JP7402157B2 - 操作されたポリペプチドおよびβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸合成におけるそれらの用途 - Google Patents
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Description
技術分野
現在、D-(-)-スレオ-2-アミノ-1-(4-ニトロフェニル)-1,3-プロパンジオール(またはレボアミン)の合成には、2つの経路があり、p-ニトロベンズアルデヒドまたはp-ニトロ-アセトフェノンは、それぞれ出発材料として使用される。出発材料としてp-ニトロベンズアルデヒドを使用する場合には、必要とされる基質の数がより少なくなり、比較的簡易なプロセスである。しかし、複数の異性体構造が存在することにより、この経路には、過剰なp-ニトロベンズアルデヒドを必要とする。また、非常に高価な還元剤として水素化ホウ素カルシウムを必要とする。したがって、現在の工業的プロセスは、主に第2の経路である。P-ニトロアセトフェノンは、臭素化、アミノ化、アシル化、ホルムアルデヒド縮合、還元、加水分解を受けて、ラセミ生成物を生成し、次いで、酒石酸によって分割され、D-(-)-スレオ-2-アミノ-1-(4-ニトロフェニル)-1,3-プロパンジオールを得る。このプロセスは、無水酢酸、塩化ベンジル、酢酸、臭素などの刺激性有機溶媒を大量に使用するため、過酷な環境影響を与え、産生現場の管理も非常に困難になる。また、この合成プロセスは、保護、脱保護、分割など、多くのステップで構成されており、時間を要し、全体的な収率が低下する。
本発明は、高い立体選択性、高い触媒活性および良好な安定性を有する操作されたポリペプチドを提供する。これにより、β-ヒドロキシ-α-アミノ酸を不斉的に合成でき、特に(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-(4-ニトロフェニル)プロパン酸を不斉合成できる。本発明はまた、操作されたポリペプチドの遺伝子配列、遺伝子を含む組換え発現ベクター、操作された株およびその効率的な産生方法、ならびに操作されたポリペプチドを使用したβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸の不斉合成のための反応プロセスも提供する。
いくつかの実施形態では、全細胞、粗抽出物、単離酵素、または精製酵素の形態の操作されたアルドラーゼは、単独で、または樹脂への固定などの固定形態で使用することができる。
R1は、任意の置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリールであるか、または、任意の置換もしくは非置換C1~C8ヒドロカルビルである。
R2は、-H、-CH2OH、-CH2SH、-CH2SCH3、または任意の置換もしくは非置換のC1~C4ヒドロカルビルであり、このプロセスは、好適な反応条件下で、アルデヒド基質とアミノ酸基質とを反応させて、β-ヒドロキシ-α-アミノ酸生成物を得ることを含み、式(II)のアルデヒド基質、および式(III)
また、R3は、
2.詳細
2.1定義
「溶媒安定性」とは、一定期間(例、0.5~24時間)、様々な溶媒(エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルtert-ブチルエーテルなど)にさらされた後、同様の活性(例えば、50%~80%以上)を保持するアルドラーゼポリペプチドを指す。
2.2操作されたアルドラーゼ
2.3操作されたアルドラーゼポリペプチドの産生に使用できるポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクターおよび宿主細胞
2.4操作されたアルドラーゼポリペプチドの産生プロセス
2.5操作されたアルドラーゼおよびそれにより調製された化合物の使用方法
(式中、R1は、任意の置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール、または任意の置換もしくは非置換C1~C8アルキルであり、R2は、-H、-CH2OH、-CH2SH、-CH2SCH3、または任意の置換もしくは非置換C1~C4ヒドロカルビルである)。本明細書のプロセスは、アルデヒド基質およびアミノ酸基質をβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸生成物に変換するのに好適である反応条件下で、式(II)のアルデヒド基質および式(III)のアミノ酸基質
また、R3は、
本明細書に記載のプロセスでは、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、アミノ酸およびアルデヒド化合物を使用して生成物化合物を形成する。いくつかの実施形態では、反応条件のアミノ酸としては、グリシン、D、L-アラニン、D、L-セリン、D、L-システイン、D、L-ロイシン、D、L-イソロイシン、D、L-メチオニン、D、L-スレオニンまたはD、L-バリンから選択される化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸はグリシンである。いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、基質(II)のモル負荷の少なくとも約1倍の負荷で存在するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリシンは、基質(II)のモル負荷の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10倍の負荷で存在する。
本明細書に記載の反応の実施において、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、部分精製形態または精製形態で、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、ならびに/または細胞抽出物および/もしくはこうした細胞の溶解物として、反応混合物に添加され得る。操作されたアルドラーゼをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、または細胞抽出物、それらの溶解物、および単離された酵素は、固体(例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など)または半固体(例えば、粗ペースト)など幅広い範囲の異なる形態で使用され得る。細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿(例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など)によって部分的に精製され、その後、凍結乾燥の前に脱塩手順(例えば、限外濾過、透析など)が行われ得る。酵素調製物はいずれも、グルタルアルデヒドなどの既知の架橋剤を使用した架橋、または固相材料(樹脂など)への固定化により安定化できる。
