CN104531628B - 醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及其应用。该脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。具有上述至少一个突变位点或者保留上述突变位点且与其具有90％以上氨基酸序列同源性的醇脱氢酶突变体，其立体选择性和酶活性大大提高。

Description

醇脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶及酶工程领域，具体而言，涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。

理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directedMutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。

定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。

醇脱氢酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，醇脱氢酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。如一种新的用于艾滋病治疗的非肽类抗逆转病毒蛋白酶抑制剂地瑞那韦(Darunavir)。

目前已知的醇脱氢酶可以作为生物催化剂，一步还原酮类底物，制备得到近乎单一光学纯度的手性中间体(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如催化反应后产生的非对映异构体含量较高、酶催化活性较低等。

因此，仍需要对现有的醇脱氢酶进行改进，以提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性，进而改善现有技术中如立体选择性较低、后处理过程繁琐、生产成本高等问题。

发明内容

本发明旨在提供一种醇脱氢酶突变体及其应用，以提高其催化活性和立体选择性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种醇脱氢酶突变体，该醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

进一步地，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或者醇脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性。

根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种醇脱氢酶突变体。

进一步地，DNA分子的序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17；或者DNA分子的序列与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：17具有95％以上的同源性。

根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分子的序列。

进一步地，重组质粒为pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。

进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种生产醇类化合物的方法，包括醇脱氢酶对酮类化合物进行催化加氢以形成醇类化合物的反应步骤，醇脱氢酶为上述任一种醇脱氢酶突变体。

进一步地，酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

应用本发明的技术方案，通过在SEQ ID NO：9所示的野生型醇脱氢酶的基础上，采用定点饱和突变的方法对醇脱氢酶(HTADH)的基因进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述位点中的至少之一发生突变的醇脱氢酶，或者在保留上述突变位点且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列的醇脱氢酶突变体，立体选择性大幅度提高，酶活提高为醇脱氢酶野生型母本的2～3倍，从而大幅度降低了如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物在工业生产中的成本。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明将酮类化合物还原为醇类化合物的化学反应过程；

图2为本发明实施例中合成(3R,3AS,6AR)-六氢呋喃并[2,3-B]呋喃-3-醇的化学反应方程式；

图3为本发明实施例中合成(S)-3-羟基丁酸乙酯的化学反应方程式；

图4本发明一种优选实施例中醇脱氢酶突变体的蛋白电泳检测结果图；以及

图5示出了本发明的有效突变位点的醇脱氢酶的三维结构模拟图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

由于现有技术中的醇脱氢酶存在催化反应后产生的非对映异构体含量较高、酶催化活性较低而不适合工业化应用的缺陷，为了改善上述缺陷，本发明以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)LLD-R菌株的醇脱氢酶(HTADH)基因(如SEQ ID NO：9所示)为起始基因进行基因突变，通过定向筛选的方法获得酶活性提高的醇脱氢酶突变体。

将醇脱氢酶(HTADH)的氨基酸序列在Swiss-model网站模拟蛋白质的三维结构，然后通过Docking进行底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸(图5)。

本发明使用定点饱和突变技术，以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌LLD-R菌株的醇脱氢酶(HTADH)基因为起始基因进行基因突变，通过定向筛选的方法获得酶活性和立体选择性提高的醇脱氢酶突变体。本发明的醇脱氢酶突变体的突变氨基酸残基位于底物结合位点或与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的的区域(参见图5)，例如T40位，W87位、V194位和R331位，这些氨基酸的改变可能提高了底物结合的特异性，从而使酶的活性得到提高。

上述得到的醇脱氢酶突变体可以通过基因工程手段，将其基因连接到pET-22b(+)以及其它表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的醇脱氢酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为37KD，在30℃，pH6.0条件下，可以一步还原四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮的制备原料得到光学纯度较高的(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇。

在上述研究结果的基础上，本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，该脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

本发明的上述醇脱氢酶突变体通过在SEQ ID NO：9所示的野生型醇脱氢酶的基础上，采用定点饱和突变的方法对醇脱氢酶(HTADH)的基因进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述位点中的至少之一发生突变的醇脱氢酶，或者在保留上述突变位点且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列的醇脱氢酶突变体，立体选择性大幅度提高，酶活提高为醇脱氢酶野生型母本的2～3倍，从而大幅度降低了如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物在工业生产中的成本。

在本发明一种优选的实施例中，上述氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7或者醇脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7具有95％以上的同源性。

