 효소나 정제 효소로서, 필요로 하는 능력을 갖는 것이라면, 이것을 사용하더라도 양호하다.

또한, 상기 배양물 또는 이의 처리물을 이용할 때, 이들을 카라기난 겔이나 폴리아크릴아미드에 포함시키거나, 또는 폴리에테르 설폰이나 재생 셀룰로스 등의 막에 고정화하여 사용하는 것도 가능하다.

반응 ③에 있어서, 기질이 되는 치환 α-케토산으로는, 화학식 1의 치환 α-케토산을 들 수 있다.

반응계에, 반응촉진물질로서, 조효소, 계면활성제, 유기 용매 등을 함유시킬 수 있다. 예를 들면, 기질이 되는 치환 α-케토산의 균체내로의 투과성을 높이기 위해서, 트라이톤 X(Triton X)나 트윈(Tween) 등의 계면활성제나 톨루엔, 크실렌 등의 유기용매를 이용할 수 있다. 또한, 피리독살-5-인산 등의 조효소류를 상기 배지에 첨가할 수 있다.

또한, 효소를 생산하기 위한 배양과 반응 ③을 분할하여 순차적으로 실시하는 경우는, 후자의 반응 ③의 공정에서는 반드시 호기적 분위기하에서 반응을 실시할 필요는 없으며, 오히려 혐기적 분위기하에서, 또는 질소 기체 치환, 아르곤 기체 치환, 아황산나트륨 첨가 등에 의해서 반응액 중의 용존 산소를 제거한 시스템에서 반응을 실시하는 것도 가능하다. 반응 온도에 관해서는, 통상적으로 이용하는 효소가 활성을 갖는 범위내, 즉 바람직하게는 10 내지 50℃에서 실시되지만, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 37℃의 범위에서 이루어진다. 반응 용액의 pH값에 관해서는, 통상적으로 2 내지 12, 바람직하게는 6 내지 11, 더욱 바람직하게는 7 내지 9의 범위에서 조절된다. 반응 시간에 관해서는, 통상적으로 1 내지 120시간 정도, 바람직하게는 1 내지 72시간 정도, 더욱 바람직하게는 1 내지 24시간 정도가 선택된다.

또한, 배양액 또는 반응액 중의 글루탐산 유도체 또는 치환 α-케토산을 정 량하는 경우, 주지의 방법을 사용하여 신속하게 측정할 수 있다. 즉, 간편하게는 Merck사 제조의「Silica gel 60F254」등을 이용한 박층 크로마토그래피를 이용할 수 있으며, 보다 분석 정밀도를 높이기 위해서는, 지엘사이언스(GL Science)사 제조의「Inertsil ODS-80A」이나 다이셀카가쿠고교(주) 제조의「CROWNPAK CR(+)」등의 광학분할 칼럼을 이용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하면 양호하다. 이렇게 하여, 배양액 또는 반응액 중에 축적된 글루탐산 유도체는, 통상적인 방법에 의해 배양액 또는 반응액 중에서 채취하여 사용할 수 있다. 배양액 또는 반응액 중에서의 채취는, 이러한 경우에 당해 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 주지의 수단, 예를 들면 여과, 원심분리, 진공농축, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 결정화 등의 조작이 필요에 따라 적절하게 조합되어 사용된다.

한편, 목적하는 글루탐산 유도체는 유리체의 형태로 취득할 수 있지만, 필요에 의해 염의 형태로 취득할 수도 있다. 염의 형태로서는 염기와의 염을 들 수 있다. 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등의 무기염기, 암모니아, 각종 아민 등의 유기 염기를 들 수 있다.

이하에 실시예를 개시하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에만 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

실시예 1은 본 발명의 반응 ①에 관한 것이다. 또, 실시예 1에 있어서의 L- 트립토판, 인돌-3-피루브산 및 인돌아세트산의 정량은 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: Inertsil ODS-2(4.6 ×250mm), 칼럼온도: 40℃, 용출액: 0.1M KH₂PO₄-H₃PO₄(pH= 2.8O)/CH₃CN=1/9 내지 5/5, 유속 1.0ml/min, 검출: UV 210nm)에 의해 실시하였다.

(1-1) 아미노산 옥시다제 활성균의 균체반응에 의한 L-Trp으로 부터 인돌-3-피루브산의 생성

효모 엑기스 1g/dl, 폴리펩톤 1g/dl, (NH₄)₂SO₄ O.3g/dl, K₂HPO ₄ O.3g/dl, KH₂PO₄ O.1g/dl, MgSO₄·7H₂O 0.05g/dl, FeSO₄·7H ₂O 1mg/dl, MnSO₄·4H₂O 1mg/dl을 포함하는 50ml의 배지(pH 7.O)를 500ml용 판구(Sakaguchi) 플라스크에 넣고, 110℃에서 10분 동안 살균하였다.

이러한 배지에 미리 부이욘(bouillon) 한천 배지에서 30℃에서 24시간 동안 배양한 아크로모박터 종 AJ2425, 프로테우스 레트게리 IFO135O1 또는 모르가넬라 모르가니 IFO3168의 균체를 각각 1 백금이(白金耳)(loop)의 양으로 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양후, 배양물에서 균체를 원심분리에 의해 모으고, 각각 50ml의 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.6)으로 세정하고, 다시 원심분리에 의해 세정된 균체를 제조하였다.

이러한 습윤 균체를 L-트립토판 1g/dl, 20mM Tris-HCl 완충 용액(pH 8.0)으로 이루어진 반응액에 습윤 균체 중량이 1%(w/v)가 되도록 첨가하였다. 이러한 반응액 1ml를 5ml용 시험관에 옮기고 30℃에서 1시간 동안 진탕시켜 반응시켰다. 반응 종료후, 인돌-3-피루브산(IPA)의 생성량, L-트립토판(L-Trp)의 잔존량 및 인돌아세트산(IAA)의 부수적 생성량을 측정하였다(표 1 참조).

L-트립토판으로 부터 생성된 인돌피루브산의 양

균체	L-Trp (g/dl)	IPA (g/dl)	IAA (g/dl)
아크로모박터 종 AJ2425	0.02	0.97	0.03
프로테우스 레트게리 IFO13501	0	0.98	0.03
모르가넬라 모르가니 IFO3168	0	0.99	0.02

그 결과, 세정된 균체와의 반응을 실시한 구중 어떤 실험구에서도, 0.97 내지 0.99g/dl의 인돌-3-피루브산이 축적되었으며, 1g/dl의 L-트립토판으로부터 거의 정량적으로 인돌-3-피루브산이 생성되었다.

(1-2) 모르가넬라 모르가니 IFO3168의 세정된 균체 반응액의 질소치환 처리 및 염산 결정석출에 의한 인돌-3-피루브산의 채취

(a) 모르가넬라 모르가니 IF03168의 세정된 균체 반응액의 제조

(1-1)과 동일한 방법으로 모르가넬라 모르가니 IF03168의 세정된 균체를 제조하였다. L-트립토판 1g/dl, 20mM Tris-HCl 완충 용액(pH 8.0)으로 이루어진 반응액 50ml을 포함하는 판구 플라스크를 6개 제조하고, 각각 제조한 습윤 균체를 습윤 균체 중량이 1%(w/v)가 되도록 첨가하여, 30℃에서 1시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응 종료후, 원심분리에 의해서 균체를 제거하고, 반응액을 약 290ml 수득하였다.

