WO2004018672A1 - 新規アルドラーゼおよび置換α−ケト酸の製造方法 - Google Patents

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WO2004018672A1
WO2004018672A1 PCT/JP2003/010750 JP0310750W WO2004018672A1 WO 2004018672 A1 WO2004018672 A1 WO 2004018672A1 JP 0310750 W JP0310750 W JP 0310750W WO 2004018672 A1 WO2004018672 A1 WO 2004018672A1
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Masakazu Sugiyama
Kunihiko Watanabe
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an aldolase and a substituted ⁇ -keto acid. More specifically, the present invention relates to 4- (indole-3-ylmethyl) -14-hydroxy 2-oxooxonoletalate, which is useful as an intermediate in monatin synthesis. The present invention relates to a method for producing an aldolase and a substituted ⁇ -keto acid which can be suitably used for the synthesis of 4- (Indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy-2-oxyglutarate. Background art
  • Monatin having a structure represented by the following formula (5) is a natural sweet amino acid isolated and extracted from the roots of shrubs in South Africa, and has a strong sweetness equivalent to several tens to several thousand times that of sucrose. It is expected to be used as a sweetener. However, the usefulness of monatin has only recently been discovered, and a method for synthesizing monatin at the industrial production level has not been established.
  • the present inventors have developed a new method for synthesizing monatin comprising the following reactions (1) and (2) using indolepyruvic acid and pyruvic acid, which are commercially available as reagents.
  • the former 4-Hydroxy-4-methyl-2_oxoglutarate aldolase, is derived from two molecules of pyruvate by using 4-hydroxy-4-methyl-2-oxodaltalate.
  • An object of the present invention is to provide an aldolase that can be suitably used for the synthesis of IHOG, which is useful as an intermediate in monatin synthesis, and a method for producing a substituted sheketo acid. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and as a result, have found that a certain kind of microorganism has an aldolase that can be suitably used for the synthesis of a desired IHOG, and reached the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [5] A recombinant DNA obtained by connecting the DNA according to any one of [1] to [4] and a vector DNA.
  • a method for producing a protein having aldolase activity comprising culturing the cell according to [6] in a medium, and accumulating the protein having aldolase activity in the medium and / or the cells.
  • a protein characterized in that:
  • a protein characterized in that:
  • a Pseudomonas genus bacterium is cultured in a medium, and any one of the following (i) to (1) is accumulated in the medium and Z or cells.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues, and has an aldolase activity Protein
  • R 1 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl group having up to 20 carbon atoms. Or an aralkyl group, a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or an ester derivative thereof.
  • R 1 is a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, It may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and an amino group up to the number 3.
  • R 2 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl having up to 20 carbon atoms. Or an aralkyl group, a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or an ester derivative thereof.
  • R 2 is a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, or a carbon number. It may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of an alkoxy group and an amino group up to 3.
  • R 1 is a hydrogen, a methyl group or a carboxymethyl group in the general formula (1). Is such that R 2 is not hydrogen.
  • R 1 and R 2 in the general formula (3) has the general formula (1) and the same meaning as that of R 1 and R 2 in (2).
  • a method for producing a substituted ⁇ -keto acid wherein the reaction is carried out in the presence of a protein that catalyzes the reaction.
  • the protein that catalyzes the reaction is derived from a microorganism selected from the group consisting of the genus Pseudomonas, the genus Erwinia, the genus Flavobacterium, and the genus Xanthomonas.
  • the method for producing a substituted hypoketoacid according to any one of [14] to [18].
  • the microorganisms include Pseudomonas taetrolens, Pseudomonas coronafaciens, shoots, Pseudomonas desmolytica, Erwinia sp., Erwinia sp. Or Xanthomonas citri, the process for producing a substituted a-keto acid according to [19], wherein the process is Xanthomonas citri.
  • R 1 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl group having up to 20 carbon atoms.
  • an aralkyl group a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or an ester derivative thereof, wherein R 3 is hydrogen or a carboxyl group, and R 1 is a halogen atom, a hydroxyl group, It may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkoxy group having up to 3 carbon atoms and an amino group.
  • R 4 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, Aryl or aralkyl group, heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, hydroxyl group, or ester thereof. Derivative. R 4 may be further substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkoxy group having up to 3 carbon atoms and an amino group. ) By reacting with a substituted ⁇ -keto acid,
  • FIG. 1 is a flowchart showing the steps for producing the aldolase of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the aldolase activity of Pseudomonas taetrolens ATCC4683-derived aldolase (PtALD) with respect to the PHOG concentration.
  • Figure 3 shows MgC1.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the PtALD aldolase activity with respect to the concentration.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the PtALD aldolase activity with respect to the KPi concentration.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the pH stability of PtALD.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the temperature stability of PtALD. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the aldolases produced by these microorganisms catalyze the reaction of decomposing one molecule of PHOG to produce one molecule of phenylpyruvic acid and one molecule of pyruvate. It was thought that it could catalyze the reaction to synthesize 4- (indole-13-ylmethyl) _4-hydroxy-12-oxodaltalic acid (IHOG) from pyruvic acid (or oxalic acetic acid).
  • IHOG 4- (indole-13-ylmethyl) _4-hydroxy-12-oxodaltalic acid
  • the present inventors purified and isolated aldolase from cultured cells of the strain to clarify the existence of the novel aldolase, and at the same time, the enzyme was converted to indolepyruvic acid and pyruvate ( Or acetic acid) to synthesize IHOG.
  • the present inventors purified an aldolase derived from Pseudomonas taetrolens ATCC4683 (hereinafter sometimes abbreviated as PtALD) and determined the amino acid sequence of the aldolase. Furthermore, a DNA molecule of about 30 base pairs deduced from the amino acid sequence of the aldolase is synthesized, and using this, a part of the DNA encoding the aldolase is isolated and obtained by the PCR method. Using the DNA fragment as a probe, the entire DNA encoding PtALD was successfully isolated from a chromosomal library of this microorganism.
  • PtALD Pseudomonas taetrolens ATCC4683
  • SEQ ID NO: 1 The DNA encoding the PtALD of the present invention identified by the above method is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing show the amino acid sequences of PtALD encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a Pt ALD encoded by the nucleotide sequence of nucleotides 456 to 118 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is the amino acid sequence of PtALD encoded by the nucleotide sequence of bases 444 to 1118 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, In the amino acid sequence, this corresponds to the amino acid sequence of residue numbers 5-225.
  • Each of the Pt ALDs described in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing has an aldolase activity, and comprises one molecule of indolepyruvic acid and one molecule of oxa mouth acetic acid (or pyruvic acid) represented by the following formula (4). It catalyzes the reaction that synthesizes 1- (indole-13-inolemethyl) -14-hydroxy-2-oxoglutaric acid (IHOG).
  • the present inventors used the obtained DNA fragment encoding PtALD as a probe to determine the total length of the DNA encoding Pseudomonas coronafaciens AT CC 4683-derived anoredolase (hereinafter sometimes abbreviated as PcALD).
  • PcALD Pseudomonas coronafaciens AT CC 4683-derived anoredolase
  • the DNA encoding the PcALD of the present invention identified by the above method is shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 16 in the sequence listing shows the amino acid sequence of PcALD encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 16 in the sequence listing is the amino acid sequence of PcALD encoded by the nucleotide sequence of base numbers 398 to 1141 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • PcALD described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing also has aldolase activity, and comprises one molecule of indolepyruvic acid and one molecule of oxa mouth acetic acid (or pyruvic acid) represented by the following formula (4): It catalyzes the reaction for the synthesis of 4-hydroxy-12-oxoglutaric acid (IHOG).
  • the aldolase gene of the present invention having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was isolated from the chromosomal DNA of Pseudomonas taetrolens ATCC 468 strain as described above.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase (gene name: pro A) derived from a known Pseudomonas ochraceae bacterium (Gene name: pro A) (Biosci. Biotechnol. 2701-2709 (2001) Shows 29% homology in amino acid sequence with Maruyama K., et. Al.).
  • the aldolase gene of the present invention having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing was isolated from chromosome DNA of Pseudomonas coronafaciens AJ2791 strain as described above.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing is 4-Hydroxy-3 ⁇ 4-methyl-2-oxoglutarate aldolase derived from a known Pseudomonas ochraceae bacterium name r o A) (Biosci.
  • the analysis of the homology here is a value calculated using the gene analysis software “Genetyx ver. 6” (Genetics Corp.) with the parameters as initial setting values.
  • a method for obtaining DNA encoding aldolase from an aldolase-producing bacterium will be described.
  • the amino acid sequence can be determined using the Edman method (Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)).
  • the amino acid sequence can be determined using a sequencer manufactured by Applied Biosystems.
  • peptide fragments were fractionated by reversed-phase HPLC after limited digestion with protease, and the internal amino acid sequence of two of the fragments was determined. The sequence shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 in the Sequence Listing has been clarified.
  • nucleotide sequence of DNA encoding this can be deduced.
  • nucleotide sequence of DNA To deduce the nucleotide sequence of DNA, universal codons are employed.
  • a DNA molecule of about 30 base pairs is synthesized based on the deduced base sequence.
  • a method for synthesizing the DNA molecule is disclosed in Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981).
  • the DNA molecule can be synthesized using a synthesizer manufactured by Applied Biosystetns.
  • the DNA molecule can be used as a probe when isolating the full-length DNA encoding aldolase from the chromosome gene library of the aldolase-producing bacterium. Alternatively, it can be used as a primer when amplifying DNA encoding the aldolase of the present invention by PCR.
  • the DNA amplified by the PCR method does not contain the entire length of the aldolase-encoding DNA
  • the DNA amplified by the PCR method is used as a probe to convert the entire length of the aldolase-encoding DNA to an aldolase-producing bacterium. Isolate from a chromosomal gene library.
  • nucleotide sequence A method for determining the nucleotide sequence of DNA encoding the isolated aldolase is described in APractical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons' Inc. (1985).
  • the nucleotide sequence can be determined using a DNA sequencer manufactured by Applied Biosystems.
  • DNA encoding an aldolase derived from Pseudomonas taetrolens ATCC 463 strain is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing
  • DNA encoding an aldolase derived from Pseudomonas coronafaciens A J2791 is shown in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing.
  • the DNA encoding an aldolase that catalyzes the reaction for synthesizing IHOG from indolepyruvic acid and pyruvate (or oxalic acetic acid) is not limited to the DNAs shown in SEQ ID NOS: 1 and 15 in the sequence listing. In other words, it produces an aldolase that catalyzes the reaction of synthesizing IHOG from indolepyruvate and pyruvate (or oxa-mouth acetate).
  • the DNA of the present invention is not limited to DNA that encodes an aldolase isolated, but naturally, DNA obtained by artificially mutating DNA encoding aldolase isolated from chromosomal DNA of an aldolase-producing bacterium. However, if it encodes aldolase, it is the DNA of the present invention. A frequently used artificial mutation method is a site-specific mutagenesis method described in Method, in Enzymol., 154 (1987). Further, a DNA that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing under stringent conditions and encodes a protein having aldolase activity is also a DNA of the present invention.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNAs with high homology, for example, 50% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably Or DNA that has 95% or more homology will hybridize, and DNA with lower homology will not hybridize with each other, or under normal washing conditions for Southern hybridization. 37 ° C, 0.1 XSSC, 0.1% SDS, preferably 60. C, 0.1 XSSC, 0.1% SDS, more preferably, conditions for hybridization at a salt concentration corresponding to 65 ° C, 0.1 XSSC, 0.1% SDS.
  • the “aldolase activity” may be any activity that synthesizes IHOG from indolepyruvic acid and pyruvic acid (or oxalic acetic acid). However, in the case of a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the sequence in the sequence listing under the conditions of 33 ° C and pH9 is used. It is desirable that the protein has an aldolase activity of 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 70% or more of the protein having the amino acid sequence of No. 2 or 3.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA that hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 under stringent conditions and encodes a protein having aldolase activity.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. It is difficult to clearly express this condition as a numerical value.
  • DNAs with high homology for example, 50% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably DNAs with a homology of 95% or more hybridize to each other, and DNAs with lower homology do not hybridize to each other, or at 37 ° C, which is the normal washing condition for Southern hybridization.
  • XSSC 0.1% SDS, preferably at 60 ° C, 0.1 XSSC, 0.1% SDS, more preferably at 65 ° C, 0.1 XSSC, salt concentration equivalent to 0.1% SDS Conditions for high predication are given.
  • Activity refers to the activity of synthesizing IHOG from indolepyruvic acid and pyruvate (or oxa-mouth acetate).
  • the sequence in the sequence listing under the conditions of 33 ° C and pH 9 It is desirable that the protein has an aldolase activity of 10% or more, preferably 3% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 70% or more of the protein having the amino acid sequence described in No. 16.
  • DNA encoding a protein that is substantially the same as the aldolase encoded by DNA described in SEQ ID NO: 1 or 15 in the sequence listing is also a DNA of the present invention. That is,
  • (h) has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing, and has an aldolase activity DNA that encodes a protein Is also the DNA of the present invention.
  • the term “one or several” refers to a range that does not significantly impair the three-dimensional structure of the protein of amino acid residues or the aldolase activity. Specifically, 1 to 50, preferably 1 to 30 The number is more preferably 1 to 10.
  • the term “aldolase activity” means the activity of synthesizing IHOG from indolepyruvic acid and pyruvate (or oxa-mouth acetic acid).
  • amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 3 or 16 in the sequence listing.
  • amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, 3 or 16 in the sequence listing.
  • the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3 or 16 under the conditions of 33 ° C and pH9 at 33 ° C and pH9 preferably at least 10%. Desirably has an aldolase activity of 30% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 70% or more.
  • the PtALD of the present invention has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 as clarified by the above-mentioned gene isolation and analysis.
  • the present invention includes substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 2 and 3 in the sequence listing. It also includes a protein having an amino acid sequence and having an aldolase activity.
  • the PcALD of the present invention has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing as clarified from the above-mentioned gene isolation and analysis.
  • the present invention has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • it also includes a protein having aldolase activity.
  • the aldolase of the present invention is the following proteins (i) to (1).
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues, and has an aldolase activity Protein
  • the aldolase of the present invention catalyzes a reaction for synthesizing 4- (indole-3-ylmethyl) -14-hydroxy-12-oxodaltalic acid (IHOG) from indolepyruvic acid and pyruvic acid (or oxamouth acetate) by aldol condensation.
  • IHOG 4- (indole-3-ylmethyl) -14-hydroxy-12-oxodaltalic acid
  • the aldolase activity of the aldolase of the present invention can be measured by measuring the amount of IHOG produced from indolepyruvic acid and pyruvate (or oxa mouth acetic acid) by high performance liquid chromatography (HP LC). is there.
  • the quantification of IHOG can be performed, for example, by HPLC analysis using "Inertsil 0DS-2" (5 m, 4.6 x 250 mm) manufactured by GL Sciences. An example of the analysis conditions is shown below.
  • Mobile phase 40% (v / v) acetonitrile / 5 mM tetrabutylammonium dihydrogen phosphate solution
  • the aldolase of the present invention can catalyze the reaction of synthesizing IHOG by aldol condensation of indolepyruvic acid and pyruvic acid (or oxa mouth acetic acid).
  • Microbial enzymes that catalyze aldol condensation using two molecules of ⁇ -keto acid (or substituted-keto acid) as substrates Until now, Pseudomonas bacteria
  • the aldolase of the present invention differs from the aldolases reported so far in that it can catalyze the reaction of synthesizing IHOG by aldol condensation of indolepyruvic acid and pyruvate (or oxa-mouth acetic acid). is there.
  • ⁇ The enzymatic chemical properties of purified PtALD are described below.
  • R 1 represents hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl group having up to 20 carbon atoms.
  • R 4 may be hydrogen, an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl group having up to 20 carbon atoms. Or an aralkyl group, a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or a salt thereof. It is a tell derivative.
  • R 4 may be further substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkoxy group having up to 3 carbon atoms, and an amino group.
  • R 4 is hydrogen or a carboxyl group. Is preferred.
  • the optimum 11 of the 8 is at around 9 at 33 ° C.
  • it has pH stability at pH 6 or more, and particularly has high pH stability in the range of pH 6 to 11.
  • it has temperature stability at 70 ° C or lower, and particularly has high temperature stability in the range of 20 to 60 ° C.
  • PtALD has a property that aldolase activity is improved by adding an inorganic phosphoric acid such as KPi to an enzyme reaction system.
  • the molecular weight of PtALD was about 146 kDa when measured by the gel filtration method, and was about 25 kDa when measured by the SDS-PAGE method.Therefore, the molecular weight of PtALD was about 25 kDa. It is presumed to have a subunit hexamer structure.
  • the method for producing the aldolase of the present invention includes (i) a method of producing and accumulating aldolase by culturing an aldolase-producing microorganism in a microorganism, and (ii) preparing a transformant that produces aldolase by recombinant DNA technology, There are two methods for producing and accumulating aldolase by culturing the transformant.
  • microorganisms from which the aldolase is obtained include microorganisms belonging to the genera Pseudomonas, Erwinia, Flavobacterium, and Xanthomonas.
  • Pseudomonas fe Erwinia sp., F ⁇ avobacterium bird, Xanthomonas spp. If so, anything is a PJ-target used in the present invention.
  • Power Pseudomonas taetrolens A i, CC4683, Pseudomonas coronafaciens A J2791, Pseudomonas desmo ⁇ ytica A J1582, Erwinia sp.AJ291, Xanthomonas citri A J2797, Flavobacterium rhenanum AJ2468
  • Pseudomonas taetrolens AT C C 4683 and Pseudomonas coronafaciens A J2791 are preferred. The deposits of these microorganisms are shown below.
  • the culture form of the microorganism as the source of the aldolase can be either liquid culture or solid culture, but an industrially advantageous method is a deep aeration stirring culture method.
  • a nutrient source of the nutrient medium a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and other micronutrient sources commonly used for microorganism culture can be used. Any nutrient sources available for the strain used can be used.
  • Aerobic conditions are adopted as ventilation conditions.
  • the cultivation temperature may be within a range in which the bacteria grow and anolide is produced. Therefore, although there is no strict condition, it is usually 10 to 50 ° C, preferably 30 to 40 ° C.
  • the culture time varies depending on other culture conditions. For example, it is sufficient to culture until the time when the aldolase is produced most, and it is usually about 5 hours to 7 days, preferably about 10 hours to 3 days.
  • the cells are collected by centrifugation (for example, 100,000 xg, 10 minutes). Most of the aldolase is present in the cells, so the aldolase is solubilized by disrupting or lysing the cells. Methods such as ultrasonic crushing, French press crushing, and glass bead crushing can be used for crushing the cells, and when lysing cells, egg white lysozyme, peptidase treatment or a combination of these methods is used as appropriate. Is used.
  • purification is performed using the enzyme lysate as a starting material. If there is any unbroken or unlysed bacterial residue, the lysate is centrifuged again. It is more advantageous for purification to remove the precipitated residue.
  • aldolase For the purification of aldolase, all the usual methods usually used to purify enzymes, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration method, ion exchange method, hydrophobic method Chromatography, hydroxyapatite mouth chromatography, and the like can be employed. As a result, an aldolase-containing fraction having higher specific activity can be obtained.
  • FIG. 1 is a flowchart of the production process of the aldolase of the present invention.
  • a DNA encoding the aldolase of the present invention is prepared (step S 1).
  • the prepared DNA is connected to a vector DNA to prepare a recombinant DNA (step S2), and cells are transformed with the recombinant DNA to prepare a transformant (step S3).
  • the transformant is cultured in a medium to produce and accumulate aldolase in the medium and / or in the cells (step S4).
  • step S5 the enzyme is recovered and purified to produce a purified aldolase.