3.実施例
実施例1:遺伝子クローニングおよび発現ベクターの構築
実施例2:アルドラーゼポリペプチドの組換え発現
実施例3:アルドラーゼポリペプチドの活性および立体選択性を測定するための反応条件および分析方法
実施例4:アルドラーゼ突然変異体ライブラリーの構築
実施例5:アルドラーゼ突然変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニング
実施例6:操作されたアルドラーゼの発現のための発酵プロセス
実施例7:アルドラーゼポリペプチドにより触媒されるアルデヒドおよびアミノ酸からの(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-(4-ニトロフェニル)プロパン酸の不斉合成
実施例8:(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-(4-ニトロフェニル)プロパン酸からのD-(-)-スレオ-2-アミノ-1-(4-ニトロフェニル)-1,3-プロパンジオールの調製
実施例9アルドラーゼポリペプチドにより触媒される(2S,3R)-3-[p-(メチルスルホニル)フェニル]-3-ヒドロキシ-2-アミノ-プロパン酸の不斉合成
実施例10アルドラーゼポリペプチドにより触媒される(2S,3R)-2-アミノ-3-(3,4-ジヒドロキシベンゼン)-3-ヒドロキシプロパン酸の不斉合成
Claims (19)
- 配列番号24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、および230からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、操作されたポリペプチド。
- 化学結合または物理吸着法により固体材料上に固定化されたポリペプチドであって、請求項1に記載の操作されたポリペプチドから選択されるポリペプチド。
- 請求項1に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、または229のポリヌクレオチド配列である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3または4に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターを含む、請求項5に記載の発現ベクター。
- 請求項5または6に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項7に記載の宿主細胞を培養するステップ、および培養液からアルドラーゼポリペプチドを得るステップを含む、アルドラーゼポリペプチドの調製方法。
- 請求項1に記載の操作されたポリペプチドを含むアルドラーゼ触媒であって、前記アルドラーゼ触媒は、(a)請求項7に記載の宿主細胞もしくは前記ポリペプチドを含む培養液、または(b)前記ポリペプチドを含む宿主細胞の処理物もしくは培養液の処理物を含み、前記処理物は、(i)前記宿主細胞の培養液の抽出物、(ii)前記培養液の抽出物由来のアルドラーゼ単離生成物、または(iii)宿主細胞の固定産物、宿主細胞の抽出物の固定産物、もしくは前記培養液の抽出物由来のアルドラーゼ単離生成物の固定産物である、アルドラーゼ触媒。
- 式(I)のβ-ヒドロキシ-α-アミノ酸を調製するプロセスであって:
R1は、置換もしくは非置換アリール、もしくは置換もしくは非置換ヘテロアリールであるか、または、置換もしくは非置換C1~C8ヒドロカルビルであり、
R2は、-H、-CH2OH、-CH2SH、-CH2SCH3、または置換もしくは非置換C1~C4ヒドロカルビルであり、
式(II)のアルデヒド基質および式(III)のアミノ酸基質を、
式(I)の前記β-ヒドロキシ-α-アミノ酸が、ジアステレオマー過剰で得られ、
前記好適な反応条件が、10℃~60℃の温度および/またはpH4.0~pH8.0を含む、プロセス。 - 式(I)の前記β-ヒドロキシ-α-アミノ酸が、
請求項10に記載のプロセス。 - R3が、フェニル環のパラ位にあるか、もしくはR3が、前記フェニル環のメタ位にあるか、もしくはR3が、前記フェニル環のオルト位にあるか、またはR3が、前記フェニル環のパラ位およびメタ位の両方にあるか、もしくはR3が、前記フェニル環のパラ位およびオルト位の両方にあるか、もしくはR3が、前記フェニル環のメタ位およびオルト位の両方である、請求項11に記載のプロセス。
- 式(I)の前記β-ヒドロキシ-α-アミノ酸が:
- 式A2の化合物(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-(4-ニトロフェニル)プロピオン酸を調製するためのプロセスであって、
前記好適な反応条件が、10℃~60℃の温度および/またはpH4.0~pH8.0を含み、
前記好適な溶媒が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはジメチルホルムアミド(DMF)を含む、プロセス。 - 前記β-ヒドロキシ-α-アミノ酸が、少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する、請求項10~14のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記反応が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはジメチルホルムアミド(DMF)を含む溶媒中で実施される、請求項10~13および15のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記好適な反応条件が、10℃~60℃の温度を含む、請求項10~16のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記好適な反応条件が、pH4.0~pH8.0を含む、請求項10~17のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記アルデヒド基質が、5g/L~400g/Lの負荷で存在する、請求項10~18のいずれか一項に記載のプロセス。
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