(b) 반응액의 질소치환 및 산 결정석출에 의한 인돌-3-피루브산의 채취

(a)에서 수득된 반응액중 74ml을 가지달린 플라스크에 옮기고, 질소치환을 실시하였다. 당해 반응액의 pH값을 2 이하로 조정하기 위해 염산을 첨가하였다. 당해 반응액 74ml에 6N 염산 15ml을 첨가하고(염산의 최종 농도로서 약 1N), 20℃에서 교반하였다. 이러한 조작에 의해서 결정이 석출되었다. 24시간후, 당해 혼합물을 여과하고, 15ml의 물로 결정을 세정하였다. 이렇게 하여 수득된 습윤 결정을 40℃에서 감압건조시키고, 인돌-3-피루브산 684mg을 취득하였다(출발 트립토판에 대한 수율은 79.5%). 당해 인돌-3-피루브산은 황백색 결정이며, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 함량은 97.2중량%이였다.

(c) 반응액의 산 결정석출에 의한 인돌-3-피루브산의 채취

(a)에서 수득된 반응액중 66ml을 가지달린 플라스크에 옮기고, 당해 반응액의 pH값을 2 이하로 조정하기 위해서 6N 염산 13ml을 첨가하여, 20℃에서 교반하였다. 이러한 조작에 의해 결정이 석출되었다. 24시간후, 당해 혼합물을 여과하여, 13ml의 물로 결정을 세정하였다. 이렇게 하여 수득된 습윤 결정을 40℃에서 감압건조시키고, 인돌-3-피루브산 538mg을 취득하였다(출발 트립토판에 대한 수율 58.2%). 당해 인돌-3-피루브산은 갈색 결정이고, HPLC 분석에 의해 함량은 80.5중량%이였다.

(d) 수득된 인돌-3-피루브산의 비교

(b) 및 (c)에서 수득된 인돌-3-피루브산(IPA)의 결정 품질을 비교하였다(표 2 참조).

이러한 결과로부터 밝혀지는 바와 같이, 질소치환을 실시한 구(b) 쪽이 명백하게 결정중의 IPA의 함량이 많으며, 불순물인 부수적으로 생성된 인돌아세트산(IAA)의 함량이 감소하였다. 또한, 결정의 착색도 질소치환을 실시한 구에서는 억제되었고, 각각의 실험구의 결정을 10mg/dl로 희석하여 450nm 및 400nm에서의 투과율을 측정한 결과, 질소치환구에서 투과율의 감소, 즉 분해에 의한 착색이 억제되고 있다는 것이 확인되었다.

IPA의 결정 품질

	질소 치환 있음 (b)	질소 치환 없음 (c)
결정중의 IPA 함량	97.30%	80.50%
결정중의 IAA 함량	0.18%	1.54%
결정의 색	황백색	갈색
투과율(450nm)	96.9%T	82.9%T
투과율(400nm)	94.1%T	75.9%T

이상의 결과로부터 밝혀지는 바와 같이, 트립토판으로부터 인돌-3-피루브산을 효율적으로 간편하게 제조할 수 있다.

실시예 2

실시예 2는, 반응 ②를 화학합성계를 사용하여 실시한 것이다.

(2-1) 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)의 합성

수산화칼륨 18.91g(286.5mmol, 함량 85중량%)을 용해한 물 64.45ml에, 인돌-3-피루브산 7.50g(35.8mmol, 함량 97.0중량%)과 옥살로아세트산 14.18g(107.4mmol)을 가하여 용해시켰다. 이 혼합 용액을 35℃에서 24시간 동안 교반하였다.

또한, 3N-염산 40.0ml을 가하고 중화(pH=7.0)하여, 153.5g의 반응 중화액을 수득하였다. 당해 반응 중화액에는, IHOG이 5.55g 포함되어 있으며, 수율은 53.3%(대 인돌-3-피루브산)이였다.

당해 반응 중화액에 물을 가하여 168ml로 하고, 합성 흡착제[참조: 미쓰비시카가쿠 제조 DIAION-SP207] 840ml로 충전된 수지 칼럼(지름 4.8cm)에 통과시켰다. 또한, 유속 23.5ml/분으로 순수한 물을 당해 칼럼에 통과시키고, 1.73 내지 2.55(L/L-R)를 수집함으로써, 고순도의 IHOG 3.04g을 포함하는 수용액을, 수율 54.7%(수지에 대한 투입량에 대하여)로 수득하였다.

(NMR 측정)

(2-2) 4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(PHOG)의 합성

수산화칼륨(순도 85%) 13.8g를 용해한 물 25ml에 대하여 페닐피루브산 5.0g(30.5mmol), 옥살로아세트산 12.1g(91.4mmol)을 가하여 실온에서 72시간 동안 반응시켰다. 농축 염산을 사용하여 반응액의 pH값을 2.2로 조절하며, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수황산마그네슘으로 건조를 실시한 후에, 농축하여 잔사를 수득하였다. 잔사를 아세트산에틸과 톨루엔으로부터 재결정하고, PHOG 2.8g(11.3mmol)를 결정으로서 수득하였다.

(NMR 측정)

(분자량 측정)

ESI-MS 계산값: C₁₂H₁₂O₆=252.23, 분석값: 251.22(MH^-)

실시예 3

실시예 3은, 반응 ②를 효소계를 사용하여 실시한 것이다. 또한, 실시예 3에 있어서, 기질로서 사용한 IHOG 및 PHOG은, 실시예 2에 기재된 방법에 의해 합성한 것이다.

(3-1) PHOG 알돌라제 활성균의 채취

4-페닐메틸-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(PHOG)을 기질로 한 알돌라제 활성 균주의 채취를 실시하였다.

부이욘 평판 배지[참조: 에이켄카가쿠]에 시험 미생물(세균·효모)을 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이들을 글리세롤 0.5g/dl, 푸마르산 0.5g/dl, 효모 엑기스 0.3g/dl, 펩톤 0.2g/dl, 황산암모늄 0.3g/dl, K₂HPO₄ 0.3g/dl, KH₂PO₄ 0.1g/dl, MgSO₄·7H₂O 0.05g/dl, 프탈산나트륨 0.25g/dl, 분말 한천 2g/dl(pH 6.5)을 포함하는 플레이트에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득된 균체를 습윤 균체 중량으로 약 1%(w/v)가 되도록, 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM PHOG, 1mM MgCl₂, 5mM 인산칼륨용액(KPi), 1%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 당해 반응액 중의 유리 피루브산 농도는 락테이트 데하이드로게나제(lactate dehydrogenase)(LDH)를 사용한 효소법으로 정량하였다. 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.5mM NADH, 5mM MgCl₂, 25U/ml LDH로 이루어진 반응액 200㎕에 샘플 10㎕을 첨가하고, 30℃에서 10분 동안 배양하였다. 반응후의 340mM의 흡광도를 측정하여, NADH의 감소량으로부터 샘플중의 피루브산 량을 정량하였다.

또한 생성 페닐피루브산 량은 지엘사이언스사 제조의「Inertsil 0DS-2」(5㎛, 4.6×250mm)을 이용한 HPLC 분석으로 정량하였다. 분석 조건은, 이하에 나타내는 바와 같다.

이동상: 20%(v/v) 아세토니트릴/0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산 수용액

유속: 1ml/min

칼럼 온도: 40℃

검출: UV 210nm

본 조건에 의해, PHOG는 유지시간 약 9.8분에, 페닐피루브산은 유지시간 약 12분에 용출되며, 각각 분별, 정량할 수 있다.

