CN105441404A - ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，ω-转氨酶突变体氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示。核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示。本发明还公开了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。本发明利用温度因子(B-factor)结合能量优化策略对野生型ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，制得所述ω-转氨酶突变体。本发明筛选得到的突变体热稳定性优于野生型转氨酶。

Description

ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法。

背景技术

酶的稳定进化方法一直是蛋白质工程中极为重要的研究领域之一。近年来，计算机辅助的蛋白质稳定化设计取得突破式的进展。与传统随机突变进化方法相比，以能量计算为基础的计算辅助设计方法可以提高氨基酸突变的有效性，减少突变数目，降低筛选工作量，极大地提高设计成功率。对酶分子的热稳定性改造而言，目前已有多种设计方法应用于识别酶的不稳定区域，并已在一些酶的热稳定性改造中得到了成功应用。温度因子(B-factor)是晶体学中的一个重要参数，反映的是晶体中的各原子受热运动的影响程度，原子在热运动作用下的形变越大，温度因子值就越高。对蛋白质而言，如果某一氨基酸残基的B-factor值越高，则表明该氨基酸残基所在部位的结构就越不稳定。因此可以分析蛋白质结构中各个氨基酸残基的B-factor值，从而识别出需要改造的、不利于保持蛋白质稳定性的区域。

定点突变(site-directedmutagenesis或site-specificmutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对的技术，通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构和功能的影响。在酶的理性设计中，研究者采用定点突变技术筛选得到热稳定、酶活力提高的突变酶。公告号为CN102660515B的专利文献公开了一种酶活性提高的谷氨酰胺转氨酶。该发明以谷氨酰胺转胺酶在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

转氨酶能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，具有较高区域选择性和立体选择性。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-ATs)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。来自于土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶能催化(R)-α-甲基苄胺生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。实验表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其耐热性有待进一步提高。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了ω-转氨酶突变体，通过定点突变替换掉热稳定性差的氨基酸残基，获得比野生型转氨酶具有更好热稳定性的ω-转氨酶突变体，提高ω-转氨酶在工业上的应用价值。

ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示。

第一种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为苯丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(T130F)的半失活温度为40.9℃，比野生型酶提高2.9℃；ω-转氨酶突变体(T130F)在40℃下的半衰期为13.2min，比野生型酶延长6.3min。

第二种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为甲硫氨酸，ω-转氨酶突变体(T130M)的半失活温度为40.7℃，比野生型酶提高2.7℃；ω-转氨酶突变体(T130M)在40℃下的半衰期为10.8min，比野生型酶延长3.9min。

第三种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸，ω-转氨酶突变体(T130A)的半失活温度为39.1℃，比野生型酶提高1.1℃；ω-转氨酶突变体(E133F)在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型酶延长3.5min。

第四种ω-转氨酶突变体的第133位氨基酸由谷氨酸突变为苯丙氨酸，ω-转氨酶突变体(E133F)的半失活温度为39.6℃，比野生型酶提高1.6℃；ω-转氨酶突变体(E133F)在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型酶延长3.5min。

第五种ω-转氨酶突变体的第133位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺，ω-转氨酶突变体(E133Q)的半失活温度为39.2℃，比野生型酶提高1.2℃；ω-转氨酶突变体(E133Q)在40℃下的半衰期为9.2min，比野生型酶延长2.3min。

本发明还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。

本发明提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因，其核苷酸分别为如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示。

五个突变体的核苷酸序列的变化情况依次为：将编码野生型酶第130位氨基酸的密码子ACT分别突变为TTT、ATG和GCG，第133位氨基酸的密码子GAA分别突变为TTT和ATG。

本发明还提供了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。

所述表达盒的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，ω-转氨酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。

所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a(+)。

所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明还提供了一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得野生型酶中各个氨基酸残基的B-factor值，确定需要突变的氨基酸残基；

