CN104630170A - 一种来源于里氏木霉的新(r)-转氨酶及其应用 - Google Patents

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陈曦
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Abstract

本发明公开了一种新(R)-转氨酶及其应用。该(R)-转氨酶来源于里氏木霉Trichoderma reesei QM6a(命名该酶为HTR)，其基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。新(R)-转氨酶HTR是一种严格(R)立体选择性的ω-转氨酶，具有宽广的底物谱，在手性胺和非天然氨基酸的生物制造方面具有很大的应用潜力。

Description

一种来源于里氏木霉的新(R)-转氨酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物催化领域，主要涉及一种来源于里氏木霉的新(R)-转氨酶及其在生产手性胺和非天然氨基酸方面的应用。
背景技术
手性胺和非天然氨基酸在医药、食品、化妆品等高附加值领域具有广泛的应用。例如(R)-4-苯丁基-2-胺(抗高血压药Dilevalol的前体)、苯基异丝氨酸(β-氨基酸，抗癌药紫杉醇的侧链部分)和Cispentacin(环状β-氨基酸，抗真菌药物)等皆为药物合成的关键中间体或者关键手性模块，D-丙氨酸等非天然氨基酸越来越多被用于高级化妆品。另外，研究表明，含有非天然氨基酸的多肽应对蛋白酶降解的稳定性高于天然多肽，并且仍然保持其生物活性。这显示在研发高稳定性且不被人体排斥的新药、抗体以及人造蛋白质方面，非天然氨基酸或将发挥不可替代的作用。然而，与天然氨基酸不同，手性胺和非天然氨基酸尚不能通过发酵法进行工业化生产，现在主要依靠有机合成法进行生产。有机合成法的不足是不易得到光学纯的产物，而且通常需要高压高温高能耗，因此亟需实现手性胺和非天然氨基酸的绿色生产。
转氨酶，又叫氨基转移酶，是催化氨基化合物和羰基化合物之间氨基可逆转移(乒乓机制)的一类酶，根据其底物氨基的位置，可以分成α-转氨酶和ω-转氨酶。α-转氨酶较为常见，只能催化α-氨基的转移；而ω-转氨酶则较为罕见，除了能催化α-氨基的转移，也能催化非α位氨基的转移，具有更为宽广的底物谱和严格的立体选择性，能够在温和条件下拆分胺消旋体(附图1a)或者催化前手性底物羰基上的不对称加氨(附图1b)来生产手性胺及非天然氨基酸。另外，ω-转氨酶以磷酸吡哆醛(PLP)为辅基，催化反应过程中无需添加额外的辅因子循环，这在工业应用中很有优势。总之，用ω-转氨酶来生产光学纯的手性胺和非天然氨基酸，可以避免传统化学法的高压高温高能耗高污染，是符合绿色生产理念的先进生物制造，显示出替代有机合成法的巨大潜力。例如，2010年Science报道了Codexis公司与Merck公司的研究成果，采用(R)选择性的ω-转氨酶成功替代了基于贵金属铑催化的化学法来工业化生产抗糖尿病药物西他列汀(一种手性胺)。
严格的立体选择性是酶区别于化学催化剂的关键特性，所以获得特定立体选择性的酶，是后续研究改造和工业应用的重要基础。根据文献报道，ω-转氨酶中(S)选择性的酶较为常见，而(R)选择性的ω-转氨酶(下文称为(R)-转氨酶)却较为稀有([1]Koszelewski D，Tauber K，FaberK，et al.ω-Transaminases for the synthesis of non-racemicα-chiral primary amines[J].Trends inbiotechnology，2010，28(6)：324-332.[2]Mathew S，Yun H.ω-Transaminases for the production ofoptically pure amines and unnatural amino acids[J].Acs Catalysis，2012，2(6)：993-1001)。至今为止，国内尚未有(R)-转氨酶的报道。因此，发掘具有工业应用潜力的新(R)-转氨酶对手性胺和非天然氨基酸的绿色生产具有特殊的意义。
发明内容
