CN103642765B - 醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变：野生型醇脱氢酶的序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；野生型醇脱氢酶的序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；所述的野生型醇脱氢酶的序列如SEQ？ID？NO：2、4、6或8中的任意一项所示。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase,ADH)突变体及其应用。
背景技术
手性醇(ChiralAlcohols)在手性药物、农用化学品以及多种类型的手性材料制备中有广泛应用。以(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]为例，(S)-CHBE可用于很多活性药物的合成，它是对映体选择性合成SlageninsB和C以及他汀类药物--羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键手性中间体，而且(S)-CHBE还可以转化生成1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂[1]。
羰酰还原酶生物催化法不对称还原COBE制备(S)-CHBE法因其高效率、高立体选择性、反应条件温和以及经济和社会效益好等优点受到普遍关注[2]。然而，该反应的进行需要消耗一定量的辅酶--NAD(P)H。这类还原态辅酶往往价格昂贵且稳定性低，从技术经济角度考虑，生产中投加大量辅酶是不可行的，因此辅酶的高效原位再生成为了发展应用氧化还原酶工业生物催化技术的瓶颈问题。
为了解决辅酶再生的问题，已经提出了酶法、光化学法、电化学法等一系列的方法[3]，其中酶法再生系统因其具有反应速率快、选择性高、再生体系与合成体系兼容性好、过程易于监控等优点而受到广泛重视，迄今已报道了多种脱氢酶、氧化酶、氢化酶参与实现的辅酶再生系统，其中甲酸脱氢酶（Formatedehydrogenase,FDH）是公认的烟酰胺型还原态辅酶再生系统的首选用酶[4-5]。甲酸脱氢酶催化甲酸生成CO2和H2O，伴随一分子的NAD+还原为NADH。该反应的底物甲酸廉价易得，且对合成体系的酶影响较小，而生成产物CO2易于分离，使反应接近不可逆过程，有利于提高酶转化效率，此外研究表明FDH适宜pH范围广泛，易于实现再生系统与合成系统的有效耦联。然而由于该体系只能实现NADH的再生，而短链脱氢酶家族中不少酶都是NADPH依赖型。随着分子生物学技术和蛋白质结构组学研究的日益发展，采用蛋白质工程技术改变酶的辅酶依赖型，从而很好地与甲酸脱氢酶偶联应用于辅酶再生体系，是近年来该领域的主要研究方向。
目前已有不少文献报道了通过定点突变手段实现酶的辅酶特异性的改变。早期的文献报道大多采用序列比对等较为经验性的方式获得突变位点，Katzberg等以酵母还原酶Gre2p为研究对象，将其序列与赭色掷孢酵母羰基还原酶SSCR的序列进行比对，选择Asn9作为突变位点，采用定点突变技术，获得突变体N9E，研究该突变酶的辅酶特异性发现，NADH/NADPH的值为0.9，而其野生型的值仅为0.007[6]。采用类似的位点选择方法的报道还有Zhang等2008年对来自近平滑念珠菌的羰基还原酶SCR所作的研究，选择了辅酶结合位点附近的Ser67，His68，Pro69作为突变位点。结果显示，双位点突变酶S67D/H68D在保留了酶的稳定性与立体选择性的基础上，其辅酶依赖型由NADPH依赖型变为更倾向于依赖NADH[7]。随着生物信息学，蛋白质结构生物学等领域的快速发展，对辅酶结合域的研究越发理性化，越来越多的报道采用计算机辅助技术对蛋白质的结构进行理性设计改造。大连科技大学2010年就研究发表了有关通过理性设计改变辅酶特异性的报道。文献报道了经通过自由能计算判断酶与辅酶的结合情况的方式，并采用丙氨酸筛选突变以确定影响辅酶特异性的关键位点。在充分的理论分析与理性设计后，获得Asp41Gly,Asp41Ala两个突变体，结果显示突变酶的辅酶特异性均发生显著改变。从结构上分析该现象的结构性原理显示突变后削弱了Asp41与磷酸基团之间的酯化作用[8]。同样的Morikawa等通过计算机辅助手段对来自木兰假丝酵母的S1进行研究，经虚拟筛选等理性设计最终获得的突变酶彻底失去了原本利用NADPH的能力，但其催化活性却只保留了野生型的14%[9]。
综上所述，现有的关于辅酶特异性改造的研究已得到进一步的发展，但就现有的研究成果而言，采用理性设计的研究并不多，改造后酶的活性大多出现不同程度的损失，辅酶特异性发生一定的改变却不能彻底改变等，这些方面都有较大的发展空间。
参考文献：
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发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种醇脱氢酶突变体，其辅酶依赖型由野生型的NADPH依赖型变为NADH依赖型。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种以上情况的突变：
（1）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸；
（2）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