시험 균체 첨가구에 있어서 PHOG에서 생성된 피루브산 내지 페닐피루브산량에서 대조구(균체 무첨가구)의 생성량을 뺀 값을 알돌라제에 의한 생성량으로 하였다. 그 결과, 표 3에 기재된 균주에 있어서 PHOG를 기질로 하는 알돌라제 활성을 밝혀냈다.

PHOG 알돌라제 활성 균주의 스크리닝 결과

균주	피루브산(mM)	페닐피루브산(mM)
슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683	34.9	35.0
슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791	33.6	33.9
슈도모나스 데스몰리티카 AJ1582	1.1	2.9
에르위니아 종 AJ2917	0.8	3.0
플라보박테리움 레나눔 AJ2468	3.0	6.1
크산토모나스 시트리 AJ2797	1.0	3.2

슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683을 선발하여, 페닐피루브산과 옥살로아세트산 내지 피루브산으로부터의 PHOG의 합성반응을 검토하였다. 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM 페닐피루브산, 1mM MgCl₂, 5mM KPi, 100mM 옥살로아세트산 내지 피루브산, 1%(w/w) 톨루엔으로 이루어진 반응액에, 피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683(AJ2212)균체를 최종 농도가 약 1%(w/v)이 되도록 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 생성 PHOG량을 HPLC로 정량하였다. 페닐피루브산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터의 PHOG의 생성량을 표 4에 기재하였다.

페닐피루브산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로 부터의 PHOG의 생성량

	옥살아세트산 구	피루브산구
균체 첨가 구	14.3(mM)	9.3(mM)
대조 구(Mg 첨가)	8.6	1.7
대조 구(Mg 무첨가)	미량	N.D.

표 4로부터 균체 첨가구에서 PHOG의 생성량의 증가가 확인되며, 페닐피루브산+옥살로아세트산 및 페닐피루브산+피루브산 중 어느 조합에 있어서도 당해 알돌라제의 작용에 의해 PHOG가 생성된다는 것이 밝혀졌다.

(3-2) 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683주로 부터 유래된 IHOG 알돌라제의 정제

피. 태트롤렌스 ATCC4683주의 가용성 분획으로부터 IHOG 알돌라제의 정제를 이하와 같이 실시하였다. 알돌라제 활성측정은, PHOG을 기질로 하는 알돌 분해활성을 이하의 조건으로 측정하였다.

반응조건: 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 2mM PHOG, 0.2mM NADH, 0.2mM KPi, 1mM MgCl₂, 16U/ml 락테이트 데하이드로게나제, 3㎕ 효소/600㎕ 반응액, 30℃, 340nm의 흡광도를 측정

1. 가용성 분획의 제조:

부이욘 평판 배지에서 30℃, 24시간 동안 배양한 피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683 균체의 1 백금이(loop)를 채취하여, 50ml의 효소 생산배지(0.5g/dl 글리세롤, 0.5g/dl 푸마르산, 0.5g/dl 황산암모늄, 0.3g/dl K₂HPO₄, 0.1g/dl KH₂PO₄, 0.05g/dl MgSO₄·7H₂ O, 0.3g/dl 효모 엑기스, 0.2g/dl 펩톤, O.25g/dl 프탈산나트륨, O.005% Antifoam A[참제: 시그마사 제조], KOH로 pH 6.5로 조정)를 포함하는 500ml용 플라스크에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 당해 배양액 0.5ml을 효소 생산배지 50ml을 포함하는 500ml용 플라스크 40개에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 수득된 배양액으로부터 원심분리에 의해 집균하고, 완충제 A(20mM Tris-HCl(pH 7.6))에 현탁하여 세정한 후, 다시 원심분리로 집균하였다. 수득된 세정된 균체를 200ml의 완충제 A에 현탁하고, 4℃에서 30분 동안 초음파 파쇄하였다. 파쇄액을 원심분리(×8000rpm, 10분간×2회)로 균체 잔사를 제거하고, 다시 초원심분리(×50000rpm, 30분간)하여, 수득된 상청액을 가용성 분획으로 정하였다.

2. 음이온 교환 크로마토그래피: Q-세파로스(Q-Sepharose) FF

상기의 가용성 분획 80ml을 완충제 A로 평형화한 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 Q-세파로스 FF 26/10[참조: 파마시아사 제조, CV=20ml]로 처리하여 담체에 흡착시켰다. 담체에 흡착되지 않은 단백질(비흡착 단백질)을 완충제 A를 사용하여 세정한 후, KCl 농도를 0M에서 0.7M까지 직선적으로 변화시켜 (총 140ml) 흡착된 단백질의 용출을 실시하였다. 각 용출 분획에 관해서 PHOG 알돌라제 활성을 검출한 결과, 약 0.5M 상당의 분획에 PHOG 알돌라제 활성의 피크를 검출하였다. 동일한 크로마토그래피 조작을 두번 반복하여 실시하였다.

3. 소수성 크로마토그래피: 페닐 세파로스 HP HR 16/10

알돌라제 활성이 검출된 용액을 완충제 B(50mM Tris-HCl(pH 7.6), 1M 황산암모늄, pH 7.6)에 대하여 4℃에서 밤새 투석하고 0.45㎛의 필터로 여과하였다. 수득된 여과액을, 완충제 B로 평형화한 소수성 크로마토그래피 칼럼 페닐 세파로스 HP HR 16/10[참조: 파마시아사 제조]로 처리하였다. 이러한 조작에 의해 알돌라제는 담체에 흡착되었다.

담체에 흡착되지 않은 비흡착 단백질을 완충제 B를 사용하여 세정한 후, 황산암모늄 농도를 1M에서 0M까지 직선적으로 변화시켜 알돌라제를 용출시켰다. 수득된 각 용출 분획에 관해서 알돌라제 활성을 측정하고, 황산암모늄 농도가 약 0.2M인 용출 위치에 알돌라제 활성이 확인되었다.

4. 겔 여과 크로마토그래피: 세파덱스(Sephadex) 200 HP 16/60

알돌라제를 포함하는 분획을 각각 수집하여, 완충제 A에 대하여 투석하고, 0.45㎛의 필터로 여과하였다. 수득된 여과액을, 한외여과막 centriprep 1O를 사용하여 농축하였다. 수득된 농축액을, 완충제 C(20mM Tris-HCl(pH 7.6), 0.1M KCl)로 평형화된 겔 여과 Sephadex 20O HP 16/60[참조: 파마시아사 제조]로 처리하고, 1ml/mim의 유속으로 용출시켰다. 이러한 조작에 의해 알돌라제는 66-71ml의 분획으로 용출되었다. 활성 피크의 용출 위치로부터 당해 알돌라제의 분자량은 약 146kDa라고 추정되었다.

5. 음이온 교환 크로마토그래피: Mono Q HR5/5

수득된 분획을 0.45㎛의 필터로 여과하였다. 여기서 수득된 여과액을, 완충제 A로 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼 Mono-Q HR 5/5[참조: 파마시아사 제조]로 처리하였다. 이러한 조작에 의해, 알돌라제는 담체에 흡착되었다. 완충제 A에 의해 비흡착 단백질을 세정한 후, KCl 농도를 직선적으로 0mM에서 700mM으로 변화시켜 단백질을 용출시켰다(총 24ml). 각 용출 분획에 관해서 알돌라제 활성을 측정하고, KCl 농도가 약 0.4M인 용출 위치에 알돌라제 활성이 확인되었다.