本发明的目的是为手性胺和非天然氨基酸的绿色生产提供一种具有工业应用潜力的(R)-转氨酶。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种来源于里氏木霉Trichoderma reesei QM6a的新(R)-转氨酶(称为HTR)，其基因核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
本领域研究者对新(R)-转氨酶HTR进行蛋白质工程改造(例如氨基酸残基保守置换、氨基酸序列增长截短、合理设计、定向进化、酶的化学修饰等)所获得的(R)-转氨酶，也属于本发明的范围。
本发明的另一目的是提供一种制备新(R)-转氨酶HTR的方法。
该制备方法包括以下步骤：(1)通过基因全合成技术获得编码新(R)-转氨酶HTR的基因片段。(2)将基因片段构建到pET28a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(3)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(4)将工程菌株接种至LB培养基中，培养至对数期并用0.1mM的IPTG于25℃诱导表达12小时。(5)离心收集菌体，破菌留取上清液，采用金属亲和层析法(镍柱)纯化回收目的蛋白，并透析除去咪唑即得HTR纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示目的蛋白新(R)-转氨酶HTR大部分可溶表达，纯化所得蛋白条带单一，达到了电泳纯(见附图2)。
本发明的再一目的是提供新(R)-转氨酶HTR的酶学性质、底物谱及应用。
本发明的新(R)-转氨酶HTR在弱碱性条件下活力较高，其最适反应pH值为8.0。新(R)-转氨酶HTR的最适反应温度为42℃，其在50℃的磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝7.4)中孵育20分钟后，仍保持90％以上的活力，显示出较好的温度稳定性。
本发明的新(R)-转氨酶HTR具有宽广的氨基供体底物谱，尤其对各种(R)构型伯胺的活力很高，例如(R)-1-苯乙胺、(R)-1-氨基茚满、(R)-2-己胺和(R)-2-庚胺，而对(S)构型伯胺的活力很低，表现出严格的(R)立体选择性。这显示新(R)-转氨酶HTR可用于伯胺消旋体的动力学拆分。
进一步地，本发明的新(R)-转氨酶HTR能够动力学拆分50mM的1-苯乙胺、1-苯丙胺、1-氨基茚满和1-(4-氟苯基)乙胺，转化率皆在50％左右，产物的ee值皆＞99％，获得了光学纯的(S)-1-苯乙胺(附图3)、(S)-1-苯丙胺(附图4)、(S)-氨基茚满(附图5)和(S)-(4-氟苯基)乙胺(附图6)。这些结果，充分显示了本发明的新(R)-转氨酶HTR在动力学拆分胺消旋体获得手性胺方面的应用潜力。
本发明的新(R)-转氨酶HTR具有宽广的氨基受体底物谱，包括酮、羟基酮、α-酮酸及β-酮酸酯等，并且其对应产物的ee值大都超过99％。这显示新(R)-转氨酶HTR可应用于手性胺和非天然氨基酸的不对称合成。
进一步地，本发明的新(R)-转氨酶HTR能够将20mM和50mM丙酮酸不对称加氨合成D-α-丙氨酸，转化率分别达到99％和94％，ee值皆＞99％(附图7)；能够将50mM的2-酮丁酸不对称加氨合成D-α-氨基丁酸，转化率达到98％，ee值＞99％(附图8)；能够将10mM的2-酮戊酸不对称加氨合成D-α-氨基戊酸，转化率最高达到82％，ee值＞99％(附图9)。这些结果，充分显示了本发明的新(R)-转氨酶HTR在光学纯非天然氨基酸的不对称合成方面富有应用潜力。
本发明的优点在于：(R)-转氨酶是比(S)-转氨酶更稀有的一类ω-转氨酶，在手性胺和非天然氨基酸的生物制造中具有特殊意义。本发明公布的新(R)-转氨酶HTR具有严格的(R)立体选择性，并且具有宽广的底物谱，在手性胺和非天然氨基酸的绿色生产中显示出工业应用前景。
附图说明
附图1为ω-转氨酶催化反应示意图。
附图2为新(R)-转氨酶HTR的SDS-PAGE图谱。1：蛋白质分子量标记，2：镍柱纯化所得HTR，3：诱导表达后破菌上清液，4：诱导表达后破菌沉淀。
附图3为HTR动力学拆分1-苯乙胺的产物光学纯度检测图谱。
附图4为HTR动力学拆分1-苯丙胺的产物光学纯度检测图谱。
附图5为HTR动力学拆分1-氨基茚满的产物光学纯度检测图谱。
附图6为HTR动力学拆分1-(4-氟苯基)乙胺的产物光学纯度检测图谱。