（3）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
（4）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
其中，所述的野生型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、4、6或8中的任意一项所示。所述的野生型醇脱氢酶的氨基酸序列优选如SEQIDNO：2所示。
一种重组质粒，它是含有编码权利要求1所述的醇脱氢酶突变体的基因序列的质粒。其中，所述的质粒为pET24a(+)。
一种重组菌，它是含有权利要求2所述重组质粒的菌株。其中，宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
上述醇脱氢酶突变体在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用。
其中，所述的前手性羰基化合物为4-氯乙酰乙酸乙酯。
其中，所述的手性醇为(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
其中，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以醇脱氢酶突变体为催化剂，不对称还原反应制备得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯；具体反应条件为：3U/mL的醇脱氢酶突变体与100mM甲酸钠、50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、6U/mL的甲酸脱氢酶和0.5mM的NAD+，在pH6.5、30℃、200rpm条件下反应12h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
上述醇脱氢酶突变体，在催化羰基化合物生成羟基产物的反应中，与野生型的醇还原酶相比，辅酶依赖型发生彻底的改变，变为NADH依赖型，并且具有更高的催化活性和催化效率。
以SEQIDNO：2为例说明本发明的主要原理：通过体外定点突变(site-directedmutagenesis)技术对醇脱氢酶进行修饰，作为模板的醇脱氢酶，其Genebank登录号为ABB91667，由241个氨基酸组成，序列如SEQIDNO：2所示；其编码DNA序列包括726bp，序列如SEQIDNO：1所示；通过上述定体外点突变的方法获得的基因片段与pET24a(+)表达载体连接，并在大肠杆菌中过量表达。经过过量表达的醇脱氢酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为25kD。所述体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是改造/优化基因的常用手段，其原理是设计两对引物，采用定点突变的方法在基因中定点特异性的引入其他氨基酸。
本发明的有益效果是：
本发明所述醇脱氢酶突变体，可以有效的说明该醇脱氢酶中参与辅酶结合的关键氨基酸；并且本发明所得突变体蛋白S35D，S35D/R36I，A34I/S35D/R36I，S13A/S35D/R36I，S13A/A34I/S35D/R36I，其辅酶依赖型均发生改变，其中突变体S35D/R36I，A34I/S35D/R36I，S13A/S35D/R36I，S13A/A34I/S35D/R36I的辅酶依赖型发生彻底改变，即严格依赖于NADH；同时突变体S13A/S35D/R36I，S13A/A34I/S35D/R36I的催化活性达到野生型酶的3倍，与甲酸脱氢酶偶联应用于NADH辅酶再生体系，能有效的用于羰基类化合物的催化还原反应，例如：催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，与野生型醇还原酶相比具有更高的转化效率。
附图说明
图1是实施例3中醇还原酶及其突变体表达并纯化结果的SDS-PAGE分析；
图2是实施例6中突变酶S13A/A34I/S35D/R36I与甲酸脱氢酶偶联制备(S)-CHBE的催化效率的结果分析。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1～5是描述醇脱氢酶（SEQIDNo：2）的突变体的获得与酶的性能的测定。
实施例1：醇脱氢酶基因的构建。
1、醇脱氢酶基因的获取：
木兰假丝酵母(CandidamagnoliaeATCC12573)，培养基YPD（g·L-1）：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，补蒸馏水至1L。
将木兰假丝酵母(CandidamagnoliaeATCC12573)接种于5mLYPD液体培养基中30℃培养至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒（北京天为生物工程有限公司酵母基因组提取试剂盒，GD2415YeastgDNAKit）提取基因组。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点引物序列如下：
上游引物为(NdeIsiteisunderlined)：
5'-GGAATTCCATATGACGACTACTTCAAATGCGCTCGTCAC-3'
下游引物为(EcoRIsiteisunderlined)：
5'-CCGGAATTCCTAAGCAATCAAGCCATTGTCGACCAC-3'
所有引物均由上海美吉生物医药科技有限公司合成。
基因的PCR条件：