6. 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피: CHT-II

수득된 분획을 완충제 D(10mM 인산칼륨 완충제(pH 7.0))에 4℃에서 밤새 투석하고, 0.45㎛의 필터로 여과하였다. 여기서 수득된 여과액을 완충제 D로 평형화된 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피 칼럼 CHT-II 5ml[참조: BioRad사 제조]로 처리하였다. 이러한 조작에 의해, 알돌라제는 담체에 흡착되지 않으며, 흡착 단백질과 분리할 수 있었다.

이상의 칼럼 크로마토그패피 조작에 의해 정제한 분획을 SDS-PAGE로 처리한 결과, 약 25kDa에 상당하는 위치에 거의 단일한 밴드로서 검출되었다. 겔 여과 크로마토그래피에서의 추정 분자량이 약 146kDa인 점에서, 당해 알돌라제는 6량체를 형성하고 있을 것으로 추정되었다. 정제표를 표 5에 기재하였다.

(3-3) IHOG 알돌라제의 내부 아미노산 서열의 결정

정제한 알돌라제 약 2㎍분을 SDS-PAGE로 처리한 후, SDS-PAGE 겔중의 시료를 트립신 처리하고 (pH 8.5, 35℃, 20시간), 역상 HPLC로 처리하여 단편 펩타이드를 분리하였다. 분취한 분획중, 2개의 분획에 관해서 각각 20잔기, 12잔기 분의 아미노산 서열(서열번호 4, 5)을 하기와 같이 결정하였다.

(3-4) 피. 태트롤렌스( P. taetrolens ) ATCC4683주로 부터 유래된 IHOG 알돌라제 유전자의 클로닝

1. 염색체 DNA의 제조

피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683주를 50ml의 부이욘 배지를 사용하여 30℃에서 밤새 배양하였다(전(pre)배양). 당해 배양액 5ml을 종균으로서, 50ml 의 부이욘 배지를 사용하여 본 배양을 실시하였다. 대수 증식 후기까지 배양한 후, 배양액 50ml을 원심분리조작(12000 ×g, 4℃, 15분간)으로 처리하여 집균하였다. 당해 균체를 사용하여 통상적 방법에 따라서 염색체 DNA를 제조하였다.

2. PCR에 의한 내부서열의 취득

결정된 IHOG 알돌라제의 내부 아미노산 서열에 기초하여, 이하의 혼합 프라이머(mix primer)(서열번호 6, 7)를 합성하였다.

제작한 혼합 프라이머를 사용하여 피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683의 염색체 DNA를 주형으로서 PCR에 의한 증폭을 실시하였다. PCR 반응은, PCR Thermal PERSONEL[참조: TaKaRa사 제조]를 사용하여 실시하며, 이하의 조건으로 30사이클 수행하였다:

94℃ 30초

55℃ 30초

72℃ 1분.

PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 처리한 결과, 약 500bp의 단편의 증폭이 확인되었다. 당해 DNA 단편을 pUC18에 클로닝하여, 염기 서열을 결정한 결과, 취득한 DNA 단편으로부터 추정되는 아미노산 서열이, IHOG 알돌라제의 내부 아미노산 서열과 일치하고 있어, 목적하는 알돌라제 유전자가 취득된 것이 확인되었다.

3. 콜로니 하이브리드화에 의한 전장 유전자의 취득

PCR에서 증폭된 DNA 단편을 사용하여, 서던(Southern) 분석 및 콜로니 하이브리드화에 의해서 전장 유전자를 취득하였다. DNA 프로브의 제작은 DIG High Prime[참조: 로슈다이아그노스틱사 제조]를 사용하여, 설명서대로 37℃에서 밤새(O/N) 배양하여 프로브를 표지하였다. 서던 분석은 염색체 DNA 1㎍를 각종 제한효소로 완전히 소화하고 0.8% 아가로스 겔로 전기영동한 후에, 나일론 막에 블로팅하여, 이하 매뉴얼에 따라서 실시하였다. 하이브리드화는 DIG Easy Hyb[참조: 로슈다이아그노스틱사 제조]를 사용하여 수행하며, 50℃에서 1시간 동안 프레-하이브리드화를 실시한 후에 프로브를 첨가하여, O/N에서 하이브리드화시켰다. 밴드의 검출은 DIG 뉴클레오티드 검출 키트(DIG Nucleotide Detection Kit)를 사용하여 실시하였다. 그 결과, 당해 PCR 단편을 프로브로서 강하게 하이브리드화하는 약 4kbp의 PstI 단편을 검출하였다. 다음에, 당해 PstI 단편을 콜로니 하이브리드화로 취득하였다. 염색체 DNA 20㎍를 PstI로 처리한 후 아가로스 겔 전기영동으로 처리하여 약 4kbp 크기의 단편을 회수하였다. 이것을 pUC118에 연결하고, 이. 콜리(E. coli) JM109로 라이브러리를 제작하였다. 콜로니를 나일론 막 필터[참조: Hybond-N, 아마샴사 제조]로 옮기고 알칼리 변성, 중화, 고정화 처리를 실시하였다. 하이브리드화는 DIG Easy Hyb를 사용하여 실시하였다. 필터를 완충제 중에 침지시키고, 42℃에서 1시간 동안 프레하이브리드화를 실시하였다. 그 다음, 작성한 표식 프로브를 첨가하여, 42℃에서 16시간 동안 하이브리드화를 실시하였다. SSC로 세정한 후, 프로브와 하이브리드화하는 콜로니의 검출을 DIG 뉴클레오티드 검출 키트[참조: 로슈다이아그노스틱사 제조]를 사용하여 실시하였다. 그 결과, 프로브와 강하게 하이브리드화하는 클론을 취득하였다.

취득한 클론에서 회수한 플라스미드 DNA의 염기 서열을 결정한 결과, 서열번호 1에 기재된 염기 서열을 갖는 것이 밝혀졌다. 결정된 내부 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열(서열번호 1에서 507 내지 566번째 및 1046 내지 1082번째)을 포함하는 678bp의 orf를 밝혀내고, 목적하는 알돌라제의 전장을 취득하였다.

4. 이.콜리에서의 lHOG 알돌라제의 발현 (1)

표 8에 기재된 프라이머(서열번호 8 및 9)를 사용하여 피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683 염색체 DNA로 부터 증폭된 단편을 BamHI/HindIII로 소화하여, pUC18의 BamHI/HindIII 부위에 삽입한 플라스미드 pUCALD를 구축하였다. 구축된 발현 플라스미드를 이.콜리 JM109에 도입하고, 형질전환체를 50㎍/ml 암피시린을 포함하는 LB 배지에서 하루 종일 37℃에서 진탕시켰다(전배양). 전배양액을 50ml의 LB 배지에 1% 씨딩(seeding)하고, 37℃에서 본 배양을 실시하였다. 배양 개시 약 2시간 후에 최종 농도 1mM이 되도록 IPTG을 첨가하고, 추가로 3시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 집균 및 세정을 실시하고, 1ml의 20mM Tris-HCl(pH 7.6)에 현탁하여, 멀티-비드-쇼커(Multi-Bead-Shocker)[참조: 야스이키카이사 제 조]를 사용하여 균체를 파쇄하였다. 파쇄액을 15000rpm에서 10분 동안 원심분리한 상청액을 조효소액으로 정하였다.

당해 조효소액을 사용하여 PHOG를 기질로 한 알돌라제 활성을 측정한 결과, pUC18를 도입한 이.콜리(대조군)에 있어서는 PHOG 알돌라제 활성은 검출되지 않은데 비해, pUCADL 도입주에 있어서는 0.81U/mg 단백질의 PHOG 알돌라제 활성이 검출되었다. 이에 의해, 당해 유전자가 목적하는 알돌라제를 암호화하고 있는 것이 나타난다.