  • step S6 by using the purified aldolase produced in step S5 or the medium and / or cells in which the aldolase of step S4 is accumulated in the aldol reaction, the desired substituted a-keto acid can be produced in large quantities (step S6).
  • the DNA to be connected to the vector DNA is only required to be able to express the aldolase of the present invention.
  • aldolase gene connected to the vector DNA is as described above.
  • Etc. can be used.
  • the protein When a protein is mass-produced using recombinant D, NA technology, it is preferable that the protein associates in a transformant producing the protein to form an inclusion body of the protein.
  • the advantages of this expression production method are that the protein of interest is protected from digestion by proteases present in the cells, and that the protein of interest can be easily purified by centrifugation following disruption of the cells. .
  • the protein inclusion bodies obtained in this manner are solubilized by a protein denaturing agent, undergo an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent, and then are converted into a correctly folded physiologically active protein.
  • a protein denaturing agent undergoes an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent, and then are converted into a correctly folded physiologically active protein.
  • Methods for mass production of the target protein as inclusion bodies include a method of expressing the target protein alone under the control of a strong promoter, and a method of expressing it as a fusion protein with a protein that is known to be expressed in large amounts. is there.
  • bacterial cells When producing proteins in large quantities using recombinant DNA technology, bacterial cells, actinomycete cells, yeast cells, mold cells, plant cells, animal cells, etc. may be used as transformed host cells. it can.
  • a force S such as a bacterium belonging to the genus Escherichia, a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, a bacterium belonging to the genus Corynepterium, a bacterium belonging to the genus Bacillus, or the like, preferably Escherichia coli is used. This is because there is a lot of knowledge about the technology for mass-producing proteins using Escherichia coli.
  • a method for producing aldolase using transformed E. coli will be described.
  • a promoter for expressing a DNA encoding aldolase a promoter usually used for production of a heterologous protein in Escherichia coli can be used.
  • a promoter usually used for production of a heterologous protein in Escherichia coli can be used.
  • examples include a T7 promoter, a trp promoter, and a lac promoter.
  • a gene encoding another protein is ligated upstream or downstream of the aldolase gene to produce a fusion protein gene.
  • a gene encoding another protein may be any gene that increases the amount of accumulation of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation and regeneration steps.
  • T7 gene 10 and j3 Galactosidase gene, dehydrofolate reductase gene, interferon ⁇ gene, interleukin-2 gene, prochymosin gene and the like can be mentioned as candidates.
  • the codon reading frames should be matched. You can use the power of ligation at the appropriate restriction enzyme site or the synthesis of the appropriate sequence.
  • a terminator which is a transcription termination sequence downstream of the fusion protein gene.
  • This terminator includes T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, terminator of tetracycline resistance gene, terminator of Escherichia coli trpA gene, and the like.
  • a so-called multicopy type vector is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from Co1E1.
  • the “derivative” refers to a product obtained by modifying a plasmid by substitution, deletion, insertion, addition or inversion of a base.
  • modification used herein includes a mutation treatment with a mutagen or UV irradiation, or a modification with a spontaneous mutation.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • expression vectors having a strong promoter are commercially available (pUC (manufactured by Takara Shuzo), pPROK (manufactured by Clontech), pKKK233-2 (manufactured by Clontech) And others).
  • a recombinant DNA is obtained by ligating a vector fragment linked to a promoter, a gene coding for a fusion protein of anoredolase or aldolase with another protein, and a terminator, and a vector DNA in this order.
  • Escherichia coli is transformed with the recombinant DNA, and when the Escherichia coli is cultured, an aldolase or a fusion protein of aldolase and another protein is expressed and produced.
  • a strain usually used for expression of a heterologous gene can be used, and particularly, Escherichia coli, JM109 (DE3) strain and JM109 strain are preferable.
  • a method for performing the transformation and a method for selecting the transformant are described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989) and the like.
  • aldolase that does not exist in aldolase such as blood coagulation factor Xa and kallikrein
  • aldolase can be cut out using a restriction protease whose sequence is a recognition sequence.
  • a medium usually used for culturing Escherichia coli such as an M9-casamino acid medium or an LB medium
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the vector marker, promoter, host bacterium and the like used.
  • the following methods are available for recovering aldolase or a fusion protein of aldolase and another protein. If the aldolase or its fusion protein has been solubilized in the cells, the cells can be recovered and then disrupted or lysed and used as a crude enzyme solution. Further, if necessary, aldolase or a fusion protein thereof may be purified and used by a conventional method such as precipitation, filtration, or column chromatography. In this case, a purification method using an aldolase or fusion protein antibody can also be used.
  • a protein inclusion is solubilized with a denaturing agent. Although it may be solubilized together with the bacterial cell protein, it is preferable to take out the inclusion body and solubilize it in consideration of the subsequent purification operation.
  • the inclusion body may be recovered from the cells by a conventionally known method. For example, the cells are lysed, and the inclusion bodies are recovered by centrifugation. Denaturants that solubilize the protein inclusions include guanidine hydrochloride (eg, 6 M, pH 5-8) and urea (eg, 8 M).
  • a dialysis solution used for dialysis a Tris-HCl buffer or a phosphate buffer may be used, and the concentration may be 20 mM to 0.5 M, and the pH may be 5 to 8.
  • the protein concentration during the regeneration step be suppressed to about 500 ⁇ g / m 1 or less.
  • the dialysis temperature is preferably 5 ° C. or less in order to prevent the regenerated aldolase from performing self-crosslinking.
  • the aldolase gene when the aldolase gene is derived from a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, as one preferred embodiment, the aldolase can be expressed and produced using the bacterium belonging to the genus Pseudomonas.
  • a host cell for example, Shi-En Lu et al. Report a recombinant expression method in Pseudomonas syringae (FEMS Microbiology Letters 210 (2002) pl 5-121). Olsen, RH et al. Have reported on a recombinant expression method in Pseudomonas aeruginosa (Journal of Bacteriology, (1982) 150, p60-69).
  • a vector for introducing the aldolase gene into Pseudomonas bacteria a plasmid having an origin of replication that functions in Pseudomonas cells can be used.
  • plasmid pKLH4.05 which contains a replicon TFK that functions in Pseudomonas aeruginosa.
  • a so-called broad host range vector used for transformation of Gram-negative bacteria can be used.
  • These vectors such as RK404 (Ditta, G. et al., Plasmid 13 (1985) pl49-153) and RSF1010 (Frey, J. et al., Gene 24 (1982) p289-296), also function in Pseudomonas bacteria. It is known.
  • the process for producing a substituted ⁇ -keto acid according to the present invention comprises the following general formula (1)
  • R 1 represents an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, an aryl group having up to 20 carbon atoms or an aryl group having up to 20 carbon atoms. It is an aralkyl group, a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or an ester derivative thereof. R 1 may be further substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkoxy group having up to 3 carbon atoms, and an amino group.
  • R 1 is preferably a substituent having 4 or more carbon atoms, preferably 6 or more carbon atoms, and among them, an aryl group or an aralkyl group having up to 20 carbon atoms (a phenyl group, a tolyl group, a xylyl group, Aryl groups such as biphenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl groups; aralkyl groups such as benzyl, benzhydryl, styryl, phenethyl, trityl, cinnamyl and the like; It is preferably a ring-containing hydrocarbon group (heterocyclic group such as furyl group, chenyl group, pyridyl group, piperidyl group, piperidino group, morpholino group, indolyl group, etc .; alkyl group substituted by these heterocyclic groups).
  • R 1 is particularly preferably a benzyl group or a 3-indolylmethyl group, most preferably a 3_indolylmethyl group. That is, as the substituted ⁇ -keto acid of the general formula (1), phenylvirbic acid or indolevirbic acid is preferable, and indolepyruvic acid is particularly preferable.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, a carboxyalkyl group having 2 to 9 carbon atoms, or an aryl group having up to 20 carbon atoms. Or an aralkyl group, a heterocyclic hydrocarbon group having up to 11 carbon atoms, a hydroxyl group, or an ester derivative thereof.
  • R 2 contains an aromatic ring or a heterocyclic ring
  • the aromatic ring or the heterocyclic ring is at least one kind of substituent selected from a halogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group having up to 3 carbon atoms, an alkoxy group having up to 3 carbon atoms and an amino group. May be substituted by a group.
  • R 1 is hydrogen, a methyl group or a carboxymethyl group
  • R 2 is not hydrogen.
  • R 2 is preferably hydrogen or a carboxyl group, particularly preferably hydrogen. That is, the substituted ⁇ ; -keto acid of the general formula (2) is preferably oxa-mouth acetic acid or pyruvic acid, particularly preferably pyruvic acid.
  • R 1 and R 2 have the same meanings as R 1 Oyo Pi R 2 in the general formula (1) and (2).
  • indolepyruvic acid is used as the substituted ⁇ -keto acid of the general formula (1)
  • pyruvic acid is used as the substituted ⁇ -keto acid of the general formula (2).
  • IHOG represented by the following formula (4) is synthesized.
  • the protein that catalyzes the reaction is obtained by the aldol condensation of a substituted o-keto acid represented by the general formula (1) with a substituted ⁇ -keto acid represented by the general formula (2).
  • Any protein can be used without particular limitation as long as it can catalyze the reaction for synthesizing the substituted ⁇ -keto acid represented by the formula (3). That is, any protein that catalyzes the reaction may be a microorganism-derived protein or a protein synthesized by a chemical synthesis method.
  • the aldolase described in the section of [I] aldolase is preferred.
  • aldolase obtained by culturing cells that produce a protein (aldolase) that catalyzes the reaction from Pseudomonas, Erwinia, and Flavobacterium J ⁇ Xanthomonas may be used, or (2) recombinant A transformant that produces a protein that catalyzes the reaction may be prepared by DNA technology, and an aldolase obtained by culturing the transformant may be used.
  • the protein that catalyzes the reaction may be added to the reaction system in any form as long as it can catalyze the reaction for synthesizing the substituted ct-keto acid represented by the general formula (3). That is, the protein that catalyzes the reaction may be added alone to the reaction system, or may be added to the reaction system in the form of a composition having an aldolase activity containing a protein (anoredolase) that catalyzes the reaction. Is also good.
  • composition having aldolase activity may be any composition containing a protein (aldolase) that catalyzes the reaction, and specifically, a culture, a medium (a product obtained by removing cells from the culture) , Cells (including both cultured cells and washed cells), processed cells obtained by crushing or lysing cells, and having aldolase activity obtained by purifying the medium and / or cells.
  • Composition crude enzyme solution, purified enzyme, etc.
  • substituted a-keto acids can be produced using cells transformed with aldolase-producing bacteria or recombinant DNA.
  • the substrate may be added directly to the culture solution during the culturing, or any of the cells isolated from the culture and the washed cells may be used.
  • a processed bacterial cell obtained by crushing or lysing cells may be used as it is, or aldolase may be recovered from the processed bacterial cell and used as a crude enzyme solution. May be used.
  • any fraction having a phenolase activity can be used in the method of the present invention for producing a substituted ⁇ -keto acid.
  • a substituted ⁇ -keto acid represented by the general formula (1) or a substituted ⁇ -keto acid represented by the general formula (2) is required. Adjust the reaction solution containing the protein or aldolase-containing substance that catalyzes the reaction to an appropriate temperature of 20 to 50 ° C, and keep it at pH 6 to 12 for 30 minutes to 5 days, shake, or stir. Just fine.
  • Mg 2+ to the reaction solution Mn 2+, N i 2+, can be improved by connexion reaction rate the addition of divalent cations such as C o 2+. From the viewpoint of cost and the like, preferably in this and the force s using Mg 2+.
  • the divalent cation when the divalent cation is added to the reaction solution, which may be any of salts insofar as it does not inhibit the reaction, preferably Ru Kotogaa using MgC 1 2, Mg S0 4, Mn S0 4 or the like .
  • concentration at which these divalent cations are added can be determined by a person skilled in the art by simple preliminary studies, from 0.01 mM to 1 OmM, preferably from 0.1 mM to 5 mM, and more preferably 0.1 mM. It can be added in the range of ⁇ 1 mM.
  • examples of preferred reaction conditions for carrying out the method for producing a substituted ⁇ -keto acid of the present invention include 100 mM buffer, 50 mM indole-13-pyruvic acid, 250 mM pyruvate, To a reaction solution consisting of lmM MgCl 2 , 1% (v / v) toluene, add 10% (w / V) of washed cells of E. coli expressing aldolase as an enzyme source, and add for 4 hours at 33 By shaking, 4- (indole-3-ylmethyl) -1-hydroxy-2-oxodaltalic acid (IHOG) is obtained.
  • IHOG 4- (indole-3-ylmethyl) -1-hydroxy-2-oxodaltalic acid
  • the resulting substituted ⁇ -keto acid of the general formula (3) can be separated and purified by a known method.
  • a method of adsorbing a basic amino acid by contacting it with an ion-exchange resin and eluting the basic amino acid for crystallization, or a method of eluting, decolorizing and filtering with activated carbon or the like, and crystallization may be mentioned.
  • indolepyruvic acid, oxaloacetic acid (or pyruvic acid), and ketone acid (IHOG) a precursor of monatin, can be produced.
  • IHOG is useful as an intermediate in monatin synthesis because it can derive monatin by amination at the 2-position.
  • Aldolase-active strains were collected using 4-phenylmethyl-4-hydroxy-12-oxodaltalic acid (PHOG) as a substrate.
  • PHOG 4-phenylmethyl-4-hydroxy-12-oxodaltalic acid
  • test microorganism (bacteria'yeast) was inoculated into a bouillon plate medium (Eiken Chemical) and cultured at 30 ° for 24 hours. This was glycerol 0.5 g / dl, fumaric acid 0.5 g / dl, yeast extract 0.3 g / dl, peptone 0.2 ⁇ / (11, ammonium sulfate 0.3 g / d K 2 HP0 40 . 3 g / d 1, KH 2 P0 4 0. 1 g / d Mg S 0 4 ⁇ 7H 2 0 0. 05 g / d K phthalate sodium 0.
  • the concentration of free pyruvic acid in the reaction solution was determined by an enzymatic method using lactate dehydrogenae (LDH): 100 mM Tris—HCl ( ⁇ 80), 1.5 mM NADH, 5mM MgC l 2, was added 25 U / m Sanpunore 10 L to the reaction solution 200 / L consisting of 1 LDH, measured 30 with the Inkyupeto 10 min. 340 nm absorbance after the reaction, NADH It was determined pyruvate content in the sample from the decrease.
  • PHOG was eluted at a retention time of about 9.8 minutes, and phenylpyruvic acid was eluted at a retention time of about 12 minutes, and fractionation and quantification were possible.
  • the amount of pyruvate or phenylpyruvate generated from PHOG in the test cell-added group minus the amount of control group (kamono section without cells) was defined as the amount produced by aldolase.
  • aldolase activity using PHOG as a substrate was found in the strains listed in Table 1.
  • Pseudomonas taetrolens ATCC4683 was selected, and the synthesis reaction of PHOG from phenylvirbic acid and oxa-mouth acetic acid or pyruvic acid was examined.
  • 5 OmM phenylene Rubirubin acid 1 mM Mg CI 2
  • 5 mM KP i 1 0 OmM Okisa port acetate or pyruvate
  • 1% (w / w) toluene Was inoculated with P. taetrolens ATCC 4683 (AJ2212) cells to a final concentration of about 1% (/ v), and reacted at 30 ° C.
  • Table 2 shows the amount of PHOG produced from fe-lupinolevic acid and oxalate acetic acid or pyruvic acid. Table 2 PHOG production from phenylpyruvic acid and oxaperacetic acid
  • I HOG aldolase derived from Pseudomonas taetrolens ATCC 468 3 strain I H ⁇ G aldolase was purified from the soluble fraction of P. taetrolens ATCC 463 strain as follows. In the aldolase activity measurement, the aldol degradation activity using PHOG as a substrate was measured under the following conditions.
  • the cells were collected from the obtained culture by centrifugation, suspended in buffer A (2 OmM Tris-HCl (pH 7.6)), washed, and then collected again by centrifugation. The obtained washed cells were suspended in 200 ml of buffer A and sonicated at 4 ° C. for 30 minutes. Centrifuge the crushed liquid (x8000rpm, The cells were removed by ultracentrifugation (x50000 rpm, 30 minutes), and the resulting supernatant was used as a soluble fraction.
  • buffer A 2 OmM Tris-HCl (pH 7.6)
  • the solution in which the aldolase activity was detected was dialyzed against buffer B (5 OmM Tris—HCl (pH 7.6), 1M ammonium sulfate, pH 7.6) at 4 ° C at 0.4 ° C and 0.45 ⁇ m. was filtered. The obtained filtrate was applied to a hydrophobic chromatography column Phenyl Sepharose HP HR 16/10 (manufactured by Pharmacia) equilibrated with Noffer B. By this operation, the aldolase was adsorbed on the carrier.
  • the aldolase was eluted by linearly changing the concentration of ammonium sulfate from 1 M to 0 M.
  • the aldolase activity was measured for each of the obtained eluted fractions, and the aldolase activity was observed at the elution position where the ammonium sulfate concentration was about 0.2 M.
  • the fractions containing aldolase were collected, dialyzed against buffer A, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • the obtained filtrate was concentrated using an ultrafiltration membrane centripreplO.
  • the obtained concentrate is subjected to gel filtration Sephadex 200 HP 16/60 (Pharmacia) equilibrated with buffer C (2 OmM Tris—HC1 (pH 7.6), 0.1 M KC1). At a flow rate of 1 ml Zim. By this operation, aldolase was eluted in the fraction of 66-71 ⁇ 1. From the elution position of the activity peak, the molecular weight of the aldolase was estimated to be about 146 kDa. 0750
  • the obtained fraction was filtered through a 0.45 ⁇ filter.
  • the filtrate obtained here was applied to an anion exchange chromatography column Mono-Q HR 5/5 (Pharmacia) equilibrated with buffer II.
  • the aldolase was adsorbed on the carrier.
  • the protein was eluted by linearly changing the KC1 concentration from OmM to 700 mM (Total 24 ml).
  • the aldolase activity was measured for each eluted fraction, and the aldolase activity was observed at the elution position where the KCl concentration was about 0 ⁇ 0.4 M.
  • the obtained fraction was dialyzed against buffer D (1 OmM potassium phosphate buffer (pH 7.0)) at 4 ° C and filtered through a 0.45 ⁇ filter.
  • the filtrate thus obtained was applied to a hydroxyapatite chromatography column CHT-II 5 ml (manufactured by BioRad) equilibrated with Buffer D.
  • the aldolase was not adsorbed on the carrier, but could be separated from the adsorbed protein.
  • the P. taetrolens AT C C 4683 strain was cultured at 30 ° C. using a 50 ml puyon medium (preculture). Using 5 ml of this culture solution as a seed bacterium, main culture was performed using 50 ml of Bouillon medium. After culturing until late logarithmic growth, 50 ml of the culture was centrifuged (12000 X g, 4 ° C, 15 minutes) to collect the cells. Using these cells, chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
  • PCR was performed using P. taetrolens ATCC4683 chromosome DNA as type III for PCR.
  • the PCR reaction was performed using PCR Thermal PERS0NEL (TaKaRa), and was performed for 30 cycles under the following conditions.
  • full-length gene was obtained by Southern analysis and colony hybridization.
  • the probe was labeled by using DIGHigh Prime (manufactured by Roche Diagnostics) and incubating at 37 ° C as 0 / N according to the instruction.
  • DIGHigh Prime manufactured by Roche Diagnostics
  • Southern analysis 1 ⁇ g of chromosomal DNA was completely digested with various restriction enzymes, electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and then plotted on a nylon membrane, followed by the following manual.
