JP7306720B2 - 改変トランスアミナーゼポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents
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Description
1.概要
本発明は、アキラルケトンからのアミノ基転移によってキラルアミン化合物を不斉合成すること、および特にR-(+)-α-フェニルエチルアミンを不斉合成すること(スキーム2)ができる、高い立体選択性、高い触媒活性、および良好な安定性を有する改変トランスアミナーゼポリペプチドを提供する。本発明はまた、改変トランスアミナーゼポリペプチドの遺伝子配列、遺伝子を含有する組換え発現ベクター、改変株およびそれらの効率的な生成方法、ならびに改変ポリペプチドを使用するキラルアミン化合物の不斉合成のための反応プロセスも提供する。
R1は、任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリール、または任意選択的に置換もしくは非置換のC1-C8ヒドロカルビル、あるいは
R2は、任意選択的に置換または非置換のC1-C6ヒドロカルビル、ハロゲン(-F、-Cl、-Br、および-Iなど)、-NO2、-NO、-SO2R’または-SOR’、-SR’、-NR’R’、-OR’、-CO2R’または-COR’、-C(O)NR’、-SO2NH2または-SONH2、-CN、CF3であり、
式中、各R’は、-Hまたは(C1-C4)ヒドロカルビルから独立して選択され、プロセスは、ケトン基質をアミン生成物に変換する適切な反応条件下で、式(II)のケトン基質およびアミン供与体をトランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含み、トランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号2と少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を有し、配列番号2と比較して、より高い変換率で、構造式(II)のケトン基質を式(I)のアミン生成物に変換することができる。
2.1 定義
別途明示的に定義されない限り、本開示で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
以下の表1は、本発明によって開発された改変トランスアミナーゼポリペプチドを例示する。各行は、特定の改変トランスアミナーゼポリペプチドのポリヌクレオチド配列番号およびアミノ酸配列番号、ならびに配列番号2と比較した残基の差異を示す。例示される各改変トランスアミナーゼポリペプチドの触媒性能のレベル(R-PEAの活性、安定性、選択性、および阻害効果を組み合わせた、反応における全体的な性能)を「+」で示し、その特定の意味を表2に示す。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のトランスアミナーゼ活性を有する改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、改変ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生成するように遺伝子発現を制御する1つ以上の異種調節配列に連結することができる。改変トランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する改変トランスアミナーゼポリペプチドを発現させることができる。当業者には明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、目的のタンパク質配列をコードする全ての可能なポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が選択可能または同義のコドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、極めて多数のポリヌクレオチドの生成が可能になり、その全てが、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を決定すると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない様式で単に1つ以上のコドンを修飾するだけで、任意の数の異なるポリヌクレオチドを生成することができる。この点に関して、本開示は、表1に列挙される例示的な改変ポリペプチドのアミノ酸配列を含む本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかについて、および参照により組み込まれる配列表の配列番号4~400の偶数配列識別子として開示されるポリペプチドのいずれかについて、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製することができる、ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変更を特に企図しており、それらは全て、具体的に開示または公開されるものと考えられる。
改変トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および/または定向進化に供することによって開発することができる。定向進化技術の説明は、「Biocatalysis for the Pharmaceutical Industry:Discovery,Development,and Manufacturing」(2009John Wiley&Sons Asia(Pte)Ltd.ISBN:978-0-470-82314-9)に見出すことができる。