(3-5) 알돌라제 발현주를 사용한 인돌-3-피루브산과 피루브산으로부터의 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)의 합성

(3-4)에서 제작한 알돌라제 발현 이.콜리의 세정된 균체를 효소원으로서 사용하여, 인돌-3-피루브산과 피루브산으로부터의 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산(IHOG)의 합성을 실시하였다. IHOG의 정량은 지엘사이언스사 제조의「Inertsil ODS-2」(5㎛, 4.6 ×250mm)을 이용한 HPLC 분석으로 정량하였다. 분석 조건은, 이하에 나타내는 바와 같다.

이동상: 40%(v/v) 아세토니트릴/5mM 인산 2수소테트라부틸암모늄 용액

유속: 1ml/min

칼럼 온도: 40℃

검출: UV210nm

100mM 완충제(Tris-HCl 8.0, 9.0 내지 Glycine-NaOH 10.0), 50mM 인돌-3-피루브산, 250mM 피루브산, 1mM MgCl₂, 1%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액에 알돌라제 발현 이.콜리의 세정된 균체를 10%(w/v)가 되도록 첨가하여, 33℃에서 4시간 동안 진탕 반응시켰다. 효소 반응액을 적절하게 희석하여 생성된 IHOG를 정량하였다.

알돌라제에 의한 IHOG의 생성량

pH	알돌라제	IHOG(mM)
8	+	9.2
8	-	0.42
9	+	12.1
9	-	1.6
10	+	10.7
10	-	5.4

그 결과, 알돌라제 발현 이.콜리 첨가구에서, IHOG 생성량이 증가하고 있으며 당해 알돌라제에 의해 IHOG를 생성시킬 수 있다.

(3-6) 이.콜리에서의 IHOG 알돌라제의 대량 발현 (2)

1. trp 프로모터 및 rrnB 터미네이터 보유 플라스미드 pTrp4의 구축

이.콜리 W3110 염색체 DNA 위의 trp 오페론의 프로모터 영역을, 표 10에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서(서열번호 10 및 11의 조합) 사용하여 PCR 에 의해 목적 유전자 영역을 증폭시키고, 수득된 DNA 단편을 pGEM-Teasy 벡터[참조: 프로메가 제조]에 라이게이션(ligation)하였다. 라이게이션 용액으로 이.콜리 JM109를 형질전환하고 암피시린 내성주 중에서 trp 프로모터의 방향이 lac 프로모터와 반대 방향으로 삽입된 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하였다. 다음에 당해 플라스미드를 Eco0109I/EcoRI로 처리하여 수득되는 trp 프로모터를 포함하는 DNA 단편과, pUC19[참조: Takara 제조]의 Eco0109I/EcoRI 처리물과 라이게이션하였다. 당해 라이게이션 용액으로 이.콜리 JM109를 형질전환하여 암피시린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하고, 플라스미드를 pTrp1로 명명하였다. 다음에 pKK223-3[참조: Amersham Pharmacia 제조]를 HindIII/HincII로 처리하고, 수득된 rrnB 터미네이터를 포함하는 DNA 단편과 pTrp1의 HindIII/PvuII 처리물과 라이게이션하였다. 이러한 라이게이션 용액으로 이.콜리 JM109를 형질전환하여 암피시린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하고, 플라스미드를 pTrp2로 명명하였다. 다음에 pTrp2를 주형으로 하여 표 10에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머(서열번호 10 및 12의 조합)로서 사용하여 PCR에 의해 trp 프로모터 영역을 증폭시켰다. 당해 DNA 단편을 Eco0109I/NdeI에 의해 처리하고, pTrp2의 Eco0109I/NdeI 처리물과 라이게이션하였다. 이러한 라이게이션 용액으로 이.콜리 JM109를 형질전환하고, 암피시린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 갖는 주를 선택하고, 당해 플라스미드를 pTrp4로 명명하였다.

2. 알돌라제 유전자 발현 플라스미드 ptrpALD1, ptrpALD2의 구축과 이. 콜리에서의 발현

표 11에 기재된 프라이머(서열번호 9 및 13)을 사용하여 피. 태트롤렌스(P. taetrolens) ATCC4683 염색체 DNA로 부터 증폭된 단편을 NdeI/HindIII로 소화하여, pTrp4의 NdeI/HindIII 부위에 삽입한 플라스미드 ptrpALD1를 구축하였다. 이러한 플라스미드는 서열번호 1에 기재된 염기 서열중 444번째의 ATG를 해독 개시 코돈으로서 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 알돌라제 유전자를 발현한다. 또한, 프라이머(서열번호 9 및 14)를 사용하여 피. 태트롤렌스 ATCC4683 염색체 DNA로 부터 증폭된 단편을 NdeI/HindIII로 소화하여, pTrp4의 NdeI/HindIII 부위에 삽입한 플라스미드 ptrpALD2를 구축하였다. 이러한 플라스미드는 서열번호 1에 기재된 염기 서열중 456번째의 ATG를 해독 개시 코돈으로서 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 알돌라제 유전자를 발현한다. 각각 구축된 발현 플라스미드를 이.콜리 JM109에 도입하고, 형질전환체를 50㎍/ml 암피시린을 포함하는 LB 배지에서 하루종일 37℃에서 진탕시켰다(전배양). 전배양액을 50ml의 LB 배지에 1% 씨딩하고, 37℃에서 본 배양을 실시하였다. 배양 개시 약 2시간 후에 최종 농도 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 추가로 3시간 동안 배양을 실시하였다. 배양종료후, 집균 및 세정하고, 1ml의 20mM Tris-HCl(pH 7.6)에 현탁하여, 멀티-비드-쇼커[참조: 야스이키카이사 제조]를 사용하여 균체를 파쇄하였다. 파쇄액을 15000rpm으로 10분 동안 원심분리한 상청액을 조효소액으로 정하였다.

당해 조효소액을 사용하여 PHOG를 기질로 한 알돌라제 활성을 측정한 결과, pTrp4를 도입한 이.콜리(대조군)에 있어서는 PHOG 알돌라제 활성은 검출되지 않는데 비해, ptrpADL1 도입주에 있어서는 16.1U/mg 단백질의 PHOG 알돌라제 활성이, ptrpADL2 도입주에 있어서는 36.0U/mg 단백질의 PHOG 알돌라제 활성이 검출되었다. 이에 의해, 서열번호 2 내지 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 알돌라제 중 어느 것이라도 알돌라제 활성을 갖고 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 4

실시예 4는, 본 발명의 반응 ③에 관한 것이다. 또, 실시예 4에 있어서, 모나틴 및 4-페닐메틸-4-하이드록시-글루탐산(PHG)의 정량은, 지엘사이언스사 제조의 「Inertsil 0DS-80A」 (5㎛, 6 ×150mm)를 이용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 실시하였다. 분석조건은, 이하에 나타내는 바와 같다.

이동상: 12%(v/v) 아세토니트릴/0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산 수용액;

유속: 1.5ml/min;

칼럼 온도: 30℃; 및

검출: UV 210nm.

본 분석 조건에 의해, (2S,4S)-모나틴 및 (2R,4R)-모나틴은 12.1분, (2S,4R)-모나틴 및 (2R,4S)-모나틴은 9.7분, (2S,4S)-PHG 및 (2R,4R)-PHG는 7.2분, (2S,4R)-PHG 및 (2R,4S)-PHG는 6.0분의 보유 시간으로 분별 정량할 수 있다.