94℃变性7min，按如下参数循环35次：94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸60s。最后72℃延伸10min。
PCR体系：Pfu酶（2.5U/ml）1ul,模板（5-50ng）1ul,dNTP4ul,10×reactionbuffer5ul,primer各1ul,ddH2O补足50ul。
2、表达载体的构建：
用NdeⅠ及EcoRⅠ分别酶切pET-24a(+)（购于Novagen默克中国）及所扩增含有两个酶切位点的目的基因，分别胶回收已双酶切的目的片段和表达载体，将已双酶切的表达载体pET-24a(+)与目的基因用T4-DNA连接酶进行连接过夜，得到重组载体pET-24a-ADH；将10μL的连接产物pET-24a-ADH加入100μL的E.coliBL21(DE3)（实验室保藏）感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90s。冰上放置2min。加入预热的0.45mLSOC培养基。220rpm37℃1h。将200μL菌液加入含有30μg/mL的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h，得到重组菌E.coliBL21（含pET-24a-ADH）。
实施例2：醇脱氢酶突变体基因的构建。
1、定点突变
采用Stratagene公司的快速转换定点突变试剂盒对位于Ser13,Ala34,Ser35,Arg36位点的氨基酸残基进行定点突变。其引物设计如下（均按5'-3'方向描述，下划线代表突变位点）：
Ser35Asp(pET24a-ADH重组质粒作为模板）
S35D-1:CAGTGTTACGCTGGCCGACCGCAGTGTTG
S35D-2:CAACACTGCGGTCGGCCAGCGTAACACTG
Ser35Asp/Arg36Ile(突变体Ser35Asp作为模板)
S35D/R36I-1:CAGTGTTACGCTGGCCGACATCAGTGTTG
S35D/R36I-2:CAACACTGATGTCGGCCAGCGTAACACTG
Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile(突变体Ser35Asp/Arg36Ile作为模板)
A34I/S35D/R36I-1:CAGTGTTACGCTGATCGACCGCAGTGTTG
A34I/S35D/R36I-2:CAACACTGCGGTCGATCAGCGTAACACTG
Ser13Ala/Ser35Asp/Arg36Ile(突变体Ser35Asp/Arg36Ile作为模板)
S13A/S35D/R36I-1:GCTCGTCACTGGAGGCGCCCGCGGCATTGGCGCTG
S13A/S35D/R36I-2:
CAGCGCCAATGCCGCGGGCGCCTCCAGTGACGAGC
Ser13Ala/Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile
(突变体Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile作为模板)
S13A/A34I/S35D/R36I-1:GCTCGTCACTGGAGGCGCCCGCGGCATTGGCGCTG
S13A/A34I/S35D/R36I-2:CAGCGCCAATGCCGCGGGCGCCTCCAGTGACGAGC
PCR反应条件如下：
95℃变性120s，按如下参数循环18次：95℃变性30s，55℃退火60s，68℃延伸360s。最后68℃延伸5min。
PCR体系：Pfu酶（2.5U/ml）1ul,模板（5-50ng）1ul,dNTP4ul,10×reactionbuffer5ul,primer各1ul,ddH2O补足50ul。
PCR反应结束后，加入DpnI消化酶于反应混合物中并置于37℃孵育1h，转化到试剂盒提供的E.coliXL10-Gold超级感受态细胞中。
2、醇脱氢酶及其突变酶的表达
挑取重组菌E.coliBL21（含醇脱氢酶及其突变酶基因的重组质粒）及出发大肠杆菌BL21（DE3）至含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按2%接种量分别接种到新鲜含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mmol·L-1，30℃，200rpm，诱导表达12h后，离心(4℃，5000rpm，15min)，菌泥用100mM磷酸钾缓冲(pH6.2)重悬待用。
实施例3：醇脱氢酶及其突变酶的纯化。
1、粗酶液的制备：取诱导后的LB培养液8000r·min-1，离心15min收集菌体，用无菌水洗涤两次后，将菌体重悬于pH6.220mmol·L-1磷酸缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品12,000r·min-1，4℃离心10min取上清即为粗酶液。
2、硫酸铵沉淀：将粗酶液置于冰浴中，在磁力搅拌下向其中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵终浓度为30％，于4度下搅拌过夜。离心，取上清。同样在冰浴条件下于上清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液至终浓度为60％，于4度下搅拌过夜。离心，弃上清，将沉淀溶于适量pH6.2的磷酸缓冲。