  • Hybridization was carried out using DIG Easy Hyb (manufactured by Schia Diagnostics), followed by prehybridization at 50 ° C for 1 hour, followed by addition of a probe and hybridization at 0 / N. It was made a decision.
  • Band detection was performed using DIG Nucleotide Detection Mt.
  • a Pstl fragment of about 4 kbp which strongly hybridized using the PCR fragment as a probe was detected.
  • this Pstl fragment was obtained by colony hybridization. After treating 20 g of the chromosomal DNA with Pstl, the fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 4 kbp was recovered.
  • nucleotide sequence of plasmid DNA recovered from the obtained clone was determined, it was found to have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the 678 bp orf containing the nucleotide sequence corresponding to the determined internal amino acid sequence was found. was obtained.
  • a fragment amplified from 83 chromosomal DNA was digested with BaraHI / Hindlll to construct a plasmid pUCALD inserted into the BamHI / Hindlll site of pUC18.
  • the constructed expression plasmid was introduced into E. coli JM109, and the transformant was shaken in a LB medium containing 50 ⁇ g / m 1 ampicillin at 37 ° C overnight (preculture).
  • the preculture was seeded at 1% in 50 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. About 2 hours after the start of the culture, add IPTG to the final concentration of 1 mM, and add
  • the cells were suspended in C1 (pH 7.6), and the cells were broken using a multi-beads shocker (manufactured by Yasui Kikai). The supernatant obtained by centrifuging the disrupted solution at 15,000 rpm for 10 minutes was used as a crude enzyme solution.
  • I HOG oxoglutaric acid
  • the amount of I HOG produced was increased in the aldolase-expressing E. coli addition section, and I HOG could be produced by the aldolase.
  • the promoter region of the rp operon on the chromosomal DNA of E. coli W3110 was amplified by PCR (combination of SEQ ID NOs: 10 and 11) using the oligonucleotides shown in Table 8 as primers, and the resulting DNA fragment was pGEM-Tease Ligation was performed on a vector (promega).
  • E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, and a strain having the desired plasmid in which the direction of the trp promoter was inserted in the opposite direction to the lac promoter was selected from ampicillin-resistant strains.
  • this plasmid was ligated with a DNA fragment containing the trp promoter obtained by processing with Eco0109I / EcoRI and EcoUClOW / EcoRI-treated pUC19 (Takara).
  • E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pTrpl.
  • pKK223-3 (Amersham Pharmacia) was treated with HindlllZHincII, and the resulting DNA fragment containing the rrnB terminator was treated with Hindlll / PvuII of pTrpl. It was ligated with a physical object.
  • coli JM109 with this ligation solution was transformed, to select a strain having a plasmid of interest from among ⁇ ampicillin resistant strains, a plasmid was named P Trp2.
  • the trp promoter region was amplified by PCR (combination of SEQ ID NOs: 10 and 12) using P Trp2 as a type II and oligonucleotides shown in the table as primers.
  • This DNA fragment was treated with Eco0109I / NdeI, and ligated with EcoT1109 / Ndel-treated pTrp2.
  • E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and this plasmid was named pTrp4.
  • the fragment amplified from chromosome DNA was digested with Ndel / Hindlll to construct a plasmid ptrpALDl inserted into the Ndel / Hindi II site of pTrp4.
  • This plasmid expresses an aldolase gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 using the ATG at position 444 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a translation initiation codon.
  • the fragment amplified from chromosome DNA of P. taetrolens ATCC4683 using primers (SEQ ID NOS: 9 and 14) was also used.
  • the plasmid ptrpALD2 digested with Ndel / Hindlll and inserted into the Ndel / Hindlll site of pTrp4 was constructed.
  • This plasmid expresses an aldolase gene consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 using the ATG at position 456 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a translation initiation codon.
  • the thus constructed expression plasmid was introduced into E. coli JM109, and the transformant was shaken overnight at 37 ° C. in an LB medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin (preculture).
  • the preculture was seeded at 1% in 50 ml of LB medium, and main culture was performed at 37 ° C. About 2 hours after the start of the culture, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was further performed for 3 hours. After completion of the culture, the cells are collected, washed, and suspended in lm1 of 2 OmM Tris-HC1 (pH 7.6). The cells were disrupted using a bead shocker (manufactured by Yasui Kikai). The supernatant obtained by centrifuging the disrupted solution at 15,000 rpm for 10 minutes was used as a crude enzyme solution.
  • a bead shocker manufactured by Yasui Kikai
  • the P. coronafaciens A J 2791 strain was cultivated at 30 ° C using 50 ml of broth medium (preculture). Using this culture solution (5 ml) as a seed bacterium, main culture was carried out using 50 ml of a broth medium. After culturing until the late stage of logarithmic growth, 5 Oml of the culture was subjected to a centrifugation operation (1200 Oxg, 4 ° C, 15 minutes) to collect the cells. Using these cells, chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
  • the cloning of the I HOG aldolase (PcALD) gene derived from the P. coronafaciens AJ 2791 strain was performed by Southern angle analysis and colony hybridization using the IHO G aldolase gene derived from the P. taetrolens ATCC 4683 strain as a probe. Carried out. Using the primers ALD-5 'Nde-1 (SEQ ID NO: 13) and ALD-3' Hind (SEQ ID NO: 9) shown in Table 9, the full-length I HOG aldolase gene was subjected to PCR from chromosomal DNA of P. taetrolens ATCC 4683. Amplified.
  • the colonies were transferred to a nylon membrane filter (Hybond-N, manufactured by Amersham) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using DIG Easy Hyb. The nylon membrane filter was immersed in buffer and prehybridized at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the prepared labeled probe was added, and hybridization was performed at 37 ° C. for 16 hours. The nylon membrane filter was washed twice at room temperature for 5 minutes using 2 ⁇ SSC, and then twice for 15 minutes at 37 ° C. using 0.1 ⁇ SSC. Detection of colonies that hybridized with the probe was performed using the DIG Nucleotide Detection Kit (Roche Diagnostics). As a result, a clone hybridizing with the probe was obtained.
  • the constructed P cALD gene transfer plasmid was designated as pUCPcALD.
  • pUCPcALD was introduced into E. coli JM109, and the transformant was shaken in a LB medium (LB-amp medium) containing 50 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C for 24 hours (pre-culture). Add 50 precultures The cells were seeded at 1% in m1 LB medium and cultured at 37 ° C. About 2 hours after the start of the culture, IPTG was added to a final concentration of ImM, and the culture was further performed for 3 hours.
  • LB medium LB-amp medium
  • IPTG was added to a final concentration of ImM
  • the cells were collected, washed, suspended in lm1 of 2 OmM Tris-HC1 (pH 7.6), and the cells were broken using a multi-beads shocker (manufactured by Yasui Kikai). The supernatant obtained by centrifuging the disrupted solution at 15,000 rpm for 10 minutes was used as a crude enzyme solution.
  • aldolase activity was measured using PHOG as a substrate.
  • E. coli control
  • pUCADL pUCADL-introduced strain
  • the PHOG aldolase activity of 39.3 U / mg protein was detected. This indicated that the gene encoded the aldolase of interest.
  • P t ALD Recombinant P t ALD was purified from the soluble fraction of E. coli in which P. taetrolens AT CC 4683-derived aldolase (hereinafter, P tALD) was highly expressed as follows.
  • P tALD P. taetrolens AT CC 4683-derived aldolase
  • the aldol degradation activity using PHOG as a substrate was measured under the following conditions. Reaction conditions: 5 OmM Tr is- HC 1 ( . PH8 0), 2 mM PHOG, 0. 2 mM N AD, 0. 2mM Kp i, 1 mM M g C 1 2, 16 U / m 1 lactate dehydrogenase, 3 ⁇ 1 enzyme / 600 ⁇ reaction solution, measure absorbance at 340 nm at 30 ° C
  • E. coli JM109 / ptrpALD2 cells cultured on LB-amp plate medium at 37 ° C for 16 hours are scraped with a platinum loop, inoculated into a test tube containing 3 ml of LB-amp medium, and shaken at 37 ° C for 16 hours. Culture was continued. 0.5 ml of the culture was inoculated into 10 500 ml 1 volume flasks containing 50 ml of LB-amp medium, and cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours. The cells were collected from the resulting culture by centrifugation, suspended in buffer A (2 OmM Hepes-KOH (pH 7.6)), washed, and then collected again by centrifugation.
  • buffer A (2 OmM Hepes-KOH (pH 7.6)
  • the obtained washed cells were suspended in 25 ml of buffer A and sonicated at 4 ° C for 30 minutes.
  • the solution in which the aldolase activity is detected is dialyzed against buffer B (2 OmM Hepes-KOH (pH 7.6), 1 M ammonium sulfate, pH 7.6) at 4 ° C, and centrifuged at lOOO rpm for 10 minutes. The supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ filter. The obtained filtrate was applied to a hydrophobic chromatography column Phenyl Sepharose HP HR 16/10 (manufactured by Pharmacia) equilibrated with buffer B. By this operation, the aldolase was adsorbed on the carrier.
  • the aldolase was eluted by changing the concentration of ammonium sulfate linearly from 1 M to 0 M.
  • the aldolase activity was measured for each of the obtained elution fractions, and the aldolase activity was observed at the elution position where the concentration of ammonium sulfate was about 0.2 M.
  • Pc ALD aldolase
  • E. coli JM109 I pUCPcALD cells cultured on an LB-amp plate medium at 37 ° C for 16 hours were scraped with a platinum loop, inoculated into a test tube containing 3 ml of LB-amp medium, and shaken at 37 ° C for 16 hours. Culture was continued. 0.5 ml of the culture was inoculated into seven 500 ml flasks containing 50 ml of LB amp medium (+0.1 mM IPTG) and cultured with shaking at 37 ° C for 16 hours. The cells were collected from the obtained culture by centrifugation, suspended in buffer A (2 OmM Hepes-KOH (pH 7.6)), washed, and then collected again by centrifugation.
  • buffer A (2 OmM Hepes-KOH (pH 7.6)
  • the washed cells obtained were suspended in 30 ml of buffer 1A, and sonicated at 4 for 30 minutes.
  • the lysate was centrifuged + (x 8000 rpm, 10 minutes X 2 times) to remove bacterial cell residues, and the resulting supernatant was used as a crude extract fraction.
  • the obtained crude extract fraction was purified by column chromatography in the same manner as in the purification of the recombinant PtALD described in Example 4.
  • the fraction purified by two-step power chromatography using Q-Sepharose and Phenyl Superose was subjected to SDS-PAGE, a single band was detected by CBB staining at a position corresponding to about 25 kDa.
  • the obtained recombinant P c ALD solution was dialyzed against buffer A at 4 ° C. By the above operation, 10 ml of a 108 U / ml PcALD solution was obtained.
  • I HOG 4- (indole-13-ylmethyl) -14-hydroxy-2 from pyruvate and pyruvate in India —Oxodaltaric acid (I HOG) was synthesized.
  • IHOG was quantified by HPLC analysis using “Inertsil 0DS-2” (5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm) manufactured by GL Sciences. The analysis conditions are as shown below.
  • OmM Hepes-KOH (pH8. 5), 5 ⁇ mM indole over 3-pyruvate, 2 50 mM pyruvate, 1 mM to 5 mM M g C 1 2 comprises a reaction solution P t ALD, P cALD a 1. 8UZm 1, 0.8 U / m 1 and reacted at 33 ° C. for 4 hours.
  • the enzyme reaction solution was appropriately diluted, and the amount of IH ⁇ G produced was quantified. As a result, I HOG could be produced by the aldolase.
  • the aldol condensation activity of pyruvic acid for various substrates listed in Table 11 was measured.
  • 10 OmM Glycine- N a OH (pH9 ), 50 mM substrate, sodium 25 Omm pyruvate, LMM MgC l 2, to prepare a reaction solution consisting of 0. 1 mg / m 1 P t ALD, 2 hours at 33 ° C Incubated.
  • the obtained reaction solution was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane Microcon 10 (manufactured by Amicon) having a cut-off molecular weight of 10000.
  • the filtrate 2 ⁇ 1 was diluted in 200/1 50% acetonitrile / 0.1% ammonia aqueous solution and subjected to ESI-MS analysis.
  • Vm a X (for PH0G) 91.7 ⁇ mol / min / mg
  • Km (for PH0G) 0.10 mM
  • Km (for MgCl 2 ) 0.019 mM
  • Ka (for Kpi) 0.95mM.
  • seven times 2 Compared to the untreated silage by MgC 1 2 ⁇ Ka ⁇ of ImM, active respectively to twice the untreated silage was increased by 5 mM KPB added.
  • the aldol condensation activity between acetoaldehyde and ⁇ -ketobutyrate was measured.
  • the obtained reaction solution was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane Microcon 10 (manufactured by Amicon) having a molecular weight cutoff of 10,000.
  • the filtrate was diluted with 200 ⁇ l of 50% acetonitrile / 0.1% ammonia aqueous solution, and subjected to ESI-MS analysis.
  • the aldolase of the present invention is a novel aldolase that catalyzes the aldol condensation reaction between indolepyruvic acid and pyruvic acid (or oxa-mouth acetate), and is useful as an intermediate in monatin synthesis (indole-3-ylmethyl). It can be suitably used for the synthesis of 4-hydroxy-2-oxoglutarate (4- (Indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy-2-oxoglutarate; IHOG).

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Abstract

Pseudomonas属、Erwinia属、Flavobacterium属、Xanthomonas属に由来する新規アルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から、モナティン合成における中間体として有用な４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を合成することができる。

Description

明 細 書 新規アルドラーゼぉよび置換 α—ケト酸の製造方法 技術分野
本発明は、 アルドラーゼおよび置換 α—ケト酸の製造方法に関し、 より詳細には、 モナ ティン合成における中間体として有用な 4一 （インドールー 3—ィルメチル） 一4ーヒ ド 口キシー 2—ォキソグノレタル酸 (4- (Indol-3-ylmethyl) -4-hydroxy-2~oxoglutarate；以 下、 I H O G) の合成に好適に利用できるアルドラーゼおよび置換 α—ケト酸の製造方法 に関する。 背景技術
下記式 （5 ) に示す構造を有するモナティンは、 南アフリカの灌木の根から単離'抽出 された天然の甘味ァミノ酸であり、 ショ糖の数十倍〜数千倍に相当する強い甘味を有し、 甘味剤として利用が期待されている。 しかし、 まだモナティンの有用性に関しては発見さ れたばかりであり、工業的生産レベルでのモナティンの合成方法に関しては確立されてい ない。
Figure imgf000002_0001
かかる状況下、本発明者らは、試薬として購入可能であるィンドールピルビン酸とピル ビン酸とを用いて、下記の反応①および②からなる新たなモナティンの合成方法を開発し た。
① インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしォキサ口酢酸） のアルドール縮合により 前駆体ケト酸 （I H O G) を合成する反応工程
② I H O Gの 2位をァミノ化する反応工程 ピルビン酸
0
、OH
^COOH ό ① COOH 00H
R^ ^^COOH ② 。
► R^？J^^COOH O OH ΝΗ2
Η+ .