在本发明上述优选的实施例中，醇脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7。SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的突变位点为T40S；SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的突变位点为R331A；SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的突变位点为T40S-R331A；SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的突变位点为V194I；SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的突变位点为R331A-W87F；SEQID NO：6所示的氨基酸序列的突变位点为W87F-V194I；SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的突变位点为T40S-W87F-V194I。

具有上述氨基酸序列的醇脱氢酶突变体在制备如R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物时，所获得的目标醇类化合物的ee值大于99％，de值为99％左右。本发明的上述醇脱氢酶突变体在立体选择性或酶催化活性上得到大幅提高，其中，酶活提高为醇脱氢酶母本的2～3倍，从而大幅度降低诸如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇之类的醇类化合物在工业生产中的成本。

本发明中的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的醇脱氢酶的活性。在上述实例中，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7具有95％以上的同源性并具有或编码具有改进的醇脱氢酶活性的氨基酸序列的突变体，本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。

比如，在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，将保留其他位点的氨基酸种类不变的情况下，将第331位的R突变为K的如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。或者在保留SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ IDNO：7所示序列中的突变位点的情况下，剩余氨基酸序列进行简单替换或改变，使得改变或替换后的醇脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列有95％以上同源性。这样的醇脱氢酶突变同样保留了具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的醇脱氢酶突变体的提高的酶催化活性或立体选择性。

在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子能够编码上述任一种醇脱氢酶突变体。本发明的DNA分子所编码的上述任一种醇脱氢酶突变体具有较高的催化活性或较高的立体选择性。

优选地，DNA分子的序列为EQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17。其中SEQ ID NO：11是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第118-120bp的ACT突变为AGT或AGC；SEQ ID NO：12是在SEQ IDNO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第991-993bp的CGT突变为GCT、GCC、GCA或GCG；SEQ IDNO：13是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第118-120bp的ACT突变为AGT或AGC，且第991-993bp的CGT突变为GCT、GCC、GCA或GCG；SEQ ID NO：14是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第580-582bp的GTT突变为ATT、ATC或ATA；SEQ ID NO：15是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第991-993bp的CGT突变为GCT、GCC、GCA或GCG，且第259-261bp的TGG突变为TTT或TTC；SEQ ID NO：16是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第259-261bp的TGG突变为TTT或TTC，且580-582bp的GTG突变为ATT、ATC或ATA；EQ ID NO：17是在SEQ ID NO：10所示的醇脱氢酶基因序列中第118-120bp的ACT突变为AGT或AGC，第259-261bp的TGG突变为TTT或TTC，且580-582bp的GTT突变为ATT、ATC或ATA。

具有上述核苷酸序列改变的DNA分子能够编码具有上述改进的醇脱氢酶活性或立体选择性，利于降低诸如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇之类的醇类化合物在工业生产中的成本。更优选地，该DNA分子的序列与EQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或者SEQ ID NO：17具有95％以上的同源性，上述优选实施例中，具有上述序列的DNA分子能够编码酶催化活性和立体选择性更高的醇脱氢酶，其酶活性比现有技术中的醇脱氢酶的活性高2倍，甚至3倍，能够大大降低如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物的工业生产成本。

本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。

在本发明又一种典型的实施方式中，还提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分子的序列。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。

虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。

本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)，pET-3a(+)，pET-3d(+)，pET-11a(+)，pET-12a(+)，pET-14b(+)，pET-15b(+)，pET-16b(+)，pET-17b(+)，pET-19b(+)，pET-20b(+)，pET-21a(+)，pET-23a(+)，pET-23b(+)，pET-24a(+)，pET-25b(+)，pET-26b(+)，pET-27b(+)，pET-28a(+)，pET-29a(+)，pET-30a(+)，pET-31b(+)，pET-32a(+)，pET-35b(+)，pET-38b(+)，pET-39b(+)，pET-40b(+)，pET-41a(+)，pET-41b(+)，pET-42a(+)，pET-43a(+)，pET-43b(+)，pET-44a(+)，pET-49b(+)，pQE2，pQE9，pQE30，pQE31，pQE32，pQE40，pQE70，pQE80，pRSET-A，pRSET-B，pRSET-C，pGEX-5X-1，pGEX-6p-1，pGEX-6p-2，pBV220，pBV221，pBV222，pTrc99A，pTwin1，pEZZ18，pKK232-18，pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。