附图7为HTR催化丙酮酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
附图8为HTR催化2-丁酮酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
附图9为HTR催化2-戊酮酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的部分内容，以便于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例一  新(R)-转氨酶HTR的制备方法
(1)构建工程菌：新(R)-转氨酶HTR的编码基因(SEQ NO.1)通过基因全合成的方法获得(根据大肠杆菌的密码子偏好进行了密码子优化，并在N端添加有6×His-tag以便用镍亲和柱纯化目的蛋白HTR)，连接至pET32a表达载体Nde I/BamH I位点之间。重组质粒被转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。
(2)表达纯化：采用LB培养基，于37℃摇床培养至对数期，降温至25℃后，加入终浓度为0.1mM的IPTG，于25℃摇床中诱导表达12小时。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用含有20μM磷酸吡哆醛(PLP)的磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.0)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得新(R)-转氨酶HTR纯酶液。
SDS-PAGE电泳显示目的蛋白新(R)-转氨酶HTR大部分以可溶形式存在于细胞内，镍柱纯化后所得目的蛋白的纯度很高(见附图2)。
实施例二  新(R)-转氨酶HTR的酶学性质
检验了新(R)-转氨酶HTR的最适pH值、最适反应温度和温度稳定性。
反应简式：
测活反应体系：1ml的pH缓冲液，PLP(20μM)，(R)-1-苯乙胺(10mM)，丙酮酸(10mM)。通过加入适量的新(R)-转氨酶HTR启动反应，反应半小时后以高氯酸终止反应。终止反应之后，通过HPLC测定反应生成的苯乙酮的量来确定酶活力的大小。
最适反应pH值的测定：采用测活反应体系，反应温度30℃，测定在一系列不同pH值(pH＝5、6、7、7.4、7.8、8、8.4、8.8、9、9.4、9.6、10)时新(R)-转氨酶HTR的酶活力大小。不同pH范围所用的缓冲液为：醋酸缓冲液(pH3.8-5.6)、磷酸钠缓冲液(pH5.8-7.6)、硼酸硼砂缓冲液(pH7.8-9.2)和硼砂氢氧化钠缓冲液(pH9.3-10.1)。
最适反应温度的测定：采用测活反应体系，选用磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)，测定在一系列不同反应温度(25、30、35、37、40、42、45、50℃)下新(R)-转氨酶HTR的酶活力大小。
温度稳定性：采用测活反应体系，选用磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)，反应温度为30℃，测定分别经过一系列不同温度(30、35、40、45、50、55、60℃)热处理20分钟的新(R)-转氨酶HTR的残留酶活力的大小。
结果显示：新(R)-转氨酶HTR在弱碱性条件下活力较高，其最适反应pH值为8.0；最适反应温度为42℃，其在50℃的磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.4)中孵育20分钟后，仍保持90％以上的活力，显示出较好的温度稳定性。
实施例三  新(R)-转氨酶HTR的底物谱及应用
(1)新(R)-转氨酶HTR的氨基供体底物谱。
反应简式：
反应条件：反应体系1ml。在磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)中加入磷酸吡哆醛(20μM)，氨基供体底物(10mM，消旋体20mM)和丙酮酸(10mM)，混匀后加适量HTR酶液启动反应，于30℃水浴锅中反应30分钟后，用375ul的16％高氯酸终止反应。
相对活力的计算：通过检测反应体系中丙酮酸的减少量来计算各底物的相对活力。丙酮酸的液相检测条件为：Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，USA)，柱温45℃，以5mM的H2SO4为流动相，流速0.6ml/min，检测205nm处的紫外吸收值。