別の態様では、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドは、アミン供与体の存在下で、ケトン化合物をキラルアミン化合物に変換することができる。本開示はまた、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用して、広範囲の化合物(I)またはそれらの構造類似体を調製するプロセスも提供する。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、式(I)の化合物を調製するプロセスに使用することができる。
R1は、任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリール、または任意選択的に置換もしくは非置換のC1-C8ヒドロカルビルであり、あるいはそれは、
R2は、任意選択的に置換または非置換のC1-C6ヒドロカルビル、ハロゲン(-F、-Cl、-Br、および-Iなど)、-NO2、-NO、-SO2R’または-SOR’、-SR’、-NR’R’、-OR’、-CO2R’または-COR’、-C(O)NR’、-SO2NH2または-SONH2、-CN、CF3であり、式中、各R’は、-Hまたは(C1-C4)ヒドロカルビルから独立して選択される。本明細書のプロセスは、ケトン基質をアミン生成物に変換するのに適した反応条件下で、式(II)のケトン基質、
R3はまた、
Aspergillus fumigatusに由来する野生型トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、NCBIから取得することができ、その後対応する核酸を、供給業者が当該技術分野における従来の技術を使用して合成し、発現ベクターpACYC-Duet-1にクローニングした。組換え発現プラスミドを、42℃および90秒間の熱ショックの条件下で、E.coli BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換した。形質転換物を、クロラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上に播種し、その後37℃で一晩インキュベートした。組換え形質転換体を得た。
実施例1で得た組換えE.coli BL21(DE3)形質転換体を、250mLの三角フラスコ内のクロラムフェニコールを含有する50mLのLB培地(ペプトン10g/L、酵母抽出物粉末5g/L、塩素化ナトリウム10g/L、pH7.0±0.2、25℃)に播種し、その後振盪インキュベーター内で、30℃、250rpmで一晩培養した。この一晩培養物のOD600が2に到達したとき、それを、250mLのTB培地(トリプトン12g/L、酵母エキス24g/L、リン酸水素二ナトリウム9.4g/L、リン酸水素二カリウム2.2g/L、pH7.2±0.2、30℃)を含有する1.0Lのフラスコ内で、5%(v/v)の播種量で継代培養した。ラクトースを、6g/Lの最終濃度でTB培地に添加して、発現を誘導し、この発現培養物を、30℃、250rpmの振盪インキュベーター内に一晩入れた。約20時間後、発現培養物を遠心分離し、遠心分離後に湿細胞を収集し、PBS緩衝液(pH7.4)で2回洗浄し、その後使用するまで-20℃で保存することができる。細胞を破壊するために、得られた湿細胞を50mLのPBS緩衝液(pH7.4)で再懸濁し、懸濁液を氷浴に入れ、5分間超音波処理した。Thermo Multifuge X3R遠心分離機を使用して、4℃、8000rpmで10分間遠心分離することによって、得られた細胞溶解物を清澄化した。清澄化した細胞溶解物を、-20℃で凍結し、酵素粉末へと凍結乾燥した。得られたトランスアミナーゼ酵素粉末は、使用するまで-20℃で保存することができる。
ここでは、Quikchangeキット(供給業者:Agilent)を使用した。突然変異誘発プライマーの配列設計は、キットの指示に従って行った。部位飽和変異誘発ライブラリーの構築は、以下のとおりである。PCR反応は、10μlの5×緩衝液、1μlの10mMのdNTP、1μlのプラスミドDNAテンプレート(50ng/μl)、各々0.75μl(10uM)の上流および下流プライマー、0.5μlの高忠実度酵素、ならびに36μlのddH2Oからなり、PCRプライマーは、変異位置にNNKコドンを有する。
トランスアミナーゼ変異体ライブラリーの発現を、振盪フラスコ内で発現条件を小型化することによって96ウェルプレートで行い(フラスコから96ウェルプレートに培養規模を比例的に減少させた)、特定の操作手順は、以下のとおりであった。酵素変異体ライブラリーの単一クローンを、LB寒天プレートから取り出し、96ウェルの浅型プレートの200μL/ウェルのLB培地(クロラムフェニコールを含有)に播種し、180rpmの振盪機内、30℃および80%の湿度で18~20時間一晩培養した。浅型プレート培養物のOD600が約2.0である場合、この培養物を20μL取って、96ウェルの深型ウェルプレートの新鮮な400μL/ウェルのTB培地(クロラムフェニコールを含有)を播種し、250rpmの振盪機内、30℃および80%の湿度で培養した。深型ウェル培養物のOD600が0.6~0.8に到達したとき、IPTGを1mMの最終濃度で添加して、発現を誘導し、30℃で18~20時間一晩発現させた。最後に、発現培養物を4000rpmで10分間遠心分離して、96ウェルプレートに湿細胞を収集し、これは使用するまで-20℃で保存することができる。