또한, 필요에 따라, 다이셀카가쿠고교 제조의 광학분할 칼럼「CROWNPAK CR(+)」(4.6 ×150mm)를 이용한 고속 액체 크로마토그래피에 의한 분석도 실시하였다. 분석조건은 이하에 나타내는 바와 같다.

(모나틴의 경우)

이동상: 과염소산 수용액(pH 1.5)/10%(v/v) 메탄올;

유속: 0.5ml/min;

칼럼 온도: 30℃; 및

검출: UV 210nm.

본 조건에 의해 모나틴 광학이성체는 (2R,4S), (2R,4R), (2S,4R) 및 (2S,4S)의 순서로 42분, 57분, 64분 및 125분의 보유 시간으로 분별 정량할 수 있다.

(PHG의 경우)

이동상: 과염소산 수용액(pH 1.5);

유속: 1ml/min;

칼럼 온도: 30℃; 및

검출: UV 210nm.

본 조건에 의해 PHG의 광학이성체는 (2R,4S), (2R,4R), (2S,4R) 및 (2S,4S)의 순서로 20분, 28분, 31분, 및 46분의 보유 시간으로 분별 정량할 수 있다.

(4-1) L-아미노산 트랜스아미나제에 의한 (2S,4S)-모나틴의 제조

부이욘 평판 배지[참조: 에이켄카가쿠]에 하기 표 12에 기재하는 미생물을 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균체를 채취하고, 이것을 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 30mM IHOG, 100mM L-글루탐산 1나트륨, 1mM 피리독살-5'-인산 및 0.5(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에 5중량% 습윤 균체가 되도록 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 반응 종료후에 생성된 모나틴을 정량하였다. 그 결과는 표 12와 같고, IHOG에서 (2S,4S)-모나틴을 생성시킬 수 있다.

균주	생성된 모나틴(mM)
에어로모나스 하이드로필라 IFO3820	1.2
아그로박테리움 튜머파시엔스 IF3058	1.9
알칼리게네스 패칼리스 ATCC8750	1.6
베이예린키아 인디카 ATCC9037	0.2
에세리키아 콜리 ATCC12814	0.6
프로테우스 레트게리 IFO13501	0.7
모르가넬라 모르가니 IFO3848	1.2

(4-2) L-아미노산 트랜스아미나제에 의한 (2S,4S)-PHG의 제조

부이욘 평판 배지[참조: 에이켄카가쿠]에 하기 표 13에 기재된 미생물을 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 균체를 채취하여 이것을 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 30mM PHOG, 100mM L-글루탐산 1나트륨 또는 L-아스파라긴산 1나트륨, 1mM 피리독살-5'-인산, 및 0.5(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에 5중량% 습윤 균체가 되도록 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 반응 종료후에 생성된 PHG를 정량하였다. 그 결과는 표 13과 같으며, PHOG에서 (2S,4S)-PHG를 생성시킬 수 있다.

균주	생성된 PHG(mM)
	L-Glu	L-Asp
에어로모나스 하이드로필라 IFO3820	8.9	8.9
아그로박테리움 튜머파시엔스 IF3058	8.2	8.0
알칼리게네스 패칼리스 ATCC8750	4.9	10.7
베이예린키아 인디카 ATCC9037	7.4	2.7
에세리키아 콜리 ATCC12814	9.0	3.3
프로테우스 레트게리 IFO13501	10.2	9.0
모르가넬라 모르가니 IFO3848	10.4	5.2

(4-3) L-아미노산 트랜스아미나제에 의한 (2S,4S)-PHG의 제조

부이욘 평판 배지[참조: 에이켄카가쿠]에 하기 표 14에 기재된 미생물을 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이것을 푸마르산 0.5g/dl, 효모 엑기스 1g/dl, 펩톤 1g/dl, 황산암모늄 0.3g/dl, K₂HPO₄ 0.3g/dl, KH₂PO₄ 0.1g/dl, FeSO₄·7H₂O 1mg/dl, 및 MnSO₄·4H₂O 1mg/dl(pH 7.0)를 포함하는 배지를 50ml씩 500ml용 판구 플라스크에 나누어 주입하고, 110℃에서 10분 동안 살균한 액체 배지에 1 백금이(loop)를 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액 1ml을 원 심분리하여 수득된 균체를 20mM Tris-HCl(pH 7.6)로 세정·집균한 후에, 당해 균체를 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 50mM PHOG, 100mM L-글루탐산 1나트륨, 1mM 피리독살-5'-인산, 및 0.5(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에 현탁한 후에 10ml용 시험관에 옮기고 30℃에서 18시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응 종료후에 생성된 PHG를 정량하였다. 그 결과는 표 14와 같으며, PHOG에서 (2S,4S)-PHG를 생성시킬 수 있다.

균주	생성된 PHG(mM)
에어로모나스 하이드로필라 IFO3820	16.4
알칼리게네스 패칼리스 ATCC8750	12.3
프로테우스 레트게리 IFO13501	17.5
모르가넬라 모르가니 IFO3848	17.2

(4-4) D-아미노산 트랜스아미나제에 의한 2R-PHG의 제조

부이욘 평판 배지[참조: 에이켄카가쿠]에 하기 표 15에 기재된 미생물을 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에서 균체를 채취하고 이것을 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 50mM PHOG, 100mM D-글루탐산, 100mM D-알라닌, 1mM 피리독살-5'-인산, 및 0.5(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에 5중량% 습윤 균체가 되도록 접종하고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 반응 종료후에, 생성된 PHG를 정량하였다. 그 결과는 표 15에 기재하는 바와 같으며, PHOG에서 (2R,4S)-PHG 및 (2R,4R)-PHG를 생성시킬 수 있다.

균주	생성된 PHG(mM)
	(2R,4R)	(2R,4S)
바실러스 스패리쿠스 ATCC10208	16.6	16.5
바실러스 풀비파시엔스 AJ1327	2.8	2.6
파에니바실러스 라바에 아종 풀비파시엔스 ATCC13537	3.0	2.8
바실러스 마세란스 AJ1617*	7.1	7.0
파에니바실러스 마세란스 ATCC8244	6.5	6.5
바실러스 렌투스 AJ12699	4.6	4.6
바실러스 렌투스 ATCC10840	4.2	4.3

* FERM P-18653

(4-5) 바실러스 스패리쿠스로 부터 유래된 DAT(이하, BSDAT) 발현 이.콜리의 제작과 세정 균체 반응에 의한 2R-PHG의 제조

1. 발현 플라스미드의 구축

바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus)로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자(이하「bsdat」라고 약기한다)를 이.콜리로 발현시키기 위해서, pUC18의 lac 프로모터의 하류에 bsdat 유전자를 연결한 플라스미드 pUCBSDAT를 아래와 같이 하여 구축하였다. 우선, 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus) ATCC10208주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 하기 표 16에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR에 의해 당해 유전자를 증폭시켰다. 이에 의해, 유럽특허출원공개 0736604 본문 중, 서열번호 2에 기재된 bsdat 염기 서열에 있어서, 8번째로부터 1278번째까지에 상당하는 DNA 단편이 증폭되었다. 이러한 단편을 BamHI 및 PstI로 처리하여, pUC18의 BamHI 및 PstI 절단물과 라이게이션한 후, 이.콜리 JM109에 도입하였다. 암피시린 내성주 중에서 목적하는 플라스미드를 가진 주를 선택하여, 발현 플라스미드 pUCBSDAT를 구축하였다.