置換 α—ケト酸 、ΟΗ
OH Ο C°2T
ォキサ口酢酸
上記モナティンの合成ルートにおける①のアルドール縮合反応について、微生物酵素系 を用いてィンドールピルビン酸とピルビン酸（ないしォキサ口酢酸）から前駆体ケト酸（ I H O G) を合成させた例は、 これまでに報告されていない。
ο ι
2分子の α—ケト酸（ないしは置換 —ケト酸） を基質としたアルドール縮合を触媒す る微生物酵素としては、 これまでに、 シユードモナス（Pseudomonas)属細菌由来の 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase^ およひ、 E. coli、 B. subtilisなどに存 在する 4- Hydroxy- 2 - oxoglutarate aldolaseの 2例が報告されている。
前者の 4- Hydroxy- 4- methyl- 2_oxoglutarate aldolaseは、 ピルビン酸 2分子から 4一 ヒ ドロキシー 4ーメチルー 2—ォキソダルタル酸
(4-Hydroxy - 4 - methyl-2 - oxoglutarate： 4— HMG) を生成する反応、 および、 4-oxalocitraraalateからォキサ口酢酸 1分子とピルビン酸 1分子を生成する反応を触媒 することが報告されている (Kiyofumi Maruy謹、 Journal of Biochemistry, 108, 327-333 (1990) ) 。 また、 後者の 4- Hydroxy-2- oxoglutarate aldolaseは、 グリオキシル酸 1分子 とピルビン酸 1分子から 4ーヒドロキシ一 2—ォキソグルタル酸
(4-Hydroxy-2-oxoglutarate ： 4 H G) を生成する反応を触媒することが知られている。 しかし、 これらのいずれの菌株からも、 4 _フエ二ルメチルー 4—ヒドロキシー 2—ォ キソダルタル酸 （以下、 P H O G) 分解活性や、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （な いしォキサ口酢酸） からモナティンの前駆体ケト酸 （I H O G) を合成する活性について の報告 ·知見は全く無く、 これらの菌株が産生するアルドラーゼを上述のモナティンの合 成ルートに使用できるかについては不明であった。
本発明は、モナティン合成における中間体として有用な I H O Gの合成に好適に利用で きるアルドラーゼ、 および、 置換ひーケト酸の製造方法を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは上記問題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、 ある種の微生物に、 目的とする I HO Gの合成に好適に利用できるアルドラーゼが存在することを見出し、本発明に想到し た。
即ち、 本発明は以下の通りである。
〔1〕 下記 （a) または （b) の DNA。
( a )配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 444〜 1 1 18若しく は塩基番号 456〜 11 18の塩基配列からなる D N A
( b )配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 444〜 1 1 18若しく は塩基番号 456〜 1 1 18の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとス トリン ジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコー ドする DNA
〔2〕 下記 （c) または （d) の DNA。
( c )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
( d )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA 〔3〕 . 下記 （e) または （f ) の DNA。
(e)配列表の配列番号 15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 398〜 1 141の塩 基配列からなる DNA
( f )配列表の配列番号 15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 398〜 1 141の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
〔4〕 下記 （g) または （h) の DNA。
( g )配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D N A ( h )配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質をコードする DN A
〔5〕 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに記載の DNAとベクター DNAとを接続して得られ ることを特徴とする組換え DNA。
〔6〕 〔5〕 記載の組換え DNAによって形質転換された細胞。
[7] [6] 記載の細胞を培地中で培養し、 培地および/または細胞中にアルドラーゼ 活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有するタン パク質の製造方法。
〔8〕 下記 （ i ) または （j ) のタンパク質。
( i )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
〔9〕 下記 （k) または （1 ) のタンパク質。
(k) 配列表の配列番号 1 6記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
〔1 0〕 （A) インドール一 3 -ピルビン酸とピノレビン酸とをァノレドール縮合させて 4 一 （インドールー 3—ィルメチル） 一 4ーヒドロキシー 2—ォキソグルタル酸を生成する 反応を触媒する活性、および/または、 フエ二ルビルビン酸とピルビン酸とをアルドール 縮合させて 4—フエ二ルメチルー 4—ヒドロキシー 2_ォキソグルタル酸を生成する反 応を触媒する活性を有し、
(B) (A) 記載の活性の至適 pHが 33 °Cにおいて約 9であり、 かつ、
(C) ゲルろ過法により測定した分子量が約 146 kD aであり、 SDS— PAGE法に より測定したサブュニットあたりの分子量が約 25 kD aである
ことを特徴とするタンパク質。
〔1 1〕 (A) アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、 (B) シユードモナス （Pseudomonas) 属に由来し、
(C) pH6以上で pH安定性を有し、
(D) 70°C以下で温度安定性を有し、 かつ、
( E ) ゲルろ過法により測定した分子量が約 146 kDaであり、 SDS— PAGE法に より測定したサブュニットあたりの分子量が約 25 kDaである
ことを特徴とするタンパク質。
〔12〕 酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が 向上することを特徴とする 〔1 1〕 記載のタンパク質。
〔13〕 シユードモナス （Pseudomonas) 属細菌を培地中で培養し、 培地および Zまた は細胞中に下記 （ i ) 〜 （ 1 ) のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、 .前記培地および
Zまたは細胞を精製処理することにより得られるァノレドラーゼ活性を有する組成物。
( i )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜225のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
( k ) 配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
〔14〕 下記一般式 （1)
R1 ノ COOH
(一般式 （1) において、 R1は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 20までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体である。 R1は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換 基により置換されていてもよレ、。 )
で表される置換ひ一ケト酸と、
下記一般式 （2 )
Figure imgf000007_0001
(一般式 （2 ) において、 R2は、 水素、 炭素数 1〜 8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体である。 R2は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換 基により置換されていてもよい。 ただし、 一般式 （1 ) において、 R1が水素、 メチル基 またはカルボキシメチル基である場合は、 R2は水素ではない。 ） で表される置換 α—ケ ト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式 （3 )
Figure imgf000007_0002
(一般式 （3 ) における R1および R2は、 一般式 （1 ) および （2 ) における R1および R2と同義である。 ）
で表される置換 α—ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換 α—ケト 酸の製造方法。
〔1 5〕 前記 R2は、 水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、 〔1 4〕 記 载の置換 α—ケト酸の製造方法。
〔1 6〕 前記 R2は、 水素であることを特徴とする、 〔1 5〕 記載の置換 α—ケト酸の 製造方法。
〔1 7〕 前記 は、 ベンジル基または 3—インドリルメチル基であり、 前記 は、 水 素またはカルボキシル基であることを特徴とする、 〔1 4〕 記載の置換 α—ケト酸の製造 方法。
〔1 8〕 インドール一 3―ピルビン酸と、 ォキサ口酢酸またはピルビン酸と力ゝら、 下記 式 （4 )
Figure imgf000008_0001
に表す置換ひーケト酸を製造する方法であって、当該反応を触媒するタンパク質存在下で 反応を実施することを特徴とする、 置換 α—ケト酸の製造方法。
〔1 9〕 前記反応を触媒するタンパク質は、 シユードモナス （Pseudomonas) 属、 エル ウイニァ （Erwinia) 属、 フラボパクテリゥム （Flavobacterium) 属、 キサントモナス (Xanthomonas) 属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、 〔1 4〕 〜 〔1 8〕 記載の置換ひ—ケト酸の製造方法。
〔2 0〕 前記微生物は、シユードモナス タエトロレンス （Pseudomonas taetrolens) 、 シユードモナス コロナファシエンス (Pseudomonas coronafaciens) 、 シュート、モナス ァスモリティカ (Pseudomonas desmolytica) 、 ェノレウイニァ エスピー (Erwinia sp. ) 、 フラポバクテリ ゥム レナム (Flavobacterium rhenanum) 、 またはキサントモナス シ トリ （Xanthomonas citri) であることを特徴とする 〔1 9〕 記載の置換 a—ケト酸の製 造方法。
〔2 1〕 前記微生物は、 シユードモナス タエトロレンス （Pseudomonas taetrolens) A T C C 4 6 8 3、 またはシユー ドモナス コロナファシエンス （Pseudomonas coronafaciens) A J 2 7 9 1であることを特徴とする 〔 2 0〕 記載の置換 a—ケト酸の 製造方法。
〔2 2〕 前記反応を触媒するタンパク質は、 下記 （i ) 〜 （1 ) のうちいずれかのタン パク質であることを特徴とする 〔1 4〕 〜 〔2 1〕 記載の置換 α—ケト酸の製造方法。 ( i )配列表の配列番号 2記载のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記载のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜2 2 5のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
( k ) 配列表の配列番号 1 6記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
〔2 3〕 下記一般式 （： T)
R1、メ
Figure imgf000009_0001
(一般式 （1 において、 R1は、 水素、 炭素数 1〜 8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体であり、 R3は、 水素またはカルボキシル基である。 R1は、 更にハロゲン原子、 水酸基、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からな る群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよレ、。 )
で表される化合物と、
下記一般式 （2 ') … ）
Figure imgf000009_0002
(一般式 （2 ') において、 R4は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体である。 R4は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基おょぴァミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置 換基により置換されていてもよい。 ) で表される置換 α—ケト酸とを反応せしめることに より、
下記一般式 （3')
Figure imgf000010_0001
(一般式 （3') における R R3および R4は、 一般式 （1') および （2') における R R3および R4と同義である。 ）
で表される置換 α—ケト酸を製造する方法であって、
〔8〕 または 〔9〕 のいずれかに記載のタンパク質の存在下で反応を実施することを特徴 とする、 置換 α—ケト酸の製造方法。
〔24〕 前記 R4は、 水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、 〔23〕 記 載の置換 α—ケト酸の製造方法。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明のアルドラーゼの製造工程を示すフローチャートである。
第 2図は、 PHOG濃度に対する Pseudomonas taetrolens ATCC4683由来のァ ルドラーゼ （P tALD) のアルドラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。 第 3図は、 MgC 1。濃度に対する P t A LDのアルドラーゼ活性を測定した結果を示 第 4図は、 KP i濃度に対する P tALDのアルドラーゼ活性を測定した結果を示すグ ラフである。
第 5図は、 P tALDの pH安定性を測定した結果を示すグラフである。
第 6図は、 P tALDの温度安定性を測定した結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について、
[I] アルドラーゼ
[II] アルドラーゼを用いた置換 a—ケト酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
[I] アルドラーゼ
本発明者らの研究により、 Pseudomonas属、 Erwinia属、 Flavobacterium属、 Xanthomonas 属に、 4_フエ二ルメチルー 4ーヒドロキシー 2—ォキソグルタル酸 (PHOG) の分解 活性を有するアルドラーゼを生成する菌株が存在することが確認された。
これらの微生物が産生するアルドラーゼは、 PHOG 1分子を分解して、 フエニルピル ビン酸 1分子およびピルビン酸 1分子を生成する反応を触媒することから、本発明者らは、 当該アルドラーゼが、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） から 4 一 (ィンドール一 3 _ィルメチル) _4—ヒ ドロキシ一 2 _ォキソダルタル酸 ( I HOG) を合成する反応を触媒しうると考えた。 この考えに基づき、 本発明者らは、 新規アルドラ ーゼの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からアルドラーゼを精製単離するとと もに、 この酵素がインドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） のアルド一 ル縮合により I HOGを合成することを発見した。
また、 本発明者らは、 Pseudomonas taetrolens ATCC4683由来のアルドラーゼ (以下、 P t ALDと略す場合がある） を精製し、該アルドラーゼのアミノ酸配列を決定 した。 さらに、該アルドラーゼのアミノ酸配列から演繹した 30塩基対程度の DNA分子 を合成し、これを用いて PC R法により当該アルドラーゼをコ一ドする DN Aの一部を単 離 ·取得し、 さらに該 DN A断片をプローブとして利用し、 P t ALDをコードする DN A全長をこの微生物の染色体ライブラリ一から単離することに成功した。
上記方法によって特定された本発明の P t ALDをコードする DNAを配列表の配列 番号 1に示す。 また、配列表の配列番号 2および 3に、 配列表の配列番号 1の塩基配列が コードする P t ALDのアミノ酸配列を示す。配列表の配列番号 2は、配列表の配列番号 1記載の塩基配列のうち、塩基番号 456〜 1 1 18の塩基配列がコードする P t ALD のアミノ酸配列である。 また、配列表の配列番号 3は、配列表の配列番号 1記載の塩基配 列のうち、塩基番号 444〜 11 18の塩基配列がコードする P tALDのァミノ酸配列 であり、配列番号 2記載のァミノ酸配列中、残基番号 5〜225のァミノ酸配列に相当す る。配列表の配列番号 2および 3記載のいずれの P t A L Dも、アルドラーゼ活性を有し、 ィンドールピルビン酸 1分子とォキサ口酢酸（ないしピルビン酸） 1分子から、下記式（ 4 ) に示す 4一（ィンドール一 3—イノレメチル）一 4ーヒ ドロキシー 2—ォキソグルタル酸（ I HOG) を合成する反応を触媒する。
さらに、本発明者らは、取得した P tALDをコードする DN A断片をプローブとして 利用し、 Pseudomonas coronafaciens AT C C 4683由来のァノレドラーゼ （以下、 P c ALDと略す場合がある） をコードする DNA全長を、該微生物の染色体遺伝子ライブラ リ一から単離することに成功した。上記方法によって特定された本発明の P c A L Dをコ ードする DN Aを配列表の配列番号 15に示す。 また、 配列表の配列番号 16に、配列表 の配列番号 15の塩基配列がコードする P cALDのァミノ酸配列を示す。配列表の配列 番号 16は、配列表の配列番号 15記載の塩基配列のうち、塩基番号 398〜 1141の 塩基配列がコードする P c ALDのアミノ酸配列である。配列表の配列番号 16記載の P cALDもまたアルドラーゼ活性を有し、 インドールピルビン酸 1分子とォキサ口酢酸 (ないしピルビン酸） 1分子から、 下記式 （4) に示す 4一 （インドール— 3—ィルメチ ル） 一4—ヒドロキシ一 2—ォキソグルタル酸 ( I HOG) を合成する反応を触媒する。
Figure imgf000012_0001
次に、 本発明のアルドラーゼについて、
(1) アルドラーゼをコ一ドする DNA、
(2) アルドラーゼの性質、
(3) アルドラーゼの製造方法
の順に詳細に説明する。
(1) アルドラーゼをコ一ドする DNA 配列表の配列番号 1の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述したよう に Pseudomonas taetrolens A T C C 4 6 8 3株の染色体 D N Aから単離されたものであ る。 配列表の配列番号 1の塩基配列は、 既知の Pseudomonas ochraceae細菌由来の 4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase ( 伝子名 p r o A) (Biosci. Biotechnol. Biochem.， 65 (12) , 2701 - 2709 (2001) Maruyama K. , et. al.，） とアミノ酸配列において、 2 9 %の相同性を示す。
また、配列表の配列番号 1 5の塩基配列を有する本発明のアルドラーゼ遺伝子は、前述 したように Pseudomonas coronafaciens A J 2 7 9 1株の染色体 D N Aから単離された ものである。 配列表の配列番号 1 5の塩基配列は、 既知の Pseudomonas ochraceae細菌由 来の 4-Hydroxy-¾-methyl-2-oxoglutarate aldolase 這 fe子名 r o A) (Biosci.
Biotechnol. Biochem. , 65 (12) , 2701-2709 (2001) Maruyama K. , et. al. , ) とアミノ酸 配列において、 2 8 %の相同性を示し、また、上述の本発明の Pseudomonas taetrolens A T C C 4 6 8 3株由来のアルドラーゼと 4 1 %の相同性を示す。
なお、 ここでの相同性の解析は、 遺伝子解析ソフト 「Genetyx ver. 6」 （ゲネテイクス 社） を用い、 パラメータを初期設定値として算出した値である。
アルドラーゼ産生菌からアルドラーゼをコードする D NAを取得する方法について説 明する。 . はじめに、 精製されたアルドラーゼのアミノ酸配列を決定する。 この際、 エドマン法 (Edman, P. , Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950) ) を用いてアミノ酸配列を決定すること ができる。 また Applied Biosystems社製のシークェンサ一を用いてアミノ酸配列を決定 することができる。 本発明の Pseudomonas taetrolens A T C C 4 6 8 3株由来アルドラ ーゼについて、プロテアーゼで限定分解した後に逆相 H P L Cにてペプチド断片を分取し、 それら断片のうち 2つについて内部アミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号 4お ょぴ 5に示される配列が明らかとなつた。
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードする D N Aの塩基配列を演繹で きる。 D N Aの塩基配列を演繹するには、 ユニバーサルコドンを採用する。
演繹された塩基配列に基づいて、 3 0塩基対程度の D N A分子を合成する。 該 D N A分 子を合成する方法は Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。 また、 Applied Biosystetns社製のシンセサイザーを用いて該 DNA分子を合成できる。 該 DN A分子は、 アルドラーゼをコードする DNA全長を、 アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ラ イブラリーから単離する際に、 プローブとして利用できる。 あるいは、 本発明のアルドラ ーゼをコードする DNAを PCR法で増幅する際に、 プライマーとして利用できる。 ただ し、 PCR法を用いて増幅される DNAはアルドラーゼをコードする DNA全長を含んで いないので、 PCR法を用いて増幅される DNAをプローブとして用いて、 アルドラーゼ をコードする D N A全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
P CR法の操作については、 White, T.J. et al. , Trends Genet. 5, 185 (1989)等に 記載されている。 染色体 DNAを調製する方法、 さらに DNA分子をプローブとして用い て、遺伝子ライプラリーから目的とする DNA分子を単離する方法については、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
単離されたアルドラーゼをコ一ドする DNAの塩基配列を決定する方法は、 APractical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons' Inc. (1985)に記載されている。 また、 Applied Biosystems社製の DNAシークェンサ一を用いて、 塩基配列を決定することが できる。 Pseudomonas taetrolens ATCC 46 8 3株由来アルドラーゼをコードする D N Aを配列表配列番号 1に示し、 Pseudomonas coronafaciens A J 279 1株由来アルド ラーゼをコードする D N Aを配列表配列番号 1 5に示す。
なお、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） から I HOGを合成 する反応を触媒するアルドラーゼをコードする D N Aは、配列表の配列番号 1および 1 5 に示される DNAだけではない。 すなわち、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないし ォキサ口酢酸） から I HOGを合成する反応を触媒するアルドラーゼを生成する
Pseudomonas属のうち、 種および株ごとに、 塩基配列の違いが観察されるはずだからであ る。
また、本発明の DNAは単離されたアルドラーゼを ードする DNAのみではなく、 当 然ながら、アルドラーゼ産生菌の染色体 DNAから単離されたアルドラーゼをコードする D N Aに人工的に変異を加えた D N Aであっても、 アルドラーゼをコードする場合には、 本発明の DNAである。 人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、 Method, in Enzymol. , 154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。 また、配列表配列番号 1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件でハイブリダィズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードす る DNAも本発明の DNAである。 ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特 異的なハイプリッドが形成され、非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。 こ の条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い DN A同士、 例えば 50 %以上、 より好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90 %以上、 特に好ま しくは 95%以上の相同性を有する DN A同士がハイブリダィズし、それより相同性が低 い D N A同士がハイプリダイズしなレ、条件、あるいは通常のサザンハイプリダイゼーショ ンの洗いの条件である 37 °C、 0. 1 XSSC、 0. 1% SD S、 好ましくは 60。C、 0. 1 XS SC、 0. 1% SDS、 さらに好ましくは 65°C、 0. 1 XS SC、 0. 1% SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件があげられる。 また、 「アルドラーゼ 活性」 とは、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） から I HOGを 合成する活性であればよい。 ただし、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列と相補的な塩 基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、 33 °C、 p H9の条件下で配列表の配列番号 2または 3に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 の 10 %以上、 好ましくは 30 %以上、 より好ましくは 50 %以上、 さらに好ましくは 7 0 %以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
また、配列表配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとスト リンジェントな条件でハイブリダイズし、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコード する DNAも本発明の DNAである。 ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる 特異的なハイプリッドが形成され、 非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に数値ィヒすることは困難である力 一例を示せば、相同性が高い DNA同 士、 例えば 50 %以上、 より好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90 %以上、 特に 好ましくは 95 %以上の相同性を有する DN A同士がハイブリダイズし、それより相同性 が低い DNA同士がハイブリダィズしない条件、あるいは通常のサザンハイプリダイゼー ションの洗いの条件である 37°C、 0. 1 XSSC、 0. 1 % SDS、好ましくは 60 °C、 0. 1 XS SC、 0. 1% SDS、 さらに好ましくは 65°C、 0. 1 XS SC、 0. 1 % SDSに相当する塩濃度でハイプリダイズする条件があげられる。 また、 「アルドラーゼ 活性」 とは、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） から I HOGを 合成する活性であればよレ、。 ただし、配列表の配列番号 15に記載の塩基配列と相補的な 塩基配列とストリンジェントな条件でハイプリダイズする塩基配列の場合には、 33 °C、 p H 9の条件下で配列表の配列番号 16に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質の 1 0 %以上、 好ましくは 3◦ %以上、 より好ましくは 50 %以上、 さらに好ましくは 70 % 以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
さらに、配列表の配列番号 1または 15に記載の D N Aがコードするアルドラーゼと実 質的に同一のタンパク質をコードする DNAも本発明の DNAである。 すなわち、
( a )配列表の配列番号 1記載の塩基配列中塩基番号 444〜 1 118若しくは塩基番号 456〜 1 118の塩基配列からなる D N A
( b )配列表の配列番号 1記載の塩基配列中塩基番号 444〜 1118若しくは塩基番号 456〜 1 1 18の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな 条件でハイプリダイズし、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DN A
( c )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
( d )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA ( e )配列表の配列番号 15記載の塩基配列中塩基番号 398〜 1141の塩基配列から なる DNA
( f )配列表の配列番号 15記載の塩基配列中塩基番号 398〜 1141の塩基配列と相 補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 了 ルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DN A