3、疏水作用层析：采用美国GE公司的AKTAprime层析系统，PhenylSepharoseFastFlow疏水作用层析柱进行分离，层析柱用pH7.4，1.5M(NH4)2SO4，20mM磷酸缓冲（缓冲A）预平衡，洗脱缓冲液为pH7.4，20mM磷酸缓冲（缓冲B），采用0％-100％缓冲B梯度洗脱，总洗脱时间为130min，将收集的活性蛋白装入透析袋经PEG20000吸水浓缩后再进行透析除盐，4度下透析48h。每隔8h更换一次透析缓冲。透析后蛋白样品在10000rpm冷冻离心5min，收集上清测定蛋白浓度和活性。
4、用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品。SDS-PAGE的胶浓度为12%，先用90V电压进行浓缩电泳，再改为150V进行分离电泳。结果表明构建并表达纯化得到的醇脱氢酶及其突变体蛋白为可溶性表达，且大小均在30kD左右。
参见附图1，醇脱氢酶及其突变体蛋白纯化结果的SDS-PAGE分析。12%SDS_PAGE分析醇脱氢酶及其突变体蛋白经过量表达并纯化后的结果：a)泳道1：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照，泳道2：醇脱氢酶的粗酶液，泳道3：硫酸铵沉淀后的醇脱氢酶蛋白，泳道4：疏水层析后回收的醇脱氢酶蛋白，泳道5：蛋白分子标记，泳道6：疏水层析后回收的突变体S35D蛋白，泳道7：硫酸铵沉淀后的突变体S35D蛋白，泳道8：突变体S35D的粗酶液，泳道9：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照；b)泳道1：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照，泳道2：突变体S35D/R36I的粗酶液，泳道3：硫酸铵沉淀后的突变体S35D/R36I蛋白，泳道4：疏水层析后回收的突变体S35D/R36I蛋白，泳道5：蛋白分子标记，泳道6：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照，泳道7：突变体A34I/S35D/R36I的粗酶液，泳道8：硫酸铵沉淀后的突变体A34I/S35D/R36I蛋白，泳道9：疏水层析后回收的突变体A34I/S35D/R36I蛋白；c)泳道1：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照，泳道2：突变体S13A/S35D/R36I的粗酶液，泳道3：硫酸铵沉淀后的突变体S13A/S35D/R36I蛋白，泳道4：疏水层析后回收的突变体S13A/S35D/R36I蛋白，泳道5：蛋白分子标记，泳道6：疏水层析后回收的突变体S13A/A34I/S35D/R36I蛋白，泳道7：硫酸铵沉淀后的突变体S13A/A34I/S35D/R36I蛋白，泳道8：突变体S13A/A34I/S35D/R36I的粗酶液，泳道9：携有空质粒的E.coliBL21(DE3)诱导表达后的总蛋白作为空对照。
实施例4：醇脱氢酶及其突变酶的活性测定。
测定纯化得到的醇脱氢酶及其突变酶的酶活。酶活测定反应体系包括100mM磷酸钾缓冲液(pH6.2)，1mMNADPH，10mMCOBE，30℃，340nm处测定吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化1μmolNADPH所需要的酶量为一个酶活单位U。蛋白采用Brandford法进行测定。
参见表1，对实施示例三所获得的醇脱氢酶及其突变体纯蛋白进行活性测定。结果表明，突变体蛋白S35D，S35D/R36I，A34I/S35D/R36I,S13A/S35D/R36I,S13A/A34I/S35D/R36I,其辅酶依赖型均发生改变，其中突变体S35D/R36I，A34I/S35D/R36I,S13A/S35D/R36I,S13A/A34I/S35D/R36I的辅酶依赖型发生彻底改变，即严格依赖于NADH；同时突变体S13A/S35D/R36I,S13A/A34I/S35D/R36I的催化活性达到野生型酶的3倍达到36U/mg。
表1醇脱氢酶及其突变体的比活力
实施例5：醇脱氢酶及其突变酶的动力学常数测定。
取适量醇脱氢酶及其突变酶在pH6.2100mmol·L-1磷酸缓冲条件下，分别测定不同底物浓度下酶反应的初始速率r0。以底物浓度[S]的倒数为横坐标，酶反应初始速率r0的倒数为纵坐标作图，拟合为直线。该直线在y轴上的截距等于1/rmax,x轴上的截距等于-1/Km，可求出表观米氏常数Km和最大反应速率rmax。转换数kcat是指每摩尔酶的活性中心每秒转换底物的摩尔数，其计算方法如下：kcat=rmax/[E0]这里[E0]等于总的酶浓度。在计算酶浓度所采用的醇脱氢酶的分子量为25,380Da。测定辅酶的动力学常数时，COBE的浓度为10mM，辅酶的底物浓度范围为0.1mM-2mM，测定底物COBE的动力学常数时，辅酶的浓度为1mM，COBE的浓度范围为1mM-15mM。
参见表2，对实施示例三所获得的醇脱氢酶及其突变体纯蛋白进行动力学常数测定。结果表明，突变酶Ser13Ala/Ala34Ile/Ser35Asp/Arg36Ile显示最小的Kmcofactor值：0.2，即该突变酶与辅酶NADH的亲和力最大；同时kcat/KmCOBE值为330，是野生型ADH的16.5倍。
表2醇脱氢酶及其突变体的动力学常熟测定
实施例6：突变酶S13A/A34I/S35D/R36I与甲酸脱氢酶偶联制备(S)-CHBE。