结果如表3所示，新(R)-转氨酶HTR对不同氨基供体的活力各不相同，其对胺的活力很高，并且对脂肪胺的活力高于对芳香胺的活力，(R)-2-庚胺是活力最高的氨基供体，(R)-2-己胺、2-戊胺和(R)-1-氨基茚满也显示出较高的反应活力。新(R)-转氨酶HTR对(R)-1-苯乙胺的活力很高，而对(S)-1-苯乙胺活力为零，说明该酶具有严格的(R)-立体选择性。结果显示：新(R)-转氨酶HTR在拆分胺消旋体获得(S)构型手性胺方面具有应用潜力。
表3新(R)-转氨酶HTR的氨基供体底物谱
表注：①将酶对(R)-1-苯乙胺(10mM)的活力定为100％(1.1U/mg)，相对活力小于1％者记为零。
②一个酶活单位(1U)定义为在分别以(R)-1-苯乙胺(10mM)和丙酮酸(10mM)为氨基供体和氨基受体的反应体系中，1分钟内催化形成1μmol苯乙酮所需要的酶量。
(2)新(R)-转氨酶HTR的氨基受体底物谱。
反应简式：
反应条件：反应体系1ml。在磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)中加入磷酸吡哆醛(20μM)，(R)-1-苯乙胺(10mM)和氨基受体底物(10mM)，混匀后加适量HTR酶液启动反应，于30℃水浴锅中反应30分钟后，用375ul的16％高氯酸终止反应。
相对活力的计算：通过检测反应体系中苯乙酮的生成量来计算各底物的相对活力。苯乙酮的检测条件为：Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，Aglient，USA)，乙腈/水(50/50，v/v)等度洗脱，流速1ml/min，检测205nm处的紫外吸收值。
产物构型的检测：(1)底物乙酰乙酸乙酯和丙酰乙酸乙酯的加氨产物β-氨基丁酸乙酯和β-氨基戊酸乙酯：将反应液调成弱酸性用乙酸乙酯抽提去除未反应的底物，将水相调至弱碱性，用乙酸乙酯抽提出产物，在通风橱中将乙酸乙酯挥发掉即得产物。对产物进行乙酰化衍生，之后用气相色谱检测。检测条件为：Chirasil-DEX CB柱(25m×0.25mm×0.25μm，Varian，USA)，柱温140℃，恒温，分流比20：1，载气(氦气)流速2ml/min，FID检测器220℃。(2)表5中其他底物对应的加氨产物：取适量反应液，对其进行FDAA(1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)衍生，操作参照说明书(Thermo Fisher Scientific，USA)。之后用液相色谱检测。检测条件为：Eclipse XDB-C18柱，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈(50/50，v/v)等度洗脱，检测340nm处的紫外吸收峰。对不同产物，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈的比例和流速不同：对丙酮酸、2-丁酮酸、2-戊酮酸、4-戊酮酸和羟基丙酮的产物，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈的比例为70/30(v/v)，流速0.5ml/min；对4-苯基-2-丁酮、2-戊酮和2-己酮的产物，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈的比例为50/50(v/v)，流速1ml/min；对巯基丙酮酸的产物，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈的比例为70/30(v/v)，流速1ml/min。
结果如表4所示，新(R)-转氨酶HTR对测试过的所有受体底物都表现出明显活力，并且对应产物的纯度很高，绝大多数ee值＞99％(R)。丙酮酸是活力最高的氨基受体底物，2-戊酮酸和乙醛酸的活力也很高，并且新(R)-转氨酶HTR对酮底物也表现出明显活力。特别有意义的是，新(R)-转氨酶HTR对丙酮酸、2-丁酮酸、2-戊酮酸、巯基丙酮酸、乙酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯和4-戊酮酸都具有显著活力，这些底物对应的加氨产物都是非天然氨基酸(或其酯化形式)，这显示新(R)-转氨酶HTR在不对称合成非天然氨基酸方面具有应用潜力。