(g)配列表の配列番号 16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DN A
( h )配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質をコードする DNA も本発明の DNAである。 ここで、 「1若しくは数個」 とは、 アミノ酸残基のタンパク質 の立体構造や、 アルドラーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、 具体的には、 1 〜50個、 好ましくは 1〜30個、 さらに好ましくは 1〜1 0個である。 また、 「アルド ラーゼ活性」 とは、 前述のとおり、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口 酢酸） から I HOGを合成する活性を意味する。 ただし、 配列表の配列番号 2、 3または 1 6に記載のァミノ酸配列において 1または数個のァミノ酸残基の置換、 欠失、揷入、 付 加または逆位を含むァミノ酸配列の場合には、 33 °C、 p H 9の条件下で 33 °C、 pH9 の条件下で配列表の配列番号 2、 3または 1 6に記載のァミノ酸配列を有するタンパク質 の 1 0 %以上、 好ましくは 30 %以上、 より好ましくは 50 %以上、'さらに好ましくは 7 0 %以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
(2) アルドラーゼの性質
つぎに、精製された Pseudomonas taetrolens ATCC468 3株由来アルドラーゼ（P t ALD) および Pseudomonas coronafaciens A J 279 1株由来アルドラーゼ （P c ALD) の性質について説明する。
本発明の P tALDは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表 配列番号 2または 3に記載のアミノ酸配列を有する。 し力 し、 本発明は、 配列表の配列番 号 2および 3に記載のァミノ酸配列において 1または数個のァミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入、付カ卩または逆位を含むアミノ酸配列を有し、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質 をも含むものである。
また、 本発明の P cALDは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、 配列表配列番号 1 6に記載のアミノ酸配列を有する。 しかし、 本発明は、 配列表の配列番 号 1 6に記載のァミノ酸配列において 1または数個のァミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入、 付加または逆位を含むァミノ酸配列を有し、アルドラーゼ活性を有するタンパク質をも含 むものである。
すなわち、 本発明のアルドラーゼは、 下記（ i )〜（ 1 )のタンパク質である。
( i )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中、残基番号 5〜 225のアミ ノ酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中、残基番号 5〜 225のアミ ノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付カロ、 又は逆位を 含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
( k ) 配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
ここで、 「数個」 および 「アルドラーゼ活性」 の定義は （1) アルドラーゼをコードす る D N Aの項の説明と同義である。
本発明のアルドラーゼは、 インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） からアルドール縮合により 4— (インドール一 3—ィルメチル） 一4—ヒドロキシ一 2— ォキソダルタル酸 （I HOG) を合成する反応を触媒する。
本発明のアルドラーゼのアルドラーゼ活性の測定は、ィンドールピルビン酸とピルビン 酸 （ないしォキサ口酢酸） 力 ら生成する I HOG量を高速液体クロマトグラフィー （HP LC) により測定することにより行うことが可能である。
具体的には、 1 0 0 mM バッファー、 5 0 mM インドール一 3—ピルビン酸、 2 5 0 mM ピノレビン酸、 1 mM Mg C l 2、 1% (v/v) トルエンからなる反応液にァ ノレドラーゼを添加し、 3 3°Cで 4時間振とう反応させ、 HP LCにて生成した I HOG量 を定量することにより、 アルドラーゼ活性を見積もることができる。
I HOGの定量は、例えば、ジーエルサイエンス社製「Inertsil 0DS - 2 」 （ 5 ^ m, 4. 6 X 2 5 0 mm)を利用した H P L C分析にて定量できる。分析条件の一例を以下に示す。 移動相： 4 0% (v/v) ァセトニトリノレ / 5 mM リン酸二水素テトラプチルアン モニゥム溶液
流速： 1 m 1 / m i n
カラム温度： 4 0。C
検出： UV 2 1 0 nm
本発明のアルドラーゼは、 ィンドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） のアルドール縮合により I HOGを合成する反応を触媒できる。 2分子の α—ケト酸（な いしは置換 ーケト酸） を基質としたアルドール縮合を触媒する微生物酵素としては、 こ れまでに、 シユードモナス（Pseudomonas)属細菌由来の
4-Hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase^ および、 E. coli、 B. subtilisなどに 存在する 4 - Hydroxy-2- oxoglutarate aldolaseの 2例が報告されているが、 前者について は P HOGあるいは I HOGに作用するといつた知見.報告は全く無く、 この酵素をもち いて P HOG (および I HOG) を合成することが可能であるかについては全く不明であ つた。 また、 後者については P HOG分解活性が認められず、 この酵素を用いても PHO G (および I HOG) の合成は不可能であった。 すなわち、 本発明のアルドラーゼは、 今 まで報告されていたアルドラーゼと異なり、インドールピルビン酸とピルビン酸 （ないし ォキサ口酢酸）のアルドール縮合により I HOGを合成する反応を触媒できる点に特徴を 有するものである。 ■ つぎに、 精製された P tALDについて調べた酵素化学的性質を以下に述べる。
P t A L Dは、 下記一般式 （ 1 )
Figure imgf000019_0001
(一般式 （1 において、 R1は、 水素、 炭素数 1〜 8のアルキル基、 炭素数 1〜8の アルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 20までのァリール基も しくはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエス テル誘導体であり、 R3は、水素またはカルボキシル基である。 R1は、更にハロゲン原子、 水酸基、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からな る群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。 ） で表される化合物と、
下記一般式 （ 2一）
R4 丫 - - - (2 )
0
(一般式 （2 において、 R4は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8の アルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 20までのァリール基も · しくはァラルキル基、 炭素数 11までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエス テル誘導体である。 R4は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭 素数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの 置換基により置換されていてもよい。 ） で表される置換 α—ケト酸とから、
下記一般式 （ 3
■ ■ ■ (3， ）
Figure imgf000020_0001
(一般式 （3 における R R3および R4は、 一般式 （1 および （2 におけ る R R3および R4と同義である。 ）
で表される置換 ct—ケト酸を生成する反応を触媒する。 したがって、本発明の P t ALD を用いて一般式 （1 および一般式 （2 から一般式 （3 を製造する方法も本発 明に属する。 ここで、 前記 R4は、 水素またはカルボキシル基であることが好ましい。
? 1八乙0の至適 11は、 33°Cにおいて、 約 9付近にある。 また、 pH6以上で pH 安定性を有し、 特に pH6〜l 1の範囲で高い pH安定性を有する。 また、 70°C以下で 温度安定性を有し、 特に 20〜 60°Cの範囲内で高い温度安定性を有する。 また、 P tA LDは、酵素反応系に KP i等の無機リン酸を添加することにより、 アルドラーゼ活性が 向上する性質を有する。
P t ALDの分子量をゲル濾過法により測定したところ約 146 k D aであり、 S D S -PAGE法により測定したところ約 25 kD aであったことから、 P tALDは、 分子 量約 25 k D aのサブュニット 6量体構造をとると推察される。
(3) アルドラーゼの製造方法
次に本発明のアルドラーゼの製造方法について説明する。本発明のアルドラーゼの製造 方法としては、 （i) アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成 蓄積させる方法と、（ii)組み換え DNA技術によりアルドラーゼを生成する形質転換体を 作成し、当該形質転換体を培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法の 2つ がある。
(i) 微生物培養により生成蓄積する方法 アルドラーゼ産生菌を微生物培養することによりアルドラーゼを生成蓄積させる方法 において、 アルドラーゼの取得源となる微生物としては Pseudomonas属、 Erwinia属、 Flavobacterium属、 Xanthomonas属に属する微生物力 めげられる。
Pseudomonas fe、 Erwinia属、 F丄 avobacterium鳥、 Xanthomonas属のつり、 インドール ピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） から前駆体ケト酸 （ I HOG) を合成す る反応を触媒するアルドラーゼを生成する微生物であれば、いかなるものも本発明に使用 PJ-目 έであ。力、 Pseudomonas taetrolens A i、CC46 83、 Pseudomonas coronafaciens A J 279 1、 Pseudomonas desmo丄 ytica A J 1 582、 Erwinia sp. A J 2 9 1 7、 Xanthomonas citri A J 2797、 Flavobacterium rhenanum AJ 2468力 Sより好まし レヽ。 このうち、 特 !■こ Pseudomonas taetrolens AT C C 4683、 Pseudomonas coronafaciens A J 279 1が好ましい。 これらの微生物の寄託先を下記に示す。
( 1 ) Pseudomonas coronafaciens A J 279 1株
(i)受託番号 FERM BP— 8246 (FERM P _ 1 888 1より移管）
(ii)受託日 ' 2002年 6月 1 0日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城 県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 )
(2) Pseudomonas desmolytica A J 1 582株
(i)受託番号 FERM B P— 8247 (FERM P— 1 8882より移管）
(ii)受託日 2002年 6月 1 0日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セシター （曰本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 )
(3) Erwinia sp. A J 29 1 7株
(i)受託番号 FERM B P— 8245 (FERM P— 1 8880より移管）
(ii)受託日 2002年 6月 1 0日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 )
( 4 ) Flavobacterium rhenanum A J 2468株
(i)受託番号 FERM B P- 1 862 (ii)受託日 1 9 8 5年 9月 3 0日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 )
( 5 ) Xanthomonas citri A J 2 7 9 7株
(i)受託番号 F E RM B P— 8 2 5 0 ( F E RM P— 8 4 6 2より移管）
(ii)受託日 1 9 8 5年 9月 3 0日
(iii)寄託先 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城 県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 )
アルドラーゼの取得源となる微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であ るが、 工業的に有利な方法は、 深部通気撹拌培養法である。 栄養培地の栄養源としては、 微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用で きる。 使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
通気条件としては、 好気条件を採用する。 培養温度としては、 菌が発育し、 ァノレドラー ゼが生産される範囲であれば良い。 従って、 厳密な条件は無いが、 通常 1 0〜5 0 °C、 好 ましくは 3 0〜 4 0 °Cである。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、 アルドラーゼが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常 5時間〜 7日間、好ましく は 1 0時間〜 3日間程度である。
培養後、 菌体を遠心分離 （たとえば、 1 0 , 0 0 0 x g、 1 0分） により集菌する。 ァ ルドラーゼの大部分は菌体中に存在するので、 この菌体を破砕、 または溶菌させることに より、 アルドラーゼの可溶化を行う。 菌体破砕には、 超音波破砕、 フレンチプレス破枠、 ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、 また溶菌させる場合には、卵白リゾチ一 ムゃ、 ぺプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
アルドラーゼ産生菌由来のアルドラーゼを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料とし て精製することになるが、未破碎あるいは未溶菌残查が存在するようであれば、可溶化液 を再度遠心分離操作に供し、 沈殿する残查を除いた方が、 精製に有利である。
アルドラーゼの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば 硫安塩析法、 ゲル濾過ク口マトグラフィ一法、 ィオン交換ク口マトグラフィ一法、 疎水性 クロマトグラフィ一法、ハイドロキシァパタイトク口マトグラフィ一等を採用することが できる。 その結果、 より比活性が高いアルドラーゼ含有画分を得ることができる。
(ii)組み換え D N A技術による製法
次に、組み換え D NA技術によってアルドラーゼを製造する方法について説明する。組 み換え D N A技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多 く知られており、組み換え D N A技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパ ク質を大量生産できる。
図 1は、 本発明のアルドラーゼの製造工程のフローチヤ一トである。
先ず、 本発明の.アルドラーゼをコードする D NAを調製する（ステップ S 1 )。
次に、 調製した D NAをベクター D NAと接続して組み換え D NAを作製し（ステップ S 2 )、該組み換え D N Aによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する（ステップ S 3 )。 続いて、 該形質転換体を培地中で培養し、 培地中および/または細胞中にアルドラ ーゼを生成蓄積させる（ステップ S 4 )。
その後、 ステップ S 5に進み、 該酵素を回収'精製することによって精製アルドラーゼ を製造する。 '
また、ステップ S 5で生産した精製アルドラーゼまたはステップ S 4のアルドラーゼが 蓄積された培地および/または細胞をアルドール反応に用いることで、 目的とする置換 a ーケト酸を大量に製造することができる（ステップ S 6 )。
なお、ベクター D NAと接続される D NAは、本発明のアルドラーゼが発現可能であれ ばよレヽ。
ここで、 ベクター D NAに接続されるアルドラーゼ遺伝子としては、 上述の
( a )配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 4 4 4〜 1 1 1 8若しく は塩基番号 4 5 6〜1 1 1 8の塩基配列からなる D NA
( b )配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 4 4 4〜 1 1 1 8若しく は塩基番号 4 5 6〜 1 1 1 8の塩基配列と相補的な塩基配列か.らなる D NAとストリン ジェントな条件でハイプリダイズし、 かつ、 ァノレドラーゼ活性を有するタンパク質をコー ドする D NA
( c )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする D NA
( d )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜2 2 5のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA ( e )配列表の配列番号 1 5記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 3 9 8〜 1 1 4 1の塩 基配列からなる D N A
( f )配列表の配列番号 1 5記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 3 9 8〜 1 1 4 1の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる D NAとストリンジェントな条件でハイブリダイズ し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする D NA
( g )配列表の配列番号 1 6記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする D NA
( h )配列表の配列番号 1 6記载のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質をコードする D NA
などを使用できる。
タンパクを組み換え D,N A技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質 転換体内で該タンパクが会合し、 タンパクの封入体 （inclusion body) を形成させること が好ましい。 この発現生産方法の利点は、 目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテア ーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破碎に続く遠心分離操作 によつて簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク封入体は、 タンパク変性剤により可溶化され、 主にそ の変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性 なタンパクに変換される。 例えば、 ヒ トインターロイキン一 2の活性再生 （特開昭 6 1 - 2 5 7 9 3 1号公報） 等多くの例がある。
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化 ·活性再生等の一連の操作 が必要であり、 直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。 し力 し、 菌 体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタ ンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、 その影響を抑えることができる。 目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、 強力なプロモータの制御下、 目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパク との融合タンパクとして発現させる方法がある。
さらに、 融合タンパクとして発現させた後に、 目的のタンパクを切り出すため、 制限プ 口テアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
タンパクを組み換え D N A技術を用レ、て大量生産する場合、形質転換される宿主細胞と しては、 細菌細胞、 放線菌細胞、 酵母細胞、 カビ細胞、 植物細胞、 動物細胞等を用いるこ とができる。 宿主 -ベクター系が開発されている細菌細胞としてはェシエリヒア属細菌、 シユードモナス属細菌、コリネパクテリゥム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられる力 S、 好ましくはェシエリヒア ·コリが用いられる。 ェシエリヒア .コリを用いてタンパクを大 量生産する技術について数多くの知見があるためである。 以下、形質転換された大腸菌を 用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
アルドラーゼをコ一ドする D NAを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌におけ る異種タンパク生産に用いられるプロ干ータを使用することができ、例えば、 T 7プロモ ータ、 t r pプロモータ、 l a cプロモータ、 t a cプロモータ、 P Lプロモータ等の強 力なプロモータが挙げられる。
アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の 上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝 子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。 このような他のタンパクをコードする遺伝子 としては、 融合タンパクの蓄積量を増加させ、 変性 ·再生工程後に融合タンパクの溶解性 を高めるものであればよく、例えば、 T 7 g e n e 1 0、 j3—ガラクトシダーゼ遺伝子、 デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロン γ遺伝子、インターロイキン— 2遺伝子、 プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
これらの遺伝子とアルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み 取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結する力 \ あるいは適当な 配列の合成 D Ν Αを利用すればよレ、。
また、 生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるタ ーミネーターを連結することが好ましレ、。このターミネータとしては、 T 7ターミネータ、 f dファージターミネータ、 T 4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネ ータ、 大腸菌 t r p A遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝 子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好まし く、 Co 1 E 1由来の複製開始点を有するプラスミド、 例えば pUC系のプラスミドゃ p BR 322系のプラスミド、 あるいはその誘導体が挙げられる。 ここで、 「誘導体」 と は、 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位などによってプラスミ ドに改変を施したも のを意味する。 なお、 ここでいう改変とは、 変異剤や UV照射などによる変異処理、 ある いは自然変異などによる改変をも含む。
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカ 一を有することが好ましい。 このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発 現ベクターが市販されている （pUC系 （宝酒造 （株） 製） 、 p PROK系 （クローンテ ック製） 、 p KK 233-2 (クローンテック製) ほか） 。
プロモータ、ァノレドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコ一 ドする遺伝子、 ターミネータの順に連結した DNA断片と、ベクター DNAとを連結して 組み換え DNAを得る。
該組み換え DNAを用いて大腸菌を形質転換し、 この大腸菌を培養すると、 アルドラー ゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換され る宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にェシェ リヒア，コリ JM109 (DE 3)株、 J M 109株が好ましい。 形質転換を行う方法、 および形質転換体を選別する方法は Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
融合タンパクとして発現させた場合、 血液凝固因子 X a、 カリクレインなどの、 アルド ラーゼ内に存在しなレ、配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてアルドラーゼを 切り出せるようにしてもよレ、。
生産培地としては、 M9—カザミノ酸培地、 LB培地など、 大腸菌を培養するために通 常用いる培地を用いてもよい。 また、 培養条件、 生産誘導条件は、 用いたベクターのマー カー、 プロモータ、 宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。 アルドラーゼまたはアルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以 下の方法などがある。アルドラーゼあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されて いれば、 菌体を回収した後、 菌体を破碎あるいは溶菌させ、 粗酵素液として使用できる。 さらに、 必要に応じて、 通常の沈澱、 濾過、 カラムクロマトグラフィー等の手法によりァ ルドラーゼあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。 この場合、 アルドラーゼあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。 菌体タンパクとと もに可溶化してもよいが、 以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、 これを可 溶化するのが好ましい。 封入体を菌体から回収するには、 従来公知の方法で行えばよい。 例えば、 菌体を破壌し、 遠心分離操作等によって封入体を回収する。 タンパク封入体を可 溶化させる変性剤としては、 グァニジン塩酸 （例えば、 6 M、 p H 5〜 8 ) や尿素 （例え ば 8 M) などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析 に用いる透析溶液としては、 トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度 としては 2 0 mM〜 0 . 5 M、 p Hとしては 5〜 8が挙げられる。
再生工程時のタンパク濃度は、 5 0 0 μ g /m 1程度以下に抑えるのが好ましい。 再生 したアルドラーゼが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は 5 °C以下であることが 好ましい。 また、 変†生剤除去の方法として、 この透析法のほか、 希釈法、 限外濾過法など があり、 いずれを用いても活性の再生が期待できる。
また、 当該アルドラーゼ遺伝子がシユードモーナス属細菌に由来するものである場合、 好ましい一つの様態として、 シユードモーナス属細菌を宿主として該アルドラーゼを発 現 ·生産せしめることもできる。 この場合の宿主細胞としては、 例えば Shi-En Luらは Pseudomonas syringaeでの組み換え発現法を報告している （FEMS Microbiology Letters 210 (2002) pl l5- 121) 。 また、 Olsen, R. H.らは Pseudomonas aeruginosaでの組換え発 現法について報告している （Journal of Bacteriology, (1982) 150, p60- 69) 。 また Grapner, S.らは Pseudomonas stutzeriでの組換え発現法について報告している（Biomol. Eng. , (2000) ， 17, pl l - 16)。 ただし、 アルドラーゼ発現のための宿主細胞としてのシ ユードモナス属細菌はこれらに限定されるわけではない。 次にアルドラーゼ遺伝子をシユードモナス属細菌に導入するためのベクターについて であるが、シユードモナス属細菌細胞内で機能する複製開始点を有するプラスミ ドを用い ることが出来る。 例を挙げると Eza alyaeva らは Pseudomonas aeruginosaで機能する レプリコン TFKを有するプラスミド pKLH4. 05を報告している。 また、 グラム陰性細菌の 形質転換に用いられる、 いわゆる広宿主域ベクターを用いることも出来る。 これらのべク ターとしては RK404 (Ditta, G. ら、 Plasmid 13 (1985) pl49 - 153) や RSF1010 (Frey, J. ら、 Gene 24 (1982) p289- 296) などがシユードモナス属細菌でも機能することが知られ ている。
アルドラーゼをコ一ドする D NAとして、配列表配列番号 1に示される D NAを用いた 場合には配列番号 2または 3に記載のァミノ酸配列を有するアルドラーゼが生産され、配 列表配列番号 1 5に示される D NAを用いた場合には配列番号 1 6に記載のアミノ酸配 列を有するアルドラーゼが生産される。
[II] アルドラーゼを用いた置換 a—ケト酸の製造方法
次に、本発明の置換 α—ケト酸の製造方法について述べる。本発明の置換 α—ケト酸の 製造方法は、 下記一般式 （1 )
Figure imgf000028_0001
で表される置換 α—ケト酸と.