2. BSDAT 발현 이. 콜리의 제조

pUCBSDAT를 가지는 이.콜리 형질전환체 0.1mg/ml 암피시린을 포함하는 LB 배지(박토트립톤 1g/dl, 효모 엑기스 0.5g/dl 및 NaCl 1g/dl)에서 37℃, 16시간 동안 씨드(seed) 배양하였다. LB 배지 50ml을 가득 담은 500ml용 판구 플라스크에 당해 씨드 배양액을 1ml 첨가하고, 37℃에서 본 배양을 실시하였다. 배양 개시 2.5시간 후에, 최종 농도 1mM이 되도록 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 배양을 실시하였다. 수득된 배양액에 의해 집균 및 세정하고, BSDAT 발현 이.콜리를 제조하였다.

3. BSDAT 발현 이.콜리를 사용한 세정된 균체 반응

상기 2에서 제조한 균체를 100mM Tris-HCl(pH 7.6), 50mM PHOG, 100mM 아미노산 공여체(D-Glu, D-Ala, L-Glu, L-Ala), 1mM 피리독살-5'-인산, 및 0.5%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에, 습윤 균체 중량으로 5%가 되도록 현탁한 후에, 10ml용 시험관에 옮기고 30℃에서 18시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응 종료후에 생성된 PHG를 정량하였다. 그 결과는 표 17과 같으며, PHOG에서 (2R,4R), (2R,4S) 및 (2S,4S)-PHG를 생성시킬 수 있다.

(4-6) 바실러스 마세란스 AJ1617주로 부터 유래된 DAT(이하 BMDAT) 발현 이.콜리의 제작과 세정 균체 반응에 의한 2R-모나틴의 제조

1. 염색체 DNA의 제조

바실러스 마세란스 AJ1617주를 50ml의 부이욘배지를 사용하여 30℃에서 밤새 배양하였다(전배양). 당해 배양액 5ml을 종균으로서, 50ml의 부이욘 배지를 사용하여 본 배양을 실시하였다. 대수 증식 후기까지 배양한 후, 배양액 50ml을 원심분리조작(12000×g, 4℃, 15분간)으로 처리하여 집균하였다. 당해 균체를 사용하여 통상적 방법에 따라서 염색체 DNA를 제조하였다.

2. 유전자 라이브러리로부터의 바실러스 마세란스로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자(이하 bmdat)의 단리

우선, 바실러스 마세란스 AJ1617주의 염색체 DNA 30㎍에 제한효소 EcoRI를 1U 첨가하여, 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 부분소화시켰다. 다음에 당해 DNA에 서 아가로스 겔 전기영동으로 3 내지 6kbp의 단편을 회수하였다. 이것을 플라스미드 pUC118의 EcoRI 절단물(BAP 처리 완료·다까라슈조 제조) 1㎍와 라이게이션시키고, 이.콜리 JM109를 형질전환하여 유전자 라이브러리를 제작하였다. 이들을 암피시린을 포함하는 LB 배지(트립톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 염화나트륨 1%, 한천 2%, pH 7.0)에 플레이팅하여 콜로니를 형성시켰다. 출현한 콜로니를 암피시린과 이소부틸-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 O.1mM 포함하는 LB 액체 배지에서 37℃에서 밤새 배양한 후, 원심·집균하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체를, 10OmM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM 피루브산나트륨, 100mM D-글루탐산, 1mM 피리독살-5'-인산, 1%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액에 접종하고, 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 반응액을 원심분리한 상청액 5㎕을 200㎕의 피루브산 정량 반응액(100mM Tris-HCl(pH 7.6), 1.5mM NADH, 5mM MgCl₂, 16U/ml 락테이트 데하이드로게나제(오리엔탈코보 제조))를 포함하는 96 웰 플레이트에 가하고, 30℃에서 10분 동안 반응시킨 후에 340nm의 흡광도를 플레이트 판독기[참조: SPECTRA MAX 190, Molecular Devicc사 제조]를 사용하여 측정하였다. 동일한 반응을 최종 농도 0.2 내지 1mM의 피루브산나트륨을 첨가하여 실시하고, 이것을 기준으로 하여 피루브산의 감소량을 정량하고, D-아미노산 트랜스아미나제 활성을 검출하였다.

상기의 DAT 활성 클론의 스크리닝에 의해, DAT 활성을 나타내는 클론을 채취하였다. 이러한 형질전환체로부터 bmdat를 포함하는 플라스미드를 제조하고, pUCBMDAT라고 명명하였다. 플라스미드 pUCBMDAT를 EcoRI 처리하여 아가로스 겔 전 기영동으로 처리한 결과, 삽입 단편의 길이는 약 3.3kbp로 추정되었다.

3. 삽입 단편의 염기 서열

플라스미드 pUCBMDAT의 삽입 단편의 염기 서열을 디데옥시법에 의해 결정한 결과, 서열목록 서열번호 17에 나타낸 서열중, 630번에서 1481번에 대응하는 약 850bp으로 이루어진 0RF를 밝혀냈다. 본 ORF에 관해서 공지의 서열과의 상동성 검색을 실시한 결과, 바실러스 스패리쿠스 ATCC10208주로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자와 아미노산 서열에 있어서 91%의 상동성을, 바실러스 종(Bacillus sp.) YM-1주로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자와 아미노산 서열에 있어서 66%의 상동성을, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) ATCC10716주로 부터 유래된 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자와 아미노산 서열에 있어서 42%의 상동성을 나타낸다. 이러한 결과로부터, 본 ORF는 D-아미노산 트랜스아미나제 유전자를 암호화하고 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 여기서 상동성은, 유전자 분석 소프트「genetyx ver.6」[참조: GENETYX사]를 사용하며, 각종 파라미터는 초기 설정한 대로 하여 산출한 값이다.

4. BMDAT 발현 이.콜리의 제조

pUCBMDAT를 가지는 이.콜리 형질전환체 O.1mg/ml 암피시린을 포함하는 LB 배지(박토트립톤 1g/dl, 효모 엑기스 0.5g/dl, 및 NaCl 1g/dl)에서 37℃, 16시간 동안 씨드-배양하였다. LB 배지 50ml을 가득 담은 500ml용 판구 플라스크에 당해 씨 드 배양액 1ml을 첨가하고, 37℃에서 본 배양을 실시하였다. 배양 개시 2.5시간 후에, 최종 농도 1mM이 되도록 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 배양을 실시하였다. 수득된 배양액으로부터 집균 및 세정하고, BMDAT 발현 이.콜리를 제조하였다.

5. BMDAT 발현 이.콜리를 사용한, 세정된 균체 반응

상기 4에서 제조한 균체를 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM IHOG, 200mM D-알라닌, 1mM 피리독살-5'-인산, 및 0.5%(v/v) 톨루엔으로 이루어진 반응액 1ml에, 습윤 균체 중량으로 5%가 되도록 현탁한 후에, 10ml용 시험관에 옮기고 33℃에서 20시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응 종료후에 생성된 2R-모나틴을 정량하였다. 그 결과, 22mM의 2R-모나틴을 생성시킬 수 있었다.

본 발명에 의하면, 본 발명에 따른 글루탐산 유도체의 제조방법은, 감미료 등으로서 기대할 수 있는 모나틴을 포함하는 상기 특정한 글루탐산 유도체를 효소 반응을 이용하여 효율적으로 제조할 수 있기 때문에, 공업상 지극히 유용하다.