建立了25ml的生物催化体系：100mM磷酸缓冲液(pH6.2),COBE（610mM),甲酸钠（700mM),醋酸丁酯（12.5ml),TritonX-100(1‰,v/v),菌体（100ml发酵液，AIDI400U，FDH900U），30℃，220rpm培养12h。5M甲酸盐调pH至6.2。反应结束后，混合离心，取有机相进行产物检测。4h时测得产物(S)-CHBE的产量为51g/L，产物的得率为：99.8％，光学纯度e.e.%为100％。
结果参见附图2。
产物的检测方法：
对于水相反应：反应结束后，加入等体积乙酸乙酯，剧烈振荡10min然后放置两小时，8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。
对于水/有机两相反应：反应结束后8000rpm离心10min分离有机层和水层。小心吸取上层乙酸乙酯过有机膜，加入内标，保存测样。
测定COBE和CHBE浓度使用气相7820A(Agilent)，色谱柱为PEG-20M毛细管柱（HP-FFAP；30m×0.32mm×0.25mm；Agilent），内标物为萘。程序为：检测器FID，温度210℃，汽化室温度210℃，柱温150℃，柱头压0.03MPa，氢气0.05MPa，空气0.1MPa，尾吹0.08MPa。用HPLC对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的旋光性进行分析(手性柱ChiralcelOB，4.6×250mm;DaicelChemicalIndustries，日本)，检测条件：流动相为正己烷：正己烷(体积比为9:1)，波长214nm，流量为0.8mL/min，R型和S型CHBE的出峰时间分别为：10.5min和11.6min。产物CHBE的对映体过量值(e.e.%)由下式计算：
式中S为(S)-CHBE的浓度，R为(R)-CHBE的浓度。
实施例7：
SEQIDNo：4、6、8的酶基因的构建同实施例1。
实施例8：
SEQIDNo：4、6、8的突变体的获得如表3所示，构建方法同实施例2。
表3醇脱氢酶突变体序列变化
实施例9：
SEQIDNo4、6、8的酶其突变酶的活性测定方法同实施示例4，结果参见表4～6。
表4醇脱氢酶(SEQIDNo.4)及其突变体的比活力
表5醇脱氢酶(SEQIDNo.6)及其突变体的比活力
表6醇脱氢酶(SEQIDNo.8)及其突变体的比活力
实施例10：
SEQIDNo4、6、8的酶及其突变酶的动力学常数测定方法同实施示例5，结果参见表7～9。
表7醇脱氢酶（SEQIDNo4）及其突变体的动力学常熟测定
表8醇脱氢酶（SEQIDNo6）及其突变体的动力学常熟测定
Claims (9)
1.醇脱氢酶突变体，为野生型醇脱氢酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变：
（1）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸；
（2）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
（3）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
（4）野生型醇脱氢酶的氨基酸序列中第13位丝氨酸突变为丙氨酸，且第34位丙氨酸、缬氨酸、或半胱氨酸突变为异亮氨酸，且第35位丝氨酸突变为天冬氨酸，且第36位精氨酸突变为异亮氨酸；
其中，所述的野生型醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2、4、6或8中的任意一项所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，它是含有编码权利要求1所述的醇脱氢酶突变体的基因序列的质粒。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述的质粒为pET24a(+)。
4.一种重组菌，其特征在于，它是含有权利要求2所述重组质粒的菌株。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述的醇脱氢酶突变体在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性醇中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物为4-氯乙酰乙酸乙酯。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的手性醇为(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
9.根据权利要求6～8中任意一项所述的应用，其特征在于，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，以醇脱氢酶突变体为催化剂，不对称还原反应制备得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯；具体反应条件为：3U/mL的醇脱氢酶突变体与100mM甲酸钠、50g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、6U/mL的甲酸脱氢酶和0.5mM的NAD+，在pH6.5、30℃、200rpm条件下反应12h，得到(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯。
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