表4新(R)-转氨酶HTR的氨基受体底物谱
表注：①将酶对丙酮酸(10mM)的活力定为100％(1.1U/mg)，相对活力小于1％者记为零。②一个酶活单位(1U)定义为在分别以(R)-1-苯乙胺(10mM)和丙酮酸(10mM)为氨基供体和氨基受体的反应体系中，1分钟内催化形成1μmol苯乙酮所需要的酶量。
(3)新(R)-转氨酶HTR动力学拆分胺消旋体。
动力学拆分反应示意图：附图1a。
反应条件：反应体系为1ml，氨基供体为消旋胺(1-苯乙胺、1-苯丙胺、1-氨基茚满或1-(4-氟苯基)乙胺)，氨基受体为丙酮酸。在磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)中，加入0.1mM的磷酸吡哆醛，40mM的丙酮酸，50mM的消旋胺，1.2mg的新(R)-转氨酶HTR，置于37℃摇床中反应15小时。反应设置空白对照(不加酶)，以便计算转化率。
转化率的计算：转化率根据反应体系中伯胺的减少量来计算，即转化率＝反应体系中伯胺的减少量÷空白对照中伯胺的总量×100％。伯胺含量的检测条件为：Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，Aglient，USA)，乙腈/水(50/50，v/v)等度洗脱，流速1ml/min，检测205nm处的紫外吸收值。
产物胺光学纯度的检测：取适量反应液，先离心过滤除去变性的蛋白质，之后对其进行FDAA(1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)衍生，操作参照说明书(Thermo Fisher Scientific，USA)。衍生产物用液相色谱检测，检测条件：Eclipse XDB-C18柱，磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈(50/50，v/v)等度洗脱，流速1ml/min，检测340nm处的紫外吸收值。根据产物对应构型的相对含量来计算产物ee值。
结果如表5所示，新(R)-转氨酶HTR动力学拆分50mM消旋胺的转化率皆在50％左右，产物ee值皆大于99％(S)(附图3、附图4、附图5、附图6)，说明(R)构型胺几乎被完全利用掉，得到了光学纯的(S)构型胺。结果生动地表明：本发明的新(R)-转氨酶HTR催化条件温和、反应转化率良好、产物光学纯度高，在手性胺的绿色生产中具有很大的应用价值。
  表5新(R)-转氨酶HTR动力学拆分胺消旋体
(4)新(R)-转氨酶HTR催化合成非天然氨基酸。
不对称合成反应示意图：附图1b。
反应条件：反应体系为1ml，以消旋1-苯乙胺为氨基供体，以丙酮酸、2-丁酮酸和2-戊酮酸三种α-酮酸为氨基受体。在磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)中，加入0.1mM的磷酸吡哆醛，一种底物α-酮酸(10mM、20mM或50mM)，三倍当量的消旋1-苯乙胺(30mM、60mM或50mM)，新(R)-转氨酶HTR，置于37℃摇床中反应。反应设置空白对照(不加酶)，以便计算转化率。
进一步地，当底物α-酮酸浓度为10mM或20mM时，新(R)-转氨酶HTR的用量为0.8mg/ml，反应时间为12小时；当底物α-酮酸浓度为50mM时，新(R)-转氨酶HTR的用量为1.2mg/ml，反应时间为16小时。
转化率的计算：转化率根据反应体系中底物α-酮酸的减少量来计算，即转化率＝反应体系中底物α-酮酸的减少量÷空白对照中底物α-酮酸的总量×100％。底物α-酮酸含量的检测条件为：Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad，USA)，柱温45℃，以5mM的H2SO4为流动相，流速0.6ml/min，检测205nm处的紫外吸收值。
产物非天然氨基酸构型的检测：取适量反应液，先离心过滤除去变性的蛋白质，之后对其进行FDAA(1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺)衍生，操作参照说明书(Thermo FisherScientific，USA)。衍生产物用液相色谱检测，检测条件：Eclipse XDB-C18柱，流动相为磷酸三乙胺(50mM，pH3.0)/乙腈＝70/30(v/v)，流速0.5ml/min，等度洗脱，检测340nm处的紫外吸收值。根据产物对应构型的相对含量来计算产物ee值。