在本发明再一种典型的实施方式中，还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

在本发明一种典型的实施方式中，还提供了一种生产如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物的方法，包括醇脱氢酶对酮类化合物进行催化加氢以形成醇类化合物的反应步骤，其中，醇脱氢酶为上述任一种醇脱氢酶突变体。由于本发明的上述醇脱氢酶具有更高的酶催化活性和高度立体选择性，因而利用本发明的醇脱氢酶突变体制备的如(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇等醇类化合物不仅能够降低生产成本，而且所获得的醇类化合物的ee值大于99％，de值为99％左右。

在本发明中，优选酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。当以通式I所示原料进行催化反应时，其化学反应过程如图1所示，将通式I所示的酮类物质还原为醇类物质。

更优选，当上述方法中所制备的醇类化合物为(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇时，可以采用市场上商业化的原料或者容易制备的酮类化合物作为原料来进行制备。

本发明的上述方法中，醇脱氢酶与现有技术的醇脱氢酶相比，具有催化活性增加、底物谱变广、立体选择性增加或底物特异性增加的优点，因而能够催化上述更加广泛的底物，且催化活性较高。在本发明一个优选的实施例中，本发明的突变体在(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇化合物转化反应中，其醇脱氢酶突变体的用量仅为出发基因编码的醇脱氢酶用量的50％，适用于工业应用。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。

实施例1：

来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)LLD-R菌株的醇脱氢酶(HTADH)基因(SEQ ID NO：9)的定点饱和突变。

将醇脱氢酶(HTADH)的氨基酸序列在Swiss-model网站模拟蛋白质的三维结构，然后通过Docking进行底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸。

根据突变氨基酸及其两侧的碱基序列(突变氨基酸请见表1中的突变位点)，用Primmer5.0设计相应的突变引物(表1)。以含醇脱氢酶基因的pET22b(+)表达载体(购买于Novagen，产品编号69744)为模版，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DPnⅠ消化除去母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。

表1：点饱和突变引物序列

实施例2：醇脱氢酶突变体的克隆与表达

为了便于醇脱氢酶突变体的表达以及鉴定，在其基因的5’和3’末端设计了兼容的限制性酶切位点。可以采用NdeⅠ和XhoⅠ分别将目的基因和pET-22b(+)(其他可在大肠杆菌中表达蛋白质的表达质粒也可使用)分别同时进行酶切，酶切后的目的基因和质粒的较大片段用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。

挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体命名为pET22b(+)-R-M并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。挑取上述培养平板上长出的单菌落并接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用菌落PCR进行鉴定，将含有正确的表达载体的大肠杆菌进行后续的诱导表达。将上述菌液转接于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2～1.0mM，在18～25℃下进行诱导表达10～16h后，取出菌液，6000g离心10min收集菌体，于-20℃冻存备用。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液和沉淀，上清液用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测。表达的醇脱氢酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，具体参见图4，其中，A代表T40S；B代表R331A；M代表标准分子量蛋白marker：由上到下分别为97KDa、66KDa、43KDa、31KDa、14KDa；1、2、3、4、5和6分别代表T40S-R331A、V194I、R331A-W87F、W87F-V194I、T40S-W87F-V194I和野生型母本。

实施例3：醇脱氢酶突变体的筛选

将实施例1中的突变体接种于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min收集上清液，获得醇脱氢酶粗酶液，用于活性检测。向10ml反应瓶中加入50.0mg主原料(四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮，5.0mg NAD+，50.0mg甲酸铵，10mg辅酶甲酸脱氢酶和1.5ml醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h后，将反应体系用二氯甲烷：异丙醇＝1：1萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

选取催化活性优于野生型母本的突变体进行测序，分析突变位点，并进行放大培养，复测催化活性确定突变体T40S(SEQ ID NO：1)、R331A(SEQ ID NO：2)、T40S-R331A(SEQID NO：3)、V194I(SEQ ID NO：4)、R331A-W87F(SEQ ID NO：5)、W87F-V194I(SEQ ID NO：6)、T40S-W87F-V194I(SEQ ID NO：7)的催化活性比母本显著提高，筛选结果如表2所示。

表2.醇脱氢酶野生型母本与突变体制备(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇活性比较

SEQ ID NO：	位点	酶量a	转化	DE％	EE％
						1	T40S	2wt	42.7％	99.48％	99.52％
2	R331A	6wt	34.3％	99.64％	95.81％
						3	T40S-R331A	3wt	43.6％	99.64％	99.88％
4	V194I	3wt	46.5％	99.20％	99.48％
						5	R331A-W87F	6wt	50.5％	99.52％	99.74％
6	W87F-V194I	6wt	33.1％	99.48％	99.48％
						7	T40S-W87F-V194I	3wt	52.9％	98.76％	97.18％
8	野生型母本	6wt	42.4％	99.26％	94.06％