(2)计算酶突变前后的折叠自由能之差，预测可行的突变；

(3)根据预测结果，设计定点突变引物，以野生型酶为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；

(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的酶突变体。

该方法可有效增加突变成功的概率，降低筛选工作量，提高实验效率。采用该方法获得的突变体比野生转氨酶具有更好的热稳定性，从而证明了本发明突变位点预测筛选方案的可行性。作为优选，计算折叠自由能的程序为FoldX(http://foldxsuite.crg.eu/)。

作为优选，所述野生型酶为来自土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶。

本发明分析土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶的晶体结构数据，G129、T130、R131、E133、D134的B-factor值较高，表明这些氨基酸残基的存在不利于保持蛋白质稳定性。

折叠自由能(ΔG_f)是蛋白质热力学中最重要的参数之一，采用FoldX软件计算突变酶与野生型转氨酶之间的折叠自由能之差(ΔΔG_f)，ΔΔG_f为负时，说明该突变体较野生型稳定，为可行的突变。根据软件计算结果确定18种突变方案，分别为T130F、T130M、T130A、T130L、T130V、T130I、T130C、T130K、T130R、R131P、R131F、E133L、E133K、E133Q、E133W、E133Y、E133F、D134L。

对ΔΔG_f为负的18个突变体设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板进行PCR扩增，转化至宿主细胞，进行突变酶的表达、纯化；通过测定半失活温度(T₅₀ ¹⁰)和半衰期(t_1/2)筛选热稳定性提高的突变酶。通过实验验证表明，T130F、T130M、T130A、E133F、E133Q这五种突变体的热稳定性显著提高。

作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.1的ω-转氨酶突变体的定点突变引物为：

T130F-F：5’-TAAAGGGGTGCGAGGATTTCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130F-R：5’-TATATCTTCCGGACGAAATCCTCGCACCCCTTTAA-3’。

作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.3的ω-转氨酶突变体的定点突变引物为：

T130M-F：5’-AAGGGGTGCGAGGAATGCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130M-R：5’-TATATCTTCCGGACGCATTCCTCGCACCCCTTT-3’。

作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.5的ω-转氨酶突变体的定点突变引物为：

T130A-F：5’-AAAGGGGTGCGAGGAGCGCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130A-R：5’-TATATCTTCCGGACGCGCTCCTCGCACCCCTTTA-3’。

作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.7的ω-转氨酶突变体的定点突变引物为：

E133F-F：5’-TGCGAGGAACTCGTCCGTTTGATATAGTGAACAACCTG-3’；

E133F-R：5’-AGGTTGTTCACTATATCAAACGGACGAGTTCCTCGCAC-3’。

作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO.9的ω-转氨酶突变体的定点突变引物为：

E133Q-F：5’-TGCGAGGAACTCGTCCGCAGGATATAGTGAACAACCTG-3’；

E133Q-R：5’-AGGTTGTTCACTATATCCTGCGGACGAGTTCCTCGCAC-3’。

本发明具备的有益效果：本发明利用温度因子(B-factor)结合能量优化策略对ω-转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，有效增加突变成功的概率，降低筛选工作量，提高实验效率及可行性，筛选得到的突变体热稳定性优于野生型转氨酶。

附图说明

图1为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱。

图2为Aspergillusterreusω-转氨酶三维结构中高B-factor值的氨基酸位点(129-133)，氨基酸骨架中较粗的部位代表该区域的氨基酸位点B-factor值较高，构象就越不稳定或柔性越强。

图3为定点突变原理示意图。

图4突变酶和野生酶的T₅₀ ¹⁰，其中A为野生型，B为ω-转氨酶突变体(T130F)，C为ω-转氨酶突变体(T130M)，D为ω-转氨酶突变体(T130A)，E为ω-转氨酶突变体(E133F)，F为ω-转氨酶突变体(E133Q)。