结果如表6所示，新(R)-转氨酶HTR催化20mM和50mM丙酮酸的转化率达到99％和94％，产物ee值皆大于99％(附图7)；新(R)-转氨酶HTR催化50mM的2-丁酮酸的转化率达到98％，产物ee值大于99％(附图8)；新(R)-转氨酶HTR催化10mM的2-戊酮酸的转化率达到82％，产物ee值大于99％(附图9)。结果生动地表明：本发明的新(R)-转氨酶HTR催化条件温和、反应转化率良好、产物光学纯度高，在非天然氨基酸的绿色生产中具有很大的应用价值。
表6新(R)-转氨酶HTR催化合成非天然氨基酸

Claims (10)

1.一种来源于Trichoderma reesei QM6a的新(R)-转氨酶(命名为HTR)，其特征在于：(1)其基因的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示；(2)该酶在0.1mM的IPTG诱导下于25℃表达良好，最适反应pH为8.0，最适反应温度为42℃；(3)该酶具有宽广的底物谱和严格的立体选择性，可应用于手性胺和非天然氨基酸的制备。
2.含有能够编码权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR的核苷酸序列的重组质粒或表达盒，以及能够表达权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR的工程菌株。
3.与权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR的氨基酸序列一致性(identity)达到85％及以上的(R)-转氨酶。
4.含有编码权利要求3所述(R)-转氨酶的核苷酸序列的重组质粒或表达盒，以及能够表达权利要求3所述(R)-转氨酶的工程菌株。
5.对权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR进行蛋白质工程改造(氨基酸残基保守置换、氨基酸序列增长截短、合理设计、定向进化、酶的化学修饰等)所获得的(R)-转氨酶。
6.含有编码权利要求5所述(R)-转氨酶的核苷酸序列的重组质粒或表达盒，以及能够表达权利要求5所述(R)-转氨酶的工程菌株。
7.权利要求1、权利要求2、权利要求3、权利要求4、权利要求5及权利要求6所述的(R)-转氨酶、重组质粒、表达盒或工程菌株在制备手性胺和非天然氨基酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：生产手性胺和非天然氨基酸时，既包括采用对胺(氨基酸)消旋体的动力学拆分法，也包括采用对前手性羰基化合物加氨的不对称合成法。
9.如权利要求8所述的胺(氨基酸)消旋体，是指权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR对其有催化活力的消旋胺(氨基酸)；最优选表3中氨基供体底物对应的胺(氨基酸)消旋体以及表4中氨基受体底物对应的胺(氨基酸)消旋体：1-苯乙胺、1-苯丙胺、1-氨基茚满、1-氨基萘满、1-(4-氟苯基)乙胺、2-戊胺、2-己胺、2-庚胺、α-氨基丙醇、DL-β-氨基丁酸、DL-α-丙氨酸、DL-α-氨基丁酸、DL-α-氨基戊酸、DL-α-半胱氨酸、DL-β-氨基丁酸乙酯、DL-β-氨基戊酸乙酯、DL-γ-氨基戊酸、4-苯基-2-丁胺。
10.如权利要求8所述的前手性羰基化合物，是指权利要求1所述新(R)-转氨酶HTR对其有催化活力的前手性羰基化合物；最优选表3中氨基供体底物对应的前手性羰基化合物以及表4中氨基受体底物：苯乙酮、苯丙酮、1-茚酮、1-四氢萘酮、4-氟苯乙酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、羟基丙酮、β-丁酮酸、丙酮酸、2-丁酮酸、2-戊酮酸、巯基丙酮酸、乙酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯、4-戊酮酸、4-苯基-2-丁酮、2-戊酮、2-己酮。
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