또한, 본 발명에 따르는 모나틴의 제조방법은, 본 발명에 따르는 글루탐산 유도체의 제조방법을 이용한 방법이고, 아미노산의 일종인 트립토판을 출발원료로서 효소 반응을 이용하여 효율적으로 모나틴을 제조할 수 있기 때문에, 공업상, 특히 식품분야에서 지극히 유용하다.

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Claims (34)

1. 화학식 1의 치환 α-케토산으로부터 화학식 2의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 당해 반응을 실시함으로써, 상기 화학식 2의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 생성하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.

   화학식 1

   

   화학식 2

   

   위의 화학식 1 및 화학식 2에서,

   R¹은 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹 및 복소환 함유 탄화수소 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타내며;

   R²는 하이드록실 그룹을 나타낸다.
2. 제1항에 있어서, R¹은 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹이고, R²는 하이드록실 그룹인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효소는, 데하이드로게나제 또는 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 효소는 트랜스아미나제이고, 따라서 반응계에 아미노 공여체로서, 1종 또는 복수종의 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, 아미노산은, 글루탐산, 아스파라긴산, 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소류신, 류신, 티로신, 발린, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 메티오닌, 오르니틴, 세린, 시스테인, 히스티딘 및 리신으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
6. 제3항에 있어서, 효소는, L-아미노산 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
7. 제3항에 있어서, 효소는, D-아미노산 트랜스아미나제인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 반응계에 L-아미노산을 D-아미노산으로 변환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
9. 제6항에 있어서, L-아미노산 트랜스아미나제는, 에어로모나스(Aeromonas) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속, 베이예린키아(Beijerinckia) 속, 에세리키아 속, 프로테우스(Proteus) 속 및 모르가넬라(Morganella) 속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물에서 유래하는 효소인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 미생물은, 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 알칼리게네스 패칼리스(Alcaligenes faecalis), 베이예린키아 인디카(Beijerinckia indica), 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri) 및 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
11. 제7항에 있어서, D-아미노산 트랜스아미나제는, 바실러스 속 또는 파에니바실러스 속에 속하는 미생물로 부터 유래하는 효소인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
12. 제11항에 있어서, 미생물은, 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 풀비파시엔스(Bacillus pulvifaciens), 바실러스 마세란스(Bacillus macerans), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 파에니바실러스 라바에 아종 풀비파시엔스(Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens) 및 파에니바실러스 마세란스(Paenibacillus macerans)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
13. 제1항에 있어서, 효소는, D-아미노산 트랜스아미나제 유전자를 도입한 미생물에 의해 생산된 효소인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
14. 제13항에 있어서, 미생물은, 에세리키아 콜리인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, D-아미노산 트랜스아미나제 유전자는, 바실러스 스패리쿠스 또는 바실러스 마세란스로 부터 유래된 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
16. 적어도 하기 [I] 및 [II]의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법:

    [I] 화학식 3의 치환 α-케토산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 화학식 4의 치환 α-케토산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 4의 치환 α-케토산을 생성하는 공정

    화학식 3

    

    화학식 4

    

    [위의 화학식 3 및 화학식 4에서,

    R은 탄소수 20이하의 아릴 그룹, 탄소수 20이하의 아르알킬 그룹 및 복소환 함유 탄화수소 그룹으로부터 선택되는 치환기를 나타낸다];

    [II] 화학식 4의 치환 α-케토산으로부터 화학식 5의 글루탐산 유도체를 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 당해 반응을 실시함으로써, 화학식 5의 글루탐산 유도체(이의 염의 형태를 포함)를 생성하는 공정.

    화학식 5

    

    [위의 화학식 5에서,

    R은, 화학식 3에서 정의한 바와 동일하다]
17. 제16항에 있어서, R은 페닐메틸 그룹 또는 3-인돌릴메틸 그룹인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 에르위니아(Erwinia) 속, 플라보박테리움(Flavobacterium) 속 및 크산토모나스(Xanthomonas) 속으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 미생물에서 유래하는 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
19. 제18항에 있어서, 미생물은, 슈도모나스 태트롤렌스(Pseudomonas taetrolens), 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens), 슈도모나스 데스몰리티카(Pseudomonas desmolytica), 에르위니아 종(Erwinia sp.), 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum), 또는 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri)인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
20. 제19항에 있어서, 미생물은, 슈도모나스 태트롤렌스 ATCC4683, 또는 슈도모나스 코로나파시엔스 AJ2791인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법.
21. 제16항 또는 제17항에 있어서, [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 하기의 단백질중 하나인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법:

    (a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

    (b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질;

    (c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

    (d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질.
22. 제16항 또는 제17항에 있어서, [I]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 하기의 단백질중 하나를 암호화하는 유전자가 증폭 발현된 재조합체로부터 수득되는 효소인 것을 특징으로 하는, 글루탐산 유도체의 제조방법:

    (a) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

    (b) 서열목록의 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한, 알돌라제 활성을 갖는 단백질;

    (c) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질;

    (d) 서열목록의 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열중에 1 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 및/또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 또한 알돌라제 활성을 갖는 단백질.
23. 적어도 하기 [A] 내지 [C]의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법:

    [A] 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성하는 공정;

    [B] 인돌-3-피루브산과 옥살로아세트산 또는 피루브산으로부터 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산을 생성하는 공정;

    [C] 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산으로부터 모나틴을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 상기 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타르산을 반응시킴으로써, 모나틴을 생성하는 공정.
24. 제23항에 있어서, [A]의 공정은, 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서, 트립토판을 반응시킴으로써 인돌-3-피루브산을 생성시켜 이를 반응액으로 하여, 당해 반응액에 탈기처리, 탈산소처리 및 최대 pH 2 이하로의 pH 조정 중의 하나를 실시하여 인돌-3-피루브산을 채취하는 공정인 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
25. 제24항에 있어서, 탈기처리 또는 탈산소처리는, 반응액중에 포함되는 기체의 전부 또는 일부를 불활성 기체로 치환하는 방법인 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
26. 제25항에 있어서, 불활성 기체는, 질소, 아르곤 및 헬륨 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
27. 제24항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, pH 조정은, 반응액에 대한 산 첨가에 의한 것이며, 당해 pH 조정의 결과 생성된 인돌-3-피루브산을 결정석출시키고 이를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
28. 제27항에 있어서, 산이, 황산, 염산, 질산 및 인산 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
29. 제23항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, [A]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 아미노산 옥시다제 활성 및 카탈라제 활성을 갖는 미생물로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
30. 제23항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, [A]의 공정의 반응을 촉매하는 효소는, 아크로모박터 속, 프로테우스 속 및 모르가넬라 속 중 어느 하나로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
31. 제30항에 있어서, 효소는, 아크로모박터 종(Achromobacter sp.) AJ2425, 프로테우스 레트게리 IFO135O1, 및 모르가넬라 모르가니 IFO3168중 어느 하나로 부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
32. 제23항에 있어서, [A]의 공정은, 아크로모박터 속, 프로테우스 속, 모르가넬 라 속, 슈도모나스 속 및 네우로스포라(Neurospora) 속으로부터 선택되고 트립토판을 인돌-3-피루브산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물의 배양물을, 트립토판에 작용시켜 인돌-3-피루브산을 생성시키고, 인돌-3-피루브산을 채취하는 공정인 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
33. 제23항 내지 제26항 및 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, [B]의 공정을, 당해 반응을 촉매하는 효소의 존재하에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.
34. 제23항 내지 제26항 및 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, [B]의 공정을, 화학합성법에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는, 모나틴의 제조방법.