注：a指转化1g底物所需各醇脱氢酶突变体重组细胞的湿重；1wt指转化1g主原料需要1g醇脱氢酶突变体重组湿细胞。

实施例4：

醇脱氢酶突变体T40S在(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇制备中的应用(具体反应式见图2)。

向250ml反应瓶中加入1g主原料四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮，100mg NAD+，1g甲酸铵，100mg辅酶甲酸脱氢酶和15ml 20％(w/v)的醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h后，将反应体系用等体积的二氯甲烷：异丙醇＝1：1进行萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

产品(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇：体系中(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇的比例为48～50％，ee值为于99.6％，de值为99.7％。

鉴于其他6个醇脱氢酶突变体对主原料四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮的催化活性和反应方法类似，得到的结果如上表2所示，从上表2可以看出，本发明的上述醇脱氢酶突变体相比野生型母本，分别利用酶量、底物转化率、DE以及EE方面都有提高。尤其是在第40位的T突变为S的突变体，酶用量减少了2/3，转化率、DE以及EE方面都有较大提高。R331A-W87F和T40S-W87F-V194I突变体在酶用量不增加的情况下，底物转化率提高了8％～10％。上述各个实施例的突变体在EE方面都相比野生型母本的94.06％，提高到了96％以上。

实施例5：

SEQ ID NO：20所示醇脱氢酶突变体T40S-V194I在(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇制备中的应用

向250ml反应瓶中加入1g主原料四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮，100mg NAD+，1g甲酸铵，100mg辅酶甲酸脱氢酶和20ml 20％(w/v)的醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h后，将反应体系用等体积的二氯甲烷：异丙醇＝1：1进行萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

产品(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇：体系中(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇的比例为47～50％，ee值为99.1％，de值为99.4％。

实施例6：

醇脱氢酶突变体R331K在(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇制备中的应用

向250ml反应瓶中加入1g主原料四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮，100mg NAD+，1g甲酸铵，100mg辅酶甲酸脱氢酶和25ml 20％(w/v)的醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h后，将反应体系用等体积的二氯甲烷：异丙醇＝1：1进行萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

产品(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇：体系中(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇的比例为35～40％，ee值为94.1％，de值为99.0％。

实施例7：

与SEQ NO:7所示氨基酸序列的同源性为92.6％醇脱氢酶突变体在(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇制备中的应用

向250ml反应瓶中加入1g主原料四氢呋喃并[2，3-b]呋喃-3(2H)-酮，100mg NAD+，1g甲酸铵，100mg辅酶甲酸脱氢酶和40ml 20％(w/v)的醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温17h后，将反应体系用等体积的二氯甲烷：异丙醇＝1：1进行萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

产品(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇：体系中(3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇的比例为30～40％，ee值为97.5％，de值为99.5％。

实施例8：

醇脱氢酶突变体T40S在(S)-3-羟基丁酸乙酯制备中的应用(具体反应式见图3)

向250ml反应瓶中加入1g主原料乙酸乙酰乙酯，100mg NAD+，1g甲酸铵，100mg辅酶甲酸脱氢酶和30ml 20％(w/v)的醇脱氢酶粗酶液，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温20h后，将反应体系用等体积的二氯甲烷进行萃取，静置分液，取下层有机相进行GC分析。

产品(S)-3-羟基丁酸乙酯的转化率为86～90％，ee值大于99％。

从以上的描述中可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过采用定点饱和突变的方法对醇脱氢酶(HTADH)的基因进行突变，再通过定向筛选的方法得到酶立体选择性大幅度提高的醇脱氢酶突变体，酶活提高为醇脱氢酶母本的2～3倍，从而大幅度降低3R，3AS，6AR)-六氢呋喃并[2，3-B]呋喃-3-醇化合物工业生产中的成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ IDNO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述突变为氨基酸序列第40位的突变，还包括如下至少1个可选的突变：第87位、第194位和第331位，且所述第40位的T突变为S；第87位的W突变为F；第194位的V突变为I；第331位的R突变为A。

2.根据权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。

3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2中所述的醇脱氢酶突变体。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：17。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3或4所述的DNA分子的序列。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母。

10.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α细胞。

11.一种生产醇类化合物的方法，包括醇脱氢酶对酮类化合物进行催化加氢以形成醇类化合物的反应步骤，其特征在于，所述醇脱氢酶为权利要求1或2所述的醇脱氢酶突变体。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为通式I所示的酮类化合物：

其中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。