图5突变酶和野生酶的半衰期t_1/2，其中A为野生型，B为ω-转氨酶突变体(T130F)，C为ω-转氨酶突变体(T130M)，D为ω-转氨酶突变体(T130A)，E为ω-转氨酶突变体(E133F)，F为ω-转氨酶突变体(E133Q)。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明实施中未注明的实验方法，如感受态细胞制备、转化以及LB培养基配制等参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂译，科学出版社，2002)中的方法进行。

一、突变体构建

根据NCBI数据库中AspergillusterreusNIH2624的ω-转氨酶基因序列(Genbank:XM_001209325)以及密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中的Escherichiacoli密码子使用频率分布表，分析ω-转氨酶的密码子使用情况。密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-opt-TA基因)，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，其编码的蛋白质共325个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。本发明中经密码子优化ω-转氨酶基因(ω-TA基因)委托通用生物系统(安徽)有限公司全基因合成进行全基因合成，基因合成服务中使用pET-28a质粒作为克隆载体，酶切位点分别为NdeI和HindIII。构建的重组质粒pET-28a-ω-opt-TA(图1)转入E.coliBL21(DE3)，获得重组菌。

DpnI酶购自ThermoScientific公司，PrimeStarMaxDNA聚合酶购自TaKaRa公司。寡核苷酸序列委托南京金斯瑞生物有限公司合成。质粒提取、胶回收试剂盒以及PCR清洁试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪公司。纯化用Ni柱介质、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、DNA和蛋白质Marker购自生工生物工程(上海)有限公司。种子培养基为LB培养基，表达培养基为LB培养基，均含有50μg/mL卡那霉素。

本发明根据ω-转氨酶的晶体结构数据获得野生型酶中各个氨基酸残基的B-factor值，确定需要突变的氨基酸残基，利用FoldX确定该位点氨基酸突变前后的折叠自由能之差，通过计算方法预测可行的突变。根据ω-转氨酶的晶体结构(图2)表明，G129、T130、R131、P132、E133、D134的B-factor值较高，分别为39.0、31.8、62.2、44.3、51.6、34.6，突变后容易提高稳定性。

折叠自由能(ΔG_f)是蛋白质热力学中最重要的参数之一，选择G129、T130、R131、P132、E133、D134作为突变位点，采用FoldX软件计算突变酶与野生酶之间的折叠自由能之差(ΔΔG_f)，计算得到的ΔΔG_f为负时，表明突变体的热稳定性优于野生酶，计算预测的热稳定性提高的突变体结果如下表1所示。。

表1、利用FoldX计算折叠自由能(ΔΔG_f)为负的ω-转氨酶突变体

根据表1计算预测的结果，采用定点突变的方法构建ΔΔG_f为负的18个突变体，定点突变原理的示意图，如图3所示。以pET28a(+)-ω-aminotransferase为模板质粒，构建上述18个突变体，定点突变引物如下表2所示(SEQIDNO.13～46)。

表2、ω-aminotransferase中定点突变引物的设计

以pET-28a-ω-opt-TA质粒为模板，进行定点PCR扩增，构建上述18个突变体，定点突变原理如图4所示。PCR扩增体系为50μL，包含：PrimeSTARMaxDNAPolymerase25μL，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(100ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。

PCR扩增程序为：98℃变性1min后，进入扩增循环，即98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环30次，最后再72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。

所得定点PCR反应产物用DpnI在37℃下酶解2h以消除父本模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞E.coliDH5α，转化液涂布含有卡那霉素(50μg/μL)的LB固体平板得到定点突变文库，于37℃培养12h。

二、突变酶的表达和纯化

从定点突变文库中随机挑取1～3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至通用生物系统(安徽)有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变，测序引物为T7通用引物。引入预期突变的质粒转化入E.coliBL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mLLB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的100mL的LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH7.0)中，37℃、180r/min培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃、150r/min条件下诱导培养18h后收集菌体。