上記で得られた湿細胞を含有する96ウェルプレートに、200μL/ウェルの細胞溶解緩衝液を添加し、プレートを密封し、700rpmのプレート振盪機に1時間入れて、細胞を破壊し、その後4000rpmで10分間遠心分離した。細胞溶解物の上清を収集した。反応緩衝液[0.4mMのPLP、6MのIPM、0.1MのTEOA、pH9.0(25℃)]の原液を調製し、これを、液体ハンドラーを使用して、50μL/ウェルで新鮮なアッセイプレート(96深型ウェルプレート)に移し、メタノール中、アセトフェノンの原液を調製し、これを、50μL/ウェルでアッセイプレートに移し、最後に、上記で得られた細胞溶解物の上清を、100μL/ウェルでアッセイプレートに移し、これにより、総反応体積は、約200μL/ウェルであり、最終反応設定は、約[0.1mMのPLP、1.5MのIPM、50g/Lのアセトフェノン、25%v/vのメソナール]である。アッセイプレートを、アルミニウムフィルムで熱融着し、振盪機に入れ、30℃、200rpmで20時間反応させた。反応後、400μLのACN(アセトニトリル)をアッセイプレートの各ウェルに添加して、反応を停止させた(800rpmで1時間振盪)。反応停止後、HPLC分析のために反応物から試料を採取し、各ウェルの変換を測定した。
HPLCを使用する高処理分析法は、以下のとおりである。分析カラムは、LP-C18 150*4.6mm、移動相は、0.4%の過塩素酸水溶液(pH1.5):アセトニトリル=55:45、流量は、2.2mL/分、カラム温度は、40℃、検出波長は、220nm、分析時間は、2.5分、アセトフェノンの保持時間は、2.34分、R-PEAの保持時間は、0.97分である。
標的改変トランスアミナーゼの遺伝子を担持するプラスミドを含有するE.coli BL21(DE3)の単一コロニーを、30μg/mLのクロラムフェニコールを含有する50mLのLBブロス(5.0g/Lの酵母抽出物LP0021、10g/LのトリプトンLP0042、10g/Lの塩化ナトリウム)に播種した。細胞を、30℃の振盪機内、250rpmで振盪しながら、少なくとも16時間培養した。培養物のOD600が3.5~4.5に到達したとき、培養物を使用して、発酵槽に播種した。
以下は、50mLの反応体積での代表的な反応プロセスである。イソプロピルアミンの原液:8mLのトリエタノールアミン緩衝液(0.1M、pH9)を、6.9mLのイソプロピルアミンと混合し、その後塩酸を添加して、pHを9に調整し、これが20mLになるまでトリエタノールアミン緩衝液(0.1M、pH9)を補給した。250mLの反応容器に、0.25gの酵素粉末(配列番号390)、17.07mLのトリエタノールアミン緩衝液(pH9)、20mLのイソプロピルアミンの上記の原液、500uLの10mMのピリドキサールリン酸溶液、10mLのメタノールを添加し、撹拌した。混合後、2.43mLのアセトフェノンを、反応容器に添加した。反応の温度を、水浴で30℃に維持し、撹拌速度は、200rpmであり、反応容器に陰圧を印加して、生成されたアセトンを除去した。24時間後、アセトフェノンのR-PEAへの変換は、80%以上であり、生成物R-PEAのee値は、99%以上であった。
Claims (15)
- 配列番号86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる改変トランスアミナーゼポリペプチド。
- 化学結合または物理吸着法によって固体材料に固定化された改変トランスアミナーゼポリペプチドであって、請求項1に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドから選択される、改変トランスアミナーゼポリペプチド。
- 請求項1または2に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、それぞれ、配列番号85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3または4に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターを含む、請求項5に記載の発現ベクター。
- 請求項5または6に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 改変トランスアミナーゼポリペプチドを調製する方法であって、請求項7に記載の宿主細胞を培養するステップと、得られた培養物から改変トランスアミナーゼポリペプチドを得るステップと、を含む、方法。
- 請求項7に記載の宿主細胞を培養することによって、または請求項8に記載の方法によって得ることができるトランスアミナーゼ触媒であって、前記トランスアミナーゼ触媒が、改変トランスアミナーゼポリペプチドを含有する細胞もしくは培養物、またはそれで処理された物品を含み、前記物品が、形質転換細胞の前記培養物から得られる抽出物、前記抽出物から改変トランスアミナーゼポリペプチドを単離もしくは精製することによって得られる単離生成物、または形質転換細胞、その抽出物、もしくは前記抽出物の単離生成物を固定化することによって得られる固定化生成物を指す、トランスアミナーゼ触媒。
- 前記式A2の化合物が、少なくとも70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する、請求項10に記載のプロセス。
- 前記有機溶媒が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、またはジメチルホルムアミド(DMF)を含む、請求項10又は11に記載のプロセス。
- 前記反応条件が、10℃~60℃の温度を含む、請求項10~12のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記反応条件が、pH7.0~pH11.0を含む、請求項10~13のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記式A1の化合物が、1g/L~200g/Lの負荷で存在する、請求項10~14のいずれか一項に記載のプロセス。
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