下記一般式 （2 )
Figure imgf000028_0002
で表される置換 α—ケト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式 （3 )
Figure imgf000028_0003
で示される置換 α—ケト酸を製造する方法であって、 当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施する点に特徴を有する。
一般式 （1 ) において、 R1は、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のアルコキ シル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もしくはァ ラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステル誘導 体である。 R1は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素数 3ま でのアルコキシ基およびアミノ基により置換されていてもよい。 R 1は、 炭素数 4以上、 好ましくは炭素数 6以上の置換基であることが好ましく、 中でも、炭素数 2 0までのァリ ール基もしくはァラルキル基 （フエニル基、 トリル基、 キシリル基、 ビフエ二ル基、 ナフ チル基、 アントリル基、 フエナントリル基等のァリール基；ベンジル基、 ベンズヒ ドリル 基、 スチリル基、 フエネチル基、 トリチル基、 シンナミル基等のァラルキル基） 、炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基 （フリル基、 チェニル基、 ピリジル基、 ピペリジル基、 ピペリジノ基、 モルホリノ基、 インドリル基等の複素環基；これらの複素環基によって置 換されたアルキル基） であることが好ましい。 R 1は、 ベンジル基または 3—インドリル メチル基であることが特に好ましく、 3 _インドリルメチル基であることが最も好ましい。 すなわち、 一般式 （1 ) の置換 α—ケト酸としては、 フエ二ルビルビン酸またはインドー ルビルビン酸が好ましく、 特にィンドールピルビン酸が好ましい。
一般式 （2 ) において、 R2は、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のアルコキ シル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリ一ル基もしくはァ ラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステル誘導 体である。 R2が芳香環または複素環を含む場合、 当該芳香環または複素環は、 ハロゲン 原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素数 3までのアルコキシ基およびアミノ基 から選ばれる少なくとも一種の置換基により置換されていてもよレ、。ただし、一般式（1 ) において、 R1が水素、 メチル基またはカルボキシメチル基である場合は、 R2は水素では ない。 R2は、 水素またはカルボキシル基であることが好ましく、 特に水素であることが 好ましい。 すなわち、 一般式 （2 ) の置換 α;—ケト酸としては、 ォキサ口酢酸またはピル ビン酸が好ましく、 特にピルビン酸が好ましい。
一般式 （3 ) において、 R1および R2は、 一般式 （1 ) および （2 ) における R1およ ぴ R2と同義である。 本発明の置換 α—ケト酸の製造方法においては、 一般式 （1 ) の置換 α—ケト酸として インドールピルビン酸を用い、一般式（2 )の置換 α—ケト酸としてピルビン酸を用いて、 下記式 （4 ) に示す I H O Gを合成することが最も好ましい。
■ ， ■ ( 4 )
Figure imgf000030_0001
当該反応を触媒するタンパク質とは、 前記一般式 ( 1 ) で表される置換 ο;—ケト酸と、 前記一般式（2 ) で表される置換 α—ケト酸とのアルドール縮合により、前記一般式（3 ) で示される置換 α—ケト酸を合成する反応を触媒できるタンパク質であれば、特に限定な く使用できる。 すなわち、 当該反応を触媒するタンパク質であれば、微生物由来のタンパ ク質であってもよいし、 化学合成法によつて合成されたタンパク質であってもよレ、。 このようなタンパク質としては、 [I] アルドラーゼの項で説明したアルドラーゼが好ま しレヽ。 この場合、 Pseudomonas 、 Erwinia属、 Flavobacterium J ^ Xanthomonas属のっ ち、 当該反応を触媒するタンパク質 （アルドラーゼ） を生成する菌体を培養して得たアル ドラーゼを用いても良いし、 （2 ) 組み換え D N A技術により当該反応を触媒するタンパ ク質を生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たアルドラーゼを用い ても良い。
当該反応を触媒するタンパク質は、 前記一般式 （3 ) で示される置換 ct一ケト酸を合成 する反応を触媒可能な限り、 レ、かなる形態で反応系に添カ卩してもよレ、。 すなわち、 当該反 応を触媒するタンパク質を単体で反応系に添加してもよいし、当該反応を触媒するタンパ ク質（ァノレドラーゼ） を含むアルドラーゼ活性を有する組成物の形態で反応系に添加して もよい。
ここで 「アルドラーゼ活性を有する組成物」 とは、 当該反応を触媒するタンパク質 （ァ ルドラーゼ） を含むものであればよく、 具体的には培養物、 培地 （培養物から菌体を除去 したもの） 、 菌体 （培養菌体、 洗浄菌体のいずれも含む） 、 菌体を破碎あるいは溶菌させ た菌体処理物、前記培地および/または細胞を精製処理することにより得られるアルドラ ーゼ活性を有する組成物 （粗酵素液、 精製酵素） などを含む。 例えば、 アルドラーゼ産生 菌または組み換え D NAによって形質転換された細胞を用いて、置換 a—ケト酸を製造す る場合、 培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、 培養液より分離された 菌体、 洗浄菌体などいずれも使用可能である。 また、 菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体 処理物をそのまま用いてもよいし、 当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液 として使用してもよいし、 さらに、 酵素を精製して用いてもよい。 すなわち、 ァノレドラー ゼ活性を有する画分であれば、どのような形態であっても本発明の置換 α—ケト酸の製造 方法に使用することが可能である。
アルドラーゼまたはアルドラーゼ活性を有する組成物を用いてアルドール反応を進行 させるには、 前記一般式 （1) で表される置換 α—ケト酸、 前記一般式 （2) で表される 置換 α—ケト酸、当該反応を触媒するタンパク質またはアルドラーゼ含有物を含む反応液 を 20〜50°Cの適当な温度に調整し、 pH6〜12に保ちつつ、 30分〜 5日静置、 振 とう、 または攪拌すればよい。
当該反応液に Mg2+、 Mn2+、 N i2+、 C o2+などの 2価のカチオンを添加することによ つて反応速度を向上させることもできる。 コスト等の面から、 好ましくは Mg2+を用いる こと力 sある。
これら 2価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれ の塩を用いてもよいが、好ましくは MgC 12、 Mg S04、 Mn S04等を用いることがあ る。これら 2価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定する ことができる力 0. 01 mM〜 1 OmM、 好ましくは 0. 1 mM〜 5 mM、 さらに好ま しくは 0. 1 mM〜l mMの範囲で添加することができる。
以下、本発明の置換 α—ケト酸の製造方法を実施する際の好ましい反応条件の一例を挙 げれば、 100 mMノくッファー、 50 mMィンドール一 3—ピルビン酸、 250 mM ピ ルビン酸、 lmM MgC l2、 1 % (v/v) トルエンからなる反応液に、 酵素源として アルドラーゼ発現 E. coliの洗浄菌体を 10 % (w/ V )となるように添加し、 33 で 4時間振とう反応させることにより、 4— (インドールー 3—ィルメチル） 一4ーヒドロ キシー 2—ォキソダルタル酸 （IHOG) が得られる。
生成した一般式 （3) の置換 α—ケト酸は、 公知の手法により分離精製することができ る。 例えば、 イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、 これを溶離後晶析 する方法または溶離後、 活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。 本発明の置換ひーケト酸の製造方法を用いることにより、インドールピルビン酸と、ォ キサロ酢酸 （ないしピルビン酸） と力ゝら、 モナティンの前駆体ケト酸 （I HOG) を生成 できる。 IHOGは、 2位をァミノ化することによりモナティンを導出できるため、 モナ ティン合成における中間体として有用である。 実施例
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに 限定されるものではない。 なお、 実施例において、 基質として用いた I HOGおよび PH O Gは、 参考例 1および 2に記載の方法により合成したものである。
実施例 1
〔I〕 P HOGアルドラーゼ活性菌の採取
4一フエニルメチル _4—ヒドロキシ一 2_ォキソダルタル酸（PHOG) を基質とし たアルドラーゼ活性菌株の採取を実施した。
ブイヨン平板培地 （栄研化学） に供試微生物 （細菌'酵母） を接種し、 30°じで24時 間培養した。 これをグリセロール 0. 5 g/d l、 フマル酸 0. 5 g/d l、 酵母エキス 0. 3 g/d l、 ペプトン 0. 2 §/(1 1、 硫安0. 3 g/d K2HP04 0. 3 g/ d 1、 KH2P040. 1 g/d Mg S 04 · 7H20 0. 05 g/d K フタル酸ナト リウム 0. 25 g/d 1、 寒天末 2 g/d 1 (pH6. 5 ) を含むプレートに接種し、 30 °Cで 24時間培養した。 得られた菌体を湿菌体重量で約 1 % (w/v) となるように、 10 OmM Tr i s— HC 1 (p H 8. 0)、 50 mM PHOG, 1 mM M g C 12、 5mM リン酸カリウム溶液 （KP i) 、 1% (v/v) トルエンからなる反応液に接種し、 30°Cで 24時間反応させた。該反応液中の遊離ピルビン酸濃度は lactate dehydrogenae (LDH)を用いた酵素法にて定量した。 100 mM T r i s— HC I (ρΗ8· 0)、 1. 5mM NADH、 5mM MgC l2、 25 U/m 1 LDHからなる反応液 200 / Lにサンプノレ 10 Lを添加し、 30 で 10分間ィンキュペートした。反応後の 340 n mの吸光度を測定し、 N A D Hの減少量からサンプル中のピルビン酸量を定量した。 また生成フエ二ルビルビン酸量はジーエルサイエンス社製 「Inertsil 0DS-2 」 （5/im, 4.6X250mm)を利用した HP LC分析にて定量した。 分析条件は、 以下に示す通 りである。
移動相： 20% (v/v) ァセトニトリル /0.05%(v/v) トリフルォロ酢酸水溶液
流速： 1 ml/min
カラム温度： 40°C
検出： UV 210 nm
本条件により、 P H O Gは約 9. 8分に、 フエニルピルビン酸は約 1 2分の保持時間に 溶出され、 それぞれ分別、 定量できた。
供試菌体添加区において P H O Gより生成したピルビン酸ないしフエニルピルビン酸 量より対照区 （菌体無添カ卩区） の生成量を差し引いた値をアルドラーゼによる生成量とし た。 その結果、表 1に掲げる菌株において PHOGを基質としたアルドラーゼ活性を見出 した。
表 1 P HOGアルドラーゼ活性菌株のスクリーニング結果
ピルビン酸 （mM) フエ二ルビ/レビン酸（mM)
Pseudomonas taetro丄 ens ATCし 4683 34.9 35.0
Pseudomonas coronafaciens AJ2791 33.6 33.9
Pseudomonas desmo丄 ytica AJ1582 1.1 2.9
Erwinia sp. AJ2917 0.8 3.0
Flavobacterium rhenanum CCM298 AJ2468 3.0 6.1
Xanthomonas _citri AJ2797 1.0 3.2
Pseudomonas taetrolens ATCC468 3を選抜し、 フエ二ルビルビン酸とォキサ口 酢酸ないしピルビン酸からの P HOGの合成反応を検討した。 1 0 OmM T r i s -H C 1 (pH8. 0)、 5 OmM フエ二ルビルビン酸、 1 mM Mg C I2、 5 mM KP i、 1 0 OmM ォキサ口酢酸ないしピルビン酸、 1% (w/w) トルエンからなる反応液に、 P. taetrolens ATCC 46 83 (A J 22 1 2 ) 菌体を終濃度で約 1 % ( /v)となるよう に接種し、 30°Cで 1 6時間反応させた。 反応終了後、 生成 PHOG量を HPLCにて定 量した。フェ -ルピノレビン酸とォキザ口酢酸ないしピルビン酸からの P HO Gの生成量を 表 2に示す。 表 2 フエニルピルビン酸とォキサ口酢酸なレ、しピルビン酸からの P H O Gの生成量
ォキサ口酢酸区 ピルビン酸区
菌体添加区 14.3 (mM) 9.3 (mM)
コント p -/レ （Mg添加） 区 8.6 1.7
コント口—/レ (Mg無添加) 区 trace N. D. 表 2より、菌体添カ卩区において P HOGの生成量の増加が認められ、 フエ二ルビルビン 酸 +ォキサ口酢酸おょぴフエニルピルビン酸 +ピルビン酸のいずれの組み合わせにおレヽ 'ても、 該アルドラーゼの作用により PHOGを生成せしめることが明らかとなった。
〔II〕 Pseudomonas taetrolens ATCC 46 8 3株由来 I HOGアルドラーゼの精製 P. taetrolens ATCC 46 8 3株の可溶性画分から I H〇 Gアルドラーゼの精製を 以下の通り行った。 アルドラーゼ活性測定は、 P HOGを基質としたアルドール分解活性 を以下の条件で測定した。
反応条件： 5 OmM T r i s—HC 1 ( p H 8. 0 )、 2 mM P HO G、 0. 2 mM N ADH、 0. 2mMKP i、 1 mM M g C 12、 1 6 U/m 1 lactate dehydrogenase, 3 μ L酵素/ 6 0 0 L反応液、 3 0°C、 340 n mの吸光度を測定
(1) 可溶性画分の調製
ブイョン平板培地で 3 0 °C、 24時間培養した P. taetrolens ATCC 46 8 3菌体 を一白金耳かきとり、 5 Om 1の酵素生産培地 （0. 5 g/d l グリセロール、 0. 5 g/d 1 フマル酸、 0. 5 g/d 1硫酸アンモ-ゥム、 0. 3 gZd l K2HP04 0. 1 g/d 1、 KH2P〇4 0. 0 5 g/d l、 Mg S〇4 ' 7 H20 0. 3 g/d 1 , 酵母ェ キス、 0. 2 g/d l ペプトン、 0. 2 5 g/d 1 フタル酸ナトリウム、 0. 00 5% Antif oam A (Sigma社製）、 H6. 5に KOHで調整） を含む 5 0 0 m 1容フラスコに 接種し、 3 0 で 24時間振とう培養した。 該培養液 0. 5m lを酵素生産培地 5 0m l を含む 50 0m l容フラスコ 40本に接種し、 3 0°Cで 24時間振とう培養した。得られ た培養液から遠心分離により集菌し、バッファー A (2 OmM T r i s—HC l (p H7. 6)) に懸濁して洗浄した後、 再度遠心分離にて集菌した。 得られた洗浄菌体を 2 0 0 m 1のバッファー Aに懸濁し、 4 °Cで 3 0分間超音波破砕した。破碎液を遠心分離（x8000rpm、 10分間 2回） により菌体残渣を除き、 さらに超遠心分離（x50000rpm、 30分間） し、 得られた上清を可溶性画分とした。
(2) 陰ィオン交換ク口マトグラフィー： Q- Sepharose FF
上記の可溶性画分 80 m 1をバッファー Aで平衡化した陰ィオン交換ク口マトグラフ ィーカラム Q-Sepharose FF 26/10 (フアルマシア社製、 CV=20ml) に供して担体に吸着さ せた。 担体に吸着しなかったタンパク質 （非吸着タンパク質） をバッファー Aを用いて洗 い流した後、 KC 1濃度を 0Mから 0. 7Mまで直線的に変化させて （total 140ml) 吸 着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について P HOGアルドラーゼ活性を検出 したところ、 約 0. 5M相当の画分に PHOGアルドラーゼ活性のピークを検出した。 同 様のクロマト操作を 2度繰り返して実施した。
(3) 疎水性クロマトグラフィー ： Phenyl Sepharose HP HR 16/10
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファー B (5 OmM Tr i s— HC l (p H7. 6)、 1M硫酸アンモニゥム、 pH 7. 6) に対して 4°Cでー晚透析し 0. 45 μ mのフィルターで濾過した。得られた濾液を、ノ ッファー Bで平衡化した疎水性クロマト グラフィーカラム Phenyl Sepharose HP HR 16/10 (フアルマシア社製） に供した。 この 操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファー Bを用いて洗い流した後、硫酸ァ ンモユウム濃度を 1 Mから 0 Mまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られ た各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニゥム濃度がおよそ 0. 2 Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
(4) ゲルろ過ク口マトグラフィー： Sephadex 200 HP 16/60
アルドラーゼを含む画分をそれぞれ集めて、 バッファー Aに対して透析し、 0. 45 μ mのフィルターで濾過した。 得られた濾液を、 限外ろ過膜 centripreplOを用いて濃縮し た。 得られた濃縮液を、 バッファー C (2 OmM Tr i s— HC 1 (pH7. 6), 0. 1 M KC 1 )で平衡化されたゲルろ過 Sephadex 200 HP 16/60 (フアルマシア社製） に 供し、 1 m 1 Zm i mの流速で溶出した。 この操作によりアルドラーゼは 66— 71 πα 1 の画分に溶出された。活性のピークの溶出位置より、該アルドラーゼの分子量は約 146 kD aと見積もられた。 0750
35
(5) 陰イオン交換ク口マトグラフィー： Mono Q HR5/5
得られた画分を 0. 45 μπιのフィルターで濾過した。 ここで得られた濾液を、 バッフ ァー Αで平衡ィヒされた陰イオン交換クロマトグラフィーカラム Mono-Q HR 5/5 (フアル マシア社製） に供した。 この操作により、 アルドラーゼは担体に吸着した。 バッファー A により非吸着タンパク質を洗い流した後、 KC 1濃度を直線的に OmMから 700 mMへ 変化させてタンパク質の溶出をおこなった （Total 24ml) 。 各溶出画分についてアルドラ ーゼ活性を測定し、 K C 1濃度が約ο · 0. 4 Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められ た。
(6) ハイドロキシァパタイトクロマトグラフィー： CHT— II
得られた画分をバッファー D (1 OmM リン酸カリゥムバッファー （pH7. 0)) に 4°Cでー晚透析し、 0. 45 μηιのフィルターで濾過した。 ここで得られた濾液を、 ノ ッ ファー Dで平衡化されたハイドロキシァパタイトクロマトグラフィーカラム CHT - II 5 ml (BioRad社製） に供した。 この操作により、 アルドラーゼは担体に吸着せず、 吸着タ ンパクと分離することができた。
以上の力ラムクロマト操作により精製した画分を S D S— P AG Eに供したところ、約 25 kD aに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。ゲルろ過クロマトグラ フィ一での推定分子量が約 146 kD aであることから、該アルドラーゼは 6量体を形成 していると推定された。 精製表を表 3に示す。
表 3 Pseudomonas taetrolens ATCC4683株由来 IH0Gアルドラーゼの精製表
protein specific activity •purification fold total activity ！ yield ！
(mg) ; (U/ms) ' (U) ' (%) ：
！ soluble fraction 3750 0.014 1 51 100 I i Q-sepharose HP 26/10 ； 510 4.4 30.5 59.8 ：
： Phenyl sepharose HP 16/10 I 21.2 I 0.893 66 19.0 37.2 I
Sephadex200 HP 16/60 1.9 — 4.643 341 8.65 1 17.0 ：
： monoO HR5/5 0.49 ' 800 " 5.33 10.4 i
' Hvdroxvapatite CHT-I 1 0.025 28.70 2110 0.71 ■ 1.4
〔III〕 I HOG aldolaseの内部アミノ酸配列の決定
精製したアルドラーゼ約 2 ^ g分を SDS— PAGEに供した後、 SDS— PAGEゲ ル中の試料をトリプシン処理し （pH8. 5、 35°C、 20時間） 、 逆相 H PLCに供し て断片ペプチドを分離した。 分取したフラクションのうち、 2つのフラクションについて それぞれ 20残基、 12残基分のァミノ酸配列（配列番号 4、 5 )を下記の通り決定した。 表 4 決定した内部アミノ酸配列
配列番号 4 SLLDA FQNVV TPHIS DNLGR
配列番号 5 AEIAT GALDQ SW
〔IV〕 P. taetrolens A T C C 4683株由来 I HO G aldolase遺伝子のクローニン グ
(1) 染色体 DN Aの調製
P. taetrolens AT C C 4683株を 50 m 1のプイヨン培地を用いて 30 °Cでー晚 培養した （前培養）。 この培養液 5 m 1を種菌として、 50m lのブイョン培地を用いて 本培養を行った。 対数増殖後期まで培養した後、 培養液 50m lを遠心分離操作 （12000X g、 4°C、 15分間） に供し、 集菌した。 この菌体を用いて定法に従って染色体 DNAを 調製した。
(2) PCRによる内部配列の取得
決定した I HOGアルドラーゼの内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマ 一 （配列番号 6、 7) を合成した。
表 5 内部ァミノ酸配列より設計 '合成したミックスプライマー
配列番号 6 TTY CAR AAY GTS GTS ACS CCS C
配列番号 7 TGR TCR ATN GCN CCS GTN GCR ATY TCN GC
作製したミックスプライマーを用いて、 P. taetrolens ATCC4683の染色体 DN Aを铸型として P C Rによる増幅を行った。 P C R反応は、 PCR Thermal PERS0NEL (TaKaRa 社製） を用いて行い、 以下の条件で 30サイクル行った。
94°C 30秒
55°C 30秒
72°C 1分
PCR産物をァガロースゲル電気泳動に供したところ、約 500 b pの断片の増幅が認 められた。 該 DNA断片を pUC l 8にクローニングし、 塩基配列を決定したところ、 取 得した D NA断片から推定されるアミノ酸配列が、 I H O Gアルドラーゼの内部アミノ酸 配列と一致しており、 目的のアルドラーゼ遺伝子が取得されたことが確認された。