将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，后用10％发酵液体积的破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300W，工作3s，间歇6s，超声8分钟。破胞液于12000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有的ω-转氨酶粗酶液。

采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。

所用缓冲液配制如下：

破胞缓冲液(20mM洗脱缓冲液)：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0；50mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH8.0；100mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，100mM咪唑，pH8.0；250mM洗脱缓冲液:50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH8.0。

三、突变酶活力的测定

以(R)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α甲基苄胺，2.5mM丙酮酸)，20μL纯酶液(约1mg/mL)。利用酶标仪检测波长245nm处OD值随时间的变化曲线。

酶活计算方法如下：

$U/mg=\frac{mAbs/\min \·100\mathrm{\μ}L}{1000\·0.6cm\·\mathrm{\ϵ}\·mgofenzyme}=\frac{mAbs/\min }{6\·\mathrm{\ϵ}\·mgofenzyme}$

ε为12,000M^-1·cm^-1。

四、突变酶热稳定性考察

半失活温度(T₅₀ ¹⁰)：酶在特定温度下孵育一定时间后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。分别将野生酶和突变酶在25～55℃水浴中保温10min，保温结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，计算半失活温度(T₅₀ ¹⁰)。

对18个突变体筛选实验表明，T130F、T130M、T130A、E133F、E133Q的T₅₀ ¹⁰分别为40.9℃、40.7℃、39.1℃、39.6℃、39.2℃，比野生型酶提高2.9℃、2.7℃、1.1℃、1.6℃、1.2℃(图4)。

半衰期(t_1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。将父本酶和突变酶在40℃下分别保温2、4、6、8、10、15、20、25、30、35min，保温结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以时间为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，作图可以计算出酶活力降低为50％时所对应的保温时间(t_1/2)。

半衰期(t_1/2)实验结果表明，T130F、T130M、T130A、E133F、E133Q的t_1/2分别为13.2min、10.8min、10.4min、10.4min、9.2min，比野生型酶延长6.3min、3.9min、3.5min、3.5min、2.3min(图5)。

由此说明，突变体T130F、T130M、T130A、E133F、E133Q增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。

Claims (10)

1.ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.4或SEQIDNO.6或SEQIDNO.8或SEQIDNO.10所示。

2.编码权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3或SEQIDNO.5或SEQIDNO.7或SEQIDNO.9所示。

4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。

6.一种包含权利要求4所述表达盒的重组质粒。

7.一种包含权利要求6所述重组质粒的转化子。

8.如权利要求7所述的转化子，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌细胞。

9.一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得野生型酶中各个氨基酸残基的B-factor值，确定需要突变的氨基酸残基；

(2)计算酶突变前后的折叠自由能之差，预测可行的突变；

(3)根据预测结果，设计定点突变引物，以野生型酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；

(4)从定点突变文库中筛选获得热稳定性提高的酶突变体。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述野生型酶为分离自土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶；

所述定点突变引物为：

T130F-F：5’-TAAAGGGGTGCGAGGATTTCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130F-R：5’-TATATCTTCCGGACGAAATCCTCGCACCCCTTTAA-3’；

或

T130M-F：5’-AAGGGGTGCGAGGAATGCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130M-R：5’-TATATCTTCCGGACGCATTCCTCGCACCCCTTT-3’；

或

T130A-F：5’-AAAGGGGTGCGAGGAGCGCGTCCGGAAGATATAG-3’；

T130A-R：5’-TATATCTTCCGGACGCGCTCCTCGCACCCCTTTA-3’；

或

E133F-F：TGCGAGGAACTCGTCCGTTTGATATAGTGAACAACCTG；

E133F-R：AGGTTGTTCACTATATCAAACGGACGAGTTCCTCGCAC；

或

E133Q-F：TGCGAGGAACTCGTCCGCAGGATATAGTGAACAACCTG；

E133Q-R：AGGTTGTTCACTATATCCTGCGGACGAGTTCCTCGCAC。