(3) コロニーハイブリダィゼーションによる全長遺伝子の取得
P C Rで増幅した D N A断片を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーシ ヨンによって全長遺伝子の取得を行った。 D N Aプローブの作製は DIGHigh Prime (ロシ ュダイァグノスティック社製） を使用して、説明書通りに 3 7 °Cで 0/Nインキュベートし てプローブの標識を行った。サザン解析は染色体 D NA 1 μ gを各種制限酵素で完全に消 化し、 0 . 8 %ァガロースゲルで電気泳動したのちに、 ナイロンメンブレンにプロッティ ングし、 以下マニュアルに従って行った。 ハイプリダイゼーシヨンは DIG Easy Hyb (口 シュダイァグノスティック社製） を用いて行い、 5 0 °C で 1時間プレハイプリダイゼー シヨンを行った後にプローブを添加して、 0/Nでハイブリダィゼーシヨンさせた。 バンド の検出は DIG Nucleotide Detection Mtを用いて行った。 その結果、 該 P C R断片をプ ローブとして強くハイブリダィゼーシヨンする約 4 k b pの Pstl断片を検出した。次に、 この Pstl断片をコロニーハイブリダィゼーションにて取得した。染色体 D N A 2 0 g を Pstlで処理後ァガロースゲル電気泳動に供し約 4 k b p大きさの断片を回収した。 こ れを PUC118に連結し、 E. coli JM109にてライブラリーを作製した。 コロニーをナイ口 ンメンブレンフィルター (Hybond-N、 アマシャム社製) にうつし、 アルカリ変性、 中和、 固定化の処理を行った。 ハイブリダィゼーションは DIG Easy Hybを用いて行った。 フィ ルターをバッファ一中に浸し、 4 2 °Cで 1時間プレハイプリダイゼーシヨンを行った。 そ の後、作成した標識プローブを添加し、 4 2 °Cで 1 6時間ハイプリダイゼーションを行つ た。 SSCでの洗浄後、 プローブとハイプリダイズするコロニーの検出を DIG Nucleotide Detection Kit (ロシュダイァグノスティック社製） を用いて行った。 その結果、 プロ一 ブと強くハイブリダィゼーションするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミ ド D N Aの塩基配列を決定したところ、配列番 号 1に記載の塩基配列を有することが明らかになった。決定した内部アミノ酸配列に対応 する塩基配列 （配列番号 1にて 5 0 7〜5 6 6番目、 および、 1 0 4 6〜1 0 8 2番目） を含む 6 7 8 b pの o r f を見出し、 目的とするアルドラーゼの全長を取得した。
(4) E. coliでの I HO Gアルドラーゼの発現 （その 1 ) 表 6に示すプライマー （配列番号 8および 9) を用いて P. taetrolens ATCC46
83染色体 DNAより増幅した断片を BaraHI/Hindlll消化し、 pUC18の BamHI/Hindlllサ ィトに揷入したプラスミ ド pUCALDを構築した。 構築した発現プラスミ ドを E. coli JM109 に導入し、 形質転換体を 50 μ g/m 1 アンピシリンを含む L B培地で一昼夜 37 °Cで振 盪させた （前培養） 。 前培養液を 50 mlの LB培地に 1%シードし、 37 °Cにて本培 養を行つた。培養開始約 2時間後に終濃度 1 mMとなるように I P T Gを添カ卩し、 さらに
3時間培養を行った。 培養終了後、 集菌、 洗浄を行い、 1 mlの 20mM T r i s— H
C 1 (pH7. 6)に懸濁し、 マルチビーズショッカー （安井器械社製） を用いて菌体を 破枠した。 破碎液を 15000 rpmで 10分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
表 6 プライマー
配列番号 8 ALD-5' Bam (5' - GCC GGA TCC ACA AGG GTT CAG TCA TTC ATG G-3' ) 配列番号 9 _ ALD-3' Hind (5' - CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C_3， )
該粗酵素液を用いて P HOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、 pUC18 を導入した E. coli (コントロール） においては PH〇Gアルドラーゼ活性は検出されな かったのに対して、 pUCADL導入株においては 0. 81 U/m g proteinの P HO Gアル ドラーゼ活性が検出された。 このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコード していることが示された。
〔V〕 アルドラーゼ発現株を用いたィンドール一 3—ピノレビン酸とピルビン酸からの 4 - (インドール一 3—ィルメチル） _4ーヒ ドロキシ一 2—ォキソダルタル酸（IHOG) の合成
〔IV〕 にて作製したアルドラーゼ発現 E. coliの洗浄菌体を酵素源として用いて、 イン ド一ルー 3—ピルビン酸とピルビン酸からの 4— (インドール一 3—ィルメチル） 一 4一 ヒドロキシー 2—ォキソグルタル酸 （I HOG) の合成を実施した。 I HOGの定量はジ 一エルサイエンス社製 rinertsil 0DS-2 」 （5μιη, 4.6X250mm)を利用した H P L C分析 にて定量した。 分析条件は、 以下に示す通りである。
移動相： 40% (v/v) ァセトニトリル /5 mM リン酸ニ水素テトラブチルァンモニゥム溶液 流速： 1 ml/min
カラム温度： 40°C 検出： UV210nm
100 mMノ ッファー （T r i s— HC 1 8. 0, 9. 0ないし Glycine - N a〇H 10. 0 )、 50 mMィンドール一 3—ピルビン酸、 250 mM ピノレビン酸、 1 mM M gC l2、 1% (v/v) トルエンからなる反応液にアルドラーゼ発現 E. coliの洗浄菌体を 10 % (w/v)となるように添加し、 33でで 4時間振とう反応させた。 酵素反応液を適宜 希釈し、 生成した I HOGを定量した。
表 7 アルドラーゼによる IH0Gの生成量
pH aldolase IHOG (mM)
8 9.2
8 0.42
9 12.1
9 1.6
10 10.7
10 5.4
その結果、アルドラーゼ発現 E. coli添加区において、 I HOG生成量が増加しており、 該アルドラーゼにより I HOGを生成せしめることができた。
実施例 2 E. coliでの I HOGアルドラーゼの大量発現 （その 2)
(1) trpプロモーター及び rrnBターミネータ一搭載プラスミ ド pTrp4の構築
E. coli W3110染色体 DNA上の rpオペロンのプロモーター領域を表 8に示すオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして PCR (配列番号 10および 11の組み合わせ） により 目的遺伝子領域を増幅し、 得られた DNA断片を pGEM— Teasyベクター （プロメガ製） に ライゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. coli JM109を形質転換し、 アンピシ リン耐性株の中から trpプロモーターの方向が lacプロモータ一と反対向きに挿入された 目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミ ドを Eco0109I/EcoRIにて処 理して得られる trpプロモーターを含む DNA断片と、 pUC19 (Takara製） の EcoOlOW /EcoRI処理物とライゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. coli JM109を形質 転換し、 アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、 プラスミド を pTrplと命名した。 次に pKK223— 3 (Amersham Pharmacia製） を HindlllZHincIIに て処理し、得られた rrnBターミネータ一を含む D N A断片と pTrplの Hindlll/PvuII処 理物とライゲーシヨンした。 このライゲーション溶液で E. coli JM109を形質転換し、 ァ ンピシリン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、プラスミ ドを PTrp2と 命名した。次に PTrp2を铸型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして P C R (配列番号 1 0および 1 2の組み合わせ） により trpプロモーター領域を増幅した。 こ の D N A断片を Eco0109I/NdeIにより処理し、 pTrp2の Eco0109l/Ndel処理物とライゲ ーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. coli JM109を形質転換し、 アンピシリン耐 性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミ ドを pTrp4と命名した。 表 8 プライマー
配列番号 1 0 5' 側 GTATCACGAGGCCCTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATC
Eco0109I
配列番号 1 1 3' 側 TTCGGGGATTCCATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGC
Ndel
配列番号 1 2 3' 側 GGGGGGGGCATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTG
Ndel _
( 2 ) アルドラーゼ遺伝子発現プラスミ ド ptrpALDl、 ptrpALD2の構築と E. coliでの発現 表 9に示すプライマー （配列番号 9および 1 3 ) を用いて P. taetrolens AT C C 4
6 8 3染色体 D NAより増幅した断片を Ndel/Hindlll消化し、 pTrp4の Ndel /Hindi II サイトに挿入したプラスミド ptrpALDlを構築した。 このプラスミドは配列番号 1に記載 の塩基配列のうち 4 4 4番目の ATGを翻訳開始コドンとして配列番号 3記載のァミノ酸 配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。また、プライマー（配列番号 9および 1 4 ) を用いて P. taetrolens AT C C 4 6 8 3染色体 D N Aより増幅した断片を
Ndel/Hindlll消化し、 pTrp4の Ndel /Hindlllサイトに挿入したプラスミ ド ptrpALD2を 構築した。このプラスミドは配列番号 1に記載の塩基配列のうち 4 5 6番目の ATGを翻訳 開始コドンとして配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現す る。 それぞれ構築した発現プラスミ ドを E. coli JM109に導入し、 形質転換体を 5 0 μ g/ m l アンピシリンを含む L B培地で一昼夜 3 7 °Cで振盪させた （前培養） 。 前培養液を 5 0 m 1の L B培地に 1 %シードし、 3 7 °Cにて本培養を行つた。 培養開始約 2時間後 に終濃度 1 mMとなるよに I P T Gを添加し、 さらに 3時間培養を行った。 培養終了後、 集菌、 洗浄を行い、 l m 1の 2 O mM T r i s— H C 1 ( p H 7 . 6 )に懸濁し、 マルチ ビーズショッカー （安井器械社製） を用いて菌体を破砕した。 破碎液を 15000 rpmで 10 分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
表 9 プライマー
配列番号 9 ALD-3' Hind (5' - CCG AAG CTT TCA GTT CGC CAG GCC AGC C- 3' ) 配列番号 13 ALD-5' Nde- 1(5' - GGT TCA GTC ACA TAT GGA GGT CGC TAT GTC-3' ) 配列番号 14 ALD-5' Nde-2 (5' - ATG GAG GTC CAT TAG TCA TTG CCC GGT TCA CGC -3' ) 該粗酵素液を用いて PHOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、 pTrp4 を導入した E. coli (コントロール） においては P HOGアルドラーゼ活性は検出されな かったのに対して、 ptrpADLl導入株においては 16. 1 U/m g proteinの P H〇 Gァ ノレドラーゼ活性が、 ptrpADL2導入株においては 36. 0 U/m g proteinの P HO Gァ ルドラーゼ活性が検出された。 このことより、配列番号 2ないし 3記載のアミノ酸配列か らなるァノレドラーゼのいずれを用いても、アルドラーゼ活性を有していることが明らかと なった。
実施例 3 Pseudomonas coronafaciens A J 2791株由来 I HOGァノレドラーゼのク ローニング
(1) 染色体 DN Aの調製
P. coronafaciens A J 2791株を 50mlのブイョン培地を用いて 30°Cで一晚培 養した （前培養） 。 この培養液 5m 1を種菌として、 50mlのブイョン培地を用いて本 培養を行った。 対数増殖後期まで培養した後、 培養液 5 Omlを遠心分離操作 （1200 O x g、 4°C、 15分間） に供し、 集菌した。 この菌体を用いて定法に従って染色体 DN Aを調製した。
(2) サザン解析およびコロニーハイブリダィゼーションによる全長遺伝子の取得
P. coronafaciens A J 2791株由来 I HOGのアルドラーゼ （以下、 P cALD) 遺伝子のクローニングは、 P. taetrolens AT C C 4683株由来 I HO Gアルドラーゼ 遺伝子をプローブとしたサザン角军析およびコロニーハイブリダィゼーションにより実施 した。表 9に示すプライマー ALD-5' Nde-1 (配列番号 13 )および ALD-3' Hind (配列番号 9 ) を用いて、 P.taetrolens AT C C 4683染色体 D N Aより I HOGアルドラーゼ遺伝 子全長を PCRで増幅した。増幅した DNA断片をプローブとして用いて、 サザン解析お よびコロニーハイブリダィゼーシヨンによって全長遺伝子の取得を行った。 DNAプロ一 ブの作製は DIGHigh Prime (ロシュダイァグノスティック社製） を使用して、 説明書通り に 37°Cで O/Nインキュベートしてプローブの標識を行った。 サザン解析は P.
coronafaciens A J 2791株染色体 DNA1 μ gを各種制限酵素で完全に消化し、 0. 8%ァガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンプレンにプロッティングし、以 下マニュアルに従って行った。 ハイブリは DIG Easy Hyb (ロシュダイァグノスティック 社製） を用いて行い、 37°Cで 1時間プレハイプリを行った後にプローブを添加して、 3 7°Cで〇ZN、 ハイプリさせた。 メンブレンの洗浄は、 2 X S S Cを用いて室温で 5分間 の洗浄を 2回行ったのち、 0. 1 XS SCを用いて 37°Cで 15分間の洗浄を 2回行った。 バンドの検出は DIG Nucleotide Detection Kitを用いて行った。 その結果、 プローブと ハイブリする約 2. 2 k b pの Pstl/Hindlll断片を検出した。 次に、 この Pstl/Hindlll 断片をコロニーハイブリダィゼーシヨンにて取得した。 染色体 DNA 20 /i gを Pstl/Hindlllで処理後ァガロースゲル電気泳動に供し約 2. 2kb p大きさの断片を回 収した。 これを Pstl/Hindlllで処理した pUC18に連結し、 E. coli JM109にてライブラ リーを作製した。 コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Hybond - N、アマシャム社製） にうつし、 アルカリ変性、 中和、 固定化の処理を行った。 ハイブリダィゼーシヨンは DIG Easy Hybを用いて行った。 ナイロンメンブレンフィルターをバッファ一中に浸し、 37°C で 1時間プレハイブリダイゼーシヨンを行った。その後、作成した標識プローブを添加し、 37 °ce 16時間ハイブリダイゼーションを行つた。ナイロンメンブレンフィルターの洗 浄は、 2 X S S Cを用いて室温で 5分間の洗浄を 2回行ったのち、 0. 1 XS SCを用い て 37°Cで 15分間の洗浄を 2回行った。プローブとハイプリダイズするコロニーの検出 を DIG Nucleotide Detection Kit (ロシュダイァグノスティック社製） を用いて行った。 その結果、 プローブとハイブリするクローンを取得した。
取得したクローンより回収したプラスミ ド DN Aの塩基配列を決定したところ 744 b pの o r f を見出し、 目的とするアルドラーゼの全長を取得した。構築した P cALD 遺伝子揷入プラスミドを pUCPcALDと命名した。
pUCPcALD を E. coli JM109に導入し、 形質転換体を 50 μ g/m 1アンピシリンを含む LB培地 （LB— amp培地） で一昼夜 37 °Cで振盪させた （前培養） 。 前培養液を 50 m 1の L B培地に 1 %シ一ドし、 37 °Cにて本培養を行った。培養開始約 2時間後に終濃 度 ImMとなるよに I PTGを添加し、 さらに 3時間培養を行った。 培養終了後、 集菌、 洗浄を行い、 lm 1の 2 OmM T r i s— HC 1 (pH7. 6) に懸濁し、 マルチビー ズショッカー （安井器械社製） を用いて菌体を破枠した。 破碎液を 15000 r pmで 1 0分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
該粗酵素液を用いて P HOGを基質としたアルドラーゼ活性を測定したところ、 pUC18 を導入した E. coli (コントロール） においては PHOGアルドラーゼ活性は検出されな かったのに対して、 pUCADL導入株においては 39.3 U/mg proteinの PHOG アルドラー ゼ活性が検出された。 このことより、該遺伝子が目的とするアルドラーゼをコードしてい ることが示された。
実施例 4 Pseudomonas taetrolens ATCC 4683株由来アルドラーゼの組み換え酵 素の精製
P. taetrolens AT C C 4683由来アルドラーゼ （以下、 P tALD) を高発現させ た E. coliの可溶性画分から組み換え P t ALDの精製を以下の通り行った。 アルドラー ゼ活性測定は、 P H O Gを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。 反応条件： 5 OmM Tr i s— HC 1 (pH8. 0)、 2 mM PHOG, 0. 2 mM N AD、 0. 2mM Kp i、 1 mM M g C 12、 16 U/m 1 lactate dehydrogenase, 3 μ 1酵素/ 600 μΐ反応液、 30 °C、 340 n mの吸光度を測定
(1) 可溶性画分の調製：
LB- amp平板培地で 37 °C、 16時間培養した E. coli JM109 / ptrpALD2菌体を 一白金耳かきとり、 3m 1の LB— amp培地を含む試験管に接種し、 37 °Cで 16時間 振とう培養した。該培養液 0. 5mlを LB— amp培地 50mlを含む 500 m 1容フ ラスコ 10本に接種し、 37°Cで 16時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離 により集菌し、 バッファー A (2 OmM Hepes-KOH (pH7. 6) ) に懸濁して洗浄 した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を 25mlのバッファー Aに懸濁 し、 4 °Cで 30分間超音波破枠した。 破砕液を遠心分離 （X 8000 r pm、 10分間 X 2回） により菌体残渣を除き、 得られた上清を粗抽出画分とした。
(2) 陰ィオン交換ク口マトグラフィー： Q- Sepharose FF 上記の粗抽出画分 23m lをバッファー Aで平衡ィ匕した陰イオン交換クロマトグラフ ィーカラム Q-Sepharose FF 26/10 (フアルマシア社製、
Figure imgf000045_0001
に供して担体に吸着さ せた。 担体に吸着しなかったタンパク質 （非吸着タンパク質） をバッファー Aを用いて洗 い流した後、 KC 1濃度を 0Mから 0. 7 Mまで直線的に変化させて（total 140ml) 吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分について P HOGアルドラーゼ活性を検 出したところ約 0. 5 M相当の画分に P HO Gアルドラーゼ活性のピークを検出した。 (3) 疎水性クロマトグラフィー ： Phenyl Sepharose HP HR 16/10
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファー B (2 OmM Hepes- KOH(pH7. 6) 、 1M硫酸アンモニゥム、 pH7. 6) に対して 4 °Cでー晚透析し、 l O O O O r p mで 10分間遠心分離した上清を 0.45 μπιのフィルターで濾過した。得られた濾液を、 バッファー Bで平衡ィヒした疎水性ク口マトグラフィーカラム Phenyl Sepharose HP HR 16/10 (フアルマシア社製） に供した。 この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。 担体に吸着しなかつた非吸着タンパク質をバッファー Bを用いて洗い流した後、硫酸ァ ンモニゥム濃度を 1 Mから 0 Mまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られ た各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモ-ゥム濃度がおよそ 0. 2 Mの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
以上の力ラムクロマト操作により精製した画分を S D S— P A G Eに供したところ、約 25 kD aに相当する位置に CBB染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み 換え P t ALD溶液はバッファー Aに対して 4°Cでー晚透析した。上記の操作により、 3 50U/m 1の P t ALD溶液を 17ml取得した。
実施例 5 Pseudomonas coronafaciens A J 2791株由来アルドラーゼの組み換え酵
Pseudomonas coronafaciens A J 2791由来アルドラーゼ （P c ALD) を高発現さ せた E. coliの可溶性画分から組み換え P c ALDの精製を行った。
LB- amp平板培地で 37 °C、 16時間培養した E. coli JM109 I pUCPcALD菌体を 一白金耳かきとり、 3m lの LB— amp培地を含む試験管に接種し、 37 °Cで 16時間 振とう培養した。 該培養液 0. 5m 1を LB— amp培地 （+0. 1 mM I PTG) 5 0 m 1を含む 500m 1容フラスコ 7本に接種し、 37 °Cで 16時間振とう培養した。 得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファー A (2 OmM Hepes-KOH (p H7. 6) ) に懸濁して洗浄した後、 再度遠心分離にて集菌した。 得られた洗浄菌体を 3 0 mlのバッファ一 Aに懸濁し、 4 で 30分間超音波破砕した。 破砕液を遠心分離 + (x 8 000 r pm、 10分間 X 2回） により菌体残渣を除き、 得られた上清を粗抽出画分とし た。
得られた粗抽出画分を、実施例 4記載の組み換え P t A LDの精製と同様の方法にて力 ラムクロマト精製を行つた。 Q-Sepharose、 Phenyl Superoseの 2段階の力ラムクロマト 操作により精製した画分を SDS— PAGEに供したところ、約 25 kD aに相当する位 置に CBB染色で単一なバンドとして検出された。取得した組み換え P c ALD溶液はバ ッファー Aに対して 4 °Cでー晚透析した。上記の操作により、 108U/mlの P cAL D溶液を 10ml取得した。
実施例 6 P tALD, P c ALDを用いたインドールー 3—ピルビン酸とピルビン酸 からの 4一（インドール一 3—ィルメチル） _ 4ーヒドロキシ _ 2—ォキソダルタル酸 ( I HOG) の合成
実施例 4および 5にて作製した P t ALD、 P c ALDを酵素源として用いて、インド 一ルー 3—ピルビン酸とピルビン酸からの 4— (インドール一 3 _ィルメチル） 一 4—ヒ ドロキシ _2—ォキソダルタル酸 （I HOG) の合成を実施した。 I HOGの定量はジー エルサイエンス社製 「Inertsil 0DS- 2 」 （ 5 μ m， 4. 6 X 250 mm)を利用した H P LC分析にて定量した。 分析条件は、 以下に示す通りである。
移動相： 40% (v/v) ァセトニトリルダ5 mM リン酸ニ水素テトラプチルァンモニゥム溶液 流速： 1 ml/mm
カラム温度： 40°C
検出： UV210nm
10 OmM Hepes-KOH (pH8. 5)、 5◦ mMインドールー 3—ピルビン酸、 2 50mM ピルビン酸、 1 mMないし 5 mM M g C 12からなる反応液に P t A L D、 P cALDを 1. 8UZm l、 0. 8 U/m 1となるように添加し、 33°Cで 4時間反応さ せた。 酵素反応液を適宜希釈し、 生成した I H〇Gを定量した。 その結果、 該アルドラー ゼにより I HOGを生成せしめることができた。 表 10
MgCl2 (mM) IHOG (mM)
1 4.9
PcALD
5 5.4
1 11.4
PtALD
5 10.5
実施例 7 P t ALDを用いた種々の置換 (¾ーケト酸の生成
実施例 4にて調製した P t ALDを用いて、表 1 1に掲げた種々の基質に対するピルビ ン酸のアルドール縮合活性を測定した。 10 OmM Glycine- N a OH (pH9) 、 50 mM基質、 25 OmM ピルビン酸ナトリウム、 lmM MgC l2、 0. 1 mg/m 1 P t ALDからなる反応液を調製し、 33°Cで 2時間インキュベートした。 得られた 反応液を分画分子量 10◦ 00の限外ろ過膜 Microcon 10 (アミコン社製） を用いて限外 ろ過した。 ろ液 2 ^1を 200/ 1の 50 %ァセトニトリル / 0. 1 %アンモニア水溶液 に希釈し、 E S I—MS分析を実施した。
結果、 表 12に示した基質に対して、 相当する mZz値のピークを検出し、 目的とする ピルビン酸のアルドール縮合物が生成していることが示された。
表 1 1 P t A L Dを用いた種々の基質に対するピルビン酸のアルドール縮合
Exact MS [M-H]- アルドール縮合物
(計算値） （測定値） indo丄ー 3 β -hya
2 - keto
3 - me
but
-ke
pyr
D-
L
Figure imgf000048_0001
表 12 P t ALDを用いた種々の基質に対するピルビン酸のアルドール縮合（表 1 1の 続き）
Exact MS
[M-HJ- アルドール縮合物 （計算
(測定値） 値）
L-riDose
N-acetyl-L-mannosamin
Figure imgf000049_0001
実施例 8 P t ALDの酵素学的諸性質
実施例 4で調製した P t ALDを用いて、 以下に掲げる項目について検討した。
基本測定条件： 5 OmM Hepes-KOH (pH8. 0)、 2 mM PHOG、 5 mM Mg C 12、 3mM KPB (p H 8) 、 16 U/m 1 Lactate dehydrogenase, 30°〇にて34 0 nmの吸光度の減少を測定。
(1) P HOGを基質とした速度論定数
図 2〜 4示す結果から、 Vm a X (for PH0G) = 91. 7 μ mol/min/mg, Km (for PH0G) =0. 10mM、 Km (for MgCl2) =0. 019 mM, K a (for Kpi) = 0. 95mMと それぞれ決定した。また、 ImMの MgC 12添カ卩により無添加区と比較して 2. 7倍に、 5 mM KPB添加により無添加区の 2倍にそれぞれ活性が上昇した。
(2) pH安定性
p H 3〜 1 1の範囲における p H安定性を測定した。測定に用いた緩衝液は以下の通り c 酢酸ナトリウムバッファー（pH3、 4、 5、 6)、 リン酸カリウムバッファー （pH6、 6. 5、 7、 7. 5) 、 Tr i s— HC 1バッファー （pH7、 7. 5、 8、 8. 5) 、 Glycine - N a O Hバッファー（pH9、 9. 5、 10)、 CAPS—Na〇 Hバッファー（ ρ H10、 10. 5、 11) 。 P t ALDを 10 OmMのそれぞれの緩衝溶液中で 37°Cで 30分間ィンキュベートした残存活性を基本測定条件にて測定した。 結果を図 5に示す。 (3) 温度安定性
25°C〜70°Cにて 10 OmM リン酸カリウムバッファー （ρΗ7. 0) および 10 OmM Glycine- N a ΟΗバッファー （pH9. 0) 中で P t A L Dを 30分間インキュ ペートした後、 残存活性を基本測定条件にて測定した。 結果を図 6に示す。
実施例 9 P t ALDを用いた置換 a—ケト酸の生成
実施例 4にて調製した P t ALDを用いて、 ァセトアルデヒドと α— ketobutyrateと のアルドール縮合活性を測定した。 100 mM Glycine - N a〇H (pH9)、 50 mM ァ セトアルデヒ ド、 25 OmM α-ketobutyrate, 1 mM Mg C 12 0. 1 m g /m 1 P t ALDからなる反応液を調製し、 33°Cで 16時間インキュベートした。 得られた反応 液を分画分子量 10000の限外ろ過膜 Microcon 10 (アミコン社製） を用いて限外ろ過 した。 ろ液 Ι Ο μΙを 200 μ 1の 50 %ァセトニトリル / 0. 1 %アンモニア水溶液に 希釈し、 E S I一 MS分析を実施した。
結果、 予想される生成物の Exact mass (計算値） が 146.06であるのに対して、 〔M+H〕 に相当する m/z値のピーク （m/z=+146.8) を検出し、 下記の反応により目的とするアルド 一ル縮合物が生成していることが確認された。
Figure imgf000050_0001
acetoalaehyde a- eto utyrate 参考例 1 4—ヒドロキシー 4一 （ 3—インドリルメチル） 一 2—ケトダルタル酸 （ I H OG) の合成
水酸ィ匕カリウム 18. 9 lg (286. 5mmo 1、 含量 85重量。 /。） を溶解した水 6 4. 45 m 1に、 インドール一 3 -ピルビン酸 7. 50 g (35. 8 mm o 1、 含量 9 7. 0重量％) とォキサ口酸 14. 18 g (107. 4mmo 1 ) を加えて溶解させた。 この混合溶液を 35 °Cにて 24時間攪拌した。 更に、 3N—塩酸 40. Om 1を加えて中和 （p H= 7. 0) し、 153. 5 gの反応 中和液を得た。 この反応中和液には、 4—ヒ ドロキシ一 4一 （3—インドリルメチル） 一 2—ケトグルタル酸が 5. 55 g含まれており、 収率 53. 3% (対ィンドールピルビン 酸） であった。
この反応中和液に水を加え、 168m 1とし、 合成吸着剤 （三菱化学製 D I A I ON 一 SP 207) 84 Om 1にて充填された樹脂塔 （直径 4. 8 cm) に通液した。 更に、 流速 23. 5m 1毎分にて純水を通液し、 1. 73〜2. 55 (1 / しー1 を収集する ことにより、 高純度の 4—ヒ ドロキシ一 4一 （3—インドリルメチル） 一 2—ケトグルタ ル酸を 3. 04 g含む水溶液を、 収率 54. 7% (樹脂への投入量に対して） にて得た。
(NMR測定）
¾-N R (400MHz, D20)： 3.03 (d， 1H, J = 14.6 Hz) , 3.11 (d, 1H, J = 14.6 Hz)， 3.21(d, 1H, J= 18.1 Hz), 3.40 (d， 1H, J = 18.1 Hz)， 7.06-7.15 (m, 3H) , 7.39 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.66 (d, 1H， J = 7.8 Hz).
13C- MR(100MHz, D20)： 35.43, 47.91, 77.28, 109.49, 112.05, 119.44, 119.67, 121.91, 125.42, 128.41, 136.21， 169.78, 181.43, 203.58
参考例 2 4一フエニルメチル— 4—ヒ ドロキシー 2—ケトグルタル酸 (PHOG) の合 成
水酸化力リウム （純度 85%) 13. 8 gを溶解した水 25mlに対し、 フエニルピル ビン酸 5. 0 g (30. 5 mm o 1 ) 、 ォキサル酢酸 12. 1 g (91. 4 mm o 1 ) を 加えて室温にて 72時間反応させた。 濃塩酸を用いて反応液の pH値を 2. 2に調節し、 酢酸ェチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行 つた後に、 濃縮して残渣を得た。 残渣を酢酸ェチルとトルエンから再結晶を行い、 4ーフ ェニルメチルー 4—ヒ ドロキシー 2—ケトグルタル酸 2. 8 g (1 1. 3 mm o 1 ) を結 晶として得た。 .
(NMR測定）
¾ NMR (D20) δ ： 2.48 (d, ]=Π.4 Hz, 0.18H) , 2.60 (d， J= 14.4 Hz, 0.18H) ， 2.85 一 3.30 (m, 3.64H) , 7.17 — 7.36 (m, 5H)
(分子量測定） ESI- MS 計算値 C12H1206 - 252. 23， 分析値 251. 22 (腿_) 産業上の利用可能性
本発明のアルドラーゼは、 ィンドールピルビン酸とピルビン酸 （ないしォキサ口酢酸） とのアルドール縮合反応を触媒する新規アルドラーゼであり、モナティン合成における中 間体として有用な 4一 （インドールー 3 _ィルメチル） 一4ーヒドロキシー 2—ォキソグ ルタル酸 （4- (Indol-3- ylmethyl) - 4- hydroxy- 2- oxoglutarate； I H O G) の合成に好適 に利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記 （a) または （b) の DNA。
( a )配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 444〜 1 1 18若しく は塩基番号 456〜1 118の塩基配列からなる DN A
(b)配列表の配列番号 1記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 444〜 1 118若しく は塩基番号 456〜11 1 8の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリン ジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコー ドする DNA
2. 下記 （c) または （d) の DNA。
( c )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
( d )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
3. 下記 （e) または （f ) の DNA。
( e )配列表の配列番号 15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 398〜 1141の塩 基配列からなる DN A
( f )配列表の配列番号 15記載の塩基配列又は同配列中塩基番号 398〜 1 141の塩 基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA
4. 下記 （g) または （h) の DNA。
(g)配列表の配列番号 16記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする DNA
( h )配列表の配列番号 16記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質をコードする DNA
5. 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか一項に記載の D N Aとベクター D N Aとを接 続して得られることを特徴とする組換え DNA。
6. 請求の範囲第 5項記載の組換え DNAによって形質転換された細胞。
7. 請求の範囲第 6項記載の細胞を培地中で培養し、培地おょひブまたは細胞中にアル ドラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とするアルドラーゼ活性を有 するタンパク質の製造方法。
8. 下記 （i ) または.（j ) のタンパク質。
( i )配列表の配列番号 2記载のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 225のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
9. 下記 （k) または （1 ) のタンパク質。
( k ) 配列表の配列番号 1 6記载のァミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
1 0. (A) インドール一 3—ピノレビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて 4一 (ィンドール一 3—ィルメチル)一 4ーヒドロキシー 2—ォキソグルタル酸を生成する反 応を触媒する活性、および/または、 フエ二ルビルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮 合させて 4一フエニルメチル一 4ーヒドロキシ一 2—ォキソグルタル酸を生成する反応 を触媒する活性を有し、
(B) (A) 記載の活性の至適 pHが 3 3 °Cにおいて約 9であり、 かつ、
(C) ゲルろ過法により測定した分子量が約 146 kD aであり、 SDS— PAGE法に より測定したサブュニットあたりの分子量が約 25 k D aである
ことを特徴とするタンパク質。
1 1. (A) アルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
(B) シユードモナス （Pseudomonas) 属に由来し、
(C) pH6以上で pH安定性を有し、
(D) 70°C以下で温度安定性を有し、 かつ、
(E) ゲルろ過法により測定した分子量が約 146 kD aであり、 SDS— PAGE法に より測定したサブュニットあたりの分子量が約 2 5 k D aである
ことを特徴とするタンパク質。
1 2 . 酵素反応系に無機リン酸を含有させることによって、前記アルドラーゼ活性が向 上することを特徴とする請求の範囲第 1 1項記載のタンパク質。
1 3 . シユードモナス （Pseudomonas) 属細菌を培地中で培養し、 培地および Zまたは 細胞中に下記 （i ) 〜 （1 ) のうちいずれかのタンパク質を蓄積させ、 前記培地および Z または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物。
( i )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
( k ) 配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記载のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有するタンパク質
1 4 . 下記一般式 （ 1 )
Figure imgf000055_0001
(—般式 （1 ) において、 R 1は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜 8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ノレ誘導体である。 R 1は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換 基により置換されていてもよい。 ）
で表される置換ひーケト酸と、
下記一般式 （2 )
Figure imgf000056_0001
(一般式 （2 ) において、 R2は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体である。 R2は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくとも一種の置換 基により置換されていてもよい。 ただし、 一般式 （1 ) において、 R 1が水素、 メチル基 またはカルボキシメチル基である場合は、 R2は水素ではない。 ） で表される置換 α—ケ ト酸とを反応せしめることにより、
下記一般式 （3 )
Figure imgf000056_0002
(一般式 （3 ) における R 1および R2は、 一般式 （1 ) および （2 ) における R 1および R2と同義である。 ）
で表される置換 α—ケト酸を製造する方法であって、
当該反応を触媒するタンパク質存在下で反応を実施することを特徴とする、置換 α—ケト 酸の製造方法。
1 5 . 前記 R2は、 水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 4項記載の置換 α—ケト酸の製造方法。
1 6 . 前記 R2は、 水素であることを特徴とする、 請求の範囲第 1 5項記載の置換ひ一 ケト酸の製造方法。
1 7 . 前記 は、 ベンジル基または 3—インドリルメチル基であり、 前記 は、 水素 または力ルポキシル基であることを特徴とする、請求の範囲第 1 4項記載の置換 α—ケト 酸の製造方法。
1 8 . インドールー 3—ピルビン酸と、 ォキサ口酢酸またはピルビン酸とから、 下記式 ( 4 )
Figure imgf000057_0001
に表す置換 α—ケト酸を製造する方法であって、当該反応を触媒するタンパク質存在下で 反応を実施することを特徴とする、 置換 ーケト酸の製造方法。
1 9 . 前記反応を触媒するタンパク質は、 シユードモナス （Pseudomonas) 属、 エルゥ ィニァ （Erwinia ) 属、 フラボパクテリゥム （Flavobacterium) 属、 キサントモナス
(Xanthomonas) 属からなる群から選ばれる微生物に由来することを特徴とする、 請求の 範囲第 1 4項〜第 1 8項のいずれか一項に記載の置換ひーケト酸の製造方法。
2 0 . 前記微生物は、 シユードモナス タエトロレンス （Pseudomonas taetrolens) 、 シユードモナス コロナファシエンス (Pseudomonas coronafaciens) 、 シユードモナス デスモリティカ (Pseudomonas desmolytica) 、 ェノレウイニァ エスピー (Erwinia sp. ) 、 フラボパクテリゥム レナム (Flavobacterium rhenanum) 、 またはキサントモナス シ トリ （Xanthomonas citri) であることを特徴とする請求の範囲第 1 9項記載の置換 α— ケト酸の製造方法。
2 1 . 前記微生物は、 シユードモナス タエトロレンス （Pseudomonas taetrolens) A T C C 4 6 8 3 、 またはシユー ドモナス コ ロナファシエンス （ Pseudomonas coronafaciens) A J 2 7 9 1であることを特徴とする請求の範囲第 2 0項記載の置換 ct ーケト酸の製造方法。
2 2 . 前記反応を触媒するタンパク質は、 下記 （i ) 〜 （1 ) のうちいずれかのタンパ ク質であることを特徴とする請求の範囲第 1 4項〜第 2 1項のいずれか一項に記載の置 換 α—ケト酸の製造方法。
( i )配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列からなるタンパク質
( j )配列表の配列番号 2記载のァミノ酸配列又は同配列中残基番号 5〜 2 2 5のァミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含 むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活性を有するタンパク質
( k ) 配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
( 1 )配列表の配列番号 1 6記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸残基 の置換、 欠失、 揷入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 アルドラーゼ活 性を有-
2 3 . 下記一般式 （ 1 ')
Figure imgf000058_0001
(一般式 （1 ') において、 R1は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルボキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ ル誘導体であり、 R3は、 水素またはカルボキシル基である。 R 1は、 更にハロゲン原子、 水酸基、炭素数 3までのアルキル基、炭素数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からな る群より選ばれる少なくともひとつの置換基により置換されていてもよい。 ）
で表される化合物と、
下記一般式 （2 ')
Figure imgf000058_0002
(一般式 （2 ') において、 R4は、 水素、 炭素数 1〜8のアルキル基、 炭素数 1〜8のァ ルコキシル基、炭素数 2〜 9のカルポキシアルキル基、炭素数 2 0までのァリール基もし くはァラルキル基、 炭素数 1 1までの複素環含有炭化水素基、 水酸基、 またはそのエステ 'ル誘導体である。 R4は、 更にハロゲン原子、 水酸基、 炭素数 3までのアルキル基、 炭素 数 3までのアルコキシ基およびアミノ基からなる群より選ばれる少なくともひとつの置 換基により置換されていてもよい。 ) で表される置換 α—ケト酸とを反応せしめることに より、 下記一般式 （3 ')
Figure imgf000059_0001
(一般式 （3 ') における R R3および R4は、 一般式 （1 および （2 ') における R R3および R4と同義である。 ）
で表される置換 α—ケト酸を製造する方法であって、
請求の範囲第 8項または第 9項のいずれか一項に記載のタンパク質の存在下で反応を実 施することを特徴とする、 置換 ο;—ケト酸の製造方法。
2 4 . 前記 R4は、 水素またはカルボキシル基であることを特徴とする、 請求の範囲第 2 3項記載の置換ひーケト酸の製造方法。
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