CN105950581A - 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种引入二硫键的ω‑转氨酶突变体及其应用，所述ω‑转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明ω‑转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω‑转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω‑转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。

Description

一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用。

背景技术

转氨酶能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，具有较高区域选择性和立体选择性。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-ATs)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。来自于土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶能催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。ω-转氨酶的催化过程如下所示：

实验表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其热稳定性有待进一步提高。

授权公告号为CN103820404B的中国发明专利公开了一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法，利用定向进化技术对鱼腥藻脂肪氧合酶分子进行定向改造，经多轮易错PCR和DNA Shuffling，获得了酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，酶活力为21420U/mL，比野生型提高了2.17倍，其在50℃的半衰期t_1/2提高了1.9倍。

授权公告号为CN102660515B的中国发明专利公开了一种酶活性提高的谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase，MTG)。该发明以MTG在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。

授权公告号为CN102876650B的中国发明专利公开了一种具有高比活和高热稳定性普鲁兰酶突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。该发明通过定点突变提高了普鲁兰酶比活力和热稳定性，提供了能够使来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶催化比活力及热稳定性都得到提高的突变方案。所述普鲁兰酶突变体，至少以下性质之一发生改变：1)最适反应温度提高；2)在pH4.0-5.0热稳定性提高；3)在pH4.0-5.0比活力提高。

二硫键(Disulfide bond)是2个巯基被氧化所形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。在蛋白质中，两个半胱氨酸形成二硫键，能够固定蛋白质的三级结构，降低蛋白质解折叠熵，提高蛋白质的稳定性。根据蛋白质的空间结构，结合二硫键形成所需的键长、键角信息，通过计算生物学的方法，可以较准确的预测蛋白质中可能形成二硫键的位点。温度因子(B-factor)是晶体学中的一个重要参数，反映的是晶体中的各原子受热运动的影响程度，如果某一氨基酸残基的B-factor值越高，则表明该氨基酸残基所在部位的结构就越不稳定。通过在蛋白质的不稳定性区域引入额外的二硫键更易于提高蛋白质的稳定性。

发明内容

本发明通过在野生型ω-转氨酶中引入一对额外的二硫键，获得了一个具有更好热稳定性的ω-转氨酶突变体。

本发明首先根据ω-转氨酶(来自土曲霉(Aspergillus terreus))的三维结构模型并分析蛋白质结构中B-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件Disulfide by Design(DbD，http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2)以及Disulfide Bonds inProteins(MODIP，http://caps.ncbs.res.in/dsdbase/modip.html)对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；然后结合相应位点B-factor值，选择该蛋白的不稳定区域引入二硫键，设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点突变，PCR扩增、纯化后，筛选得到含有一个半胱氨酸的突变体，再以该突变体为模板，进行定点突变得到同时含有两个半胱氨酸的突变体，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；最后从所述定点突变文库中筛选效果较好的ω-转氨酶突变体。

以上述方法筛选获得了一种热稳定性较高的ω-转氨酶突变体，由土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得。两个突变的半胱氨酸能够在成熟的ω-转氨酶突变体蛋白中形成二硫键。

所述的ω-转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。

所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。原编码精氨酸的密码子CGT突变为编码半胱氨酸的TGC，原编码天冬氨酸的密码子GAT突变为编码半胱氨酸的TGC。

本发明还提供了包含所述基因的表达盒。

本发明还提供了包含所述基因的重组载体。重组载体的启动子可以为常用的T7启动子、Lac启动子或araBAD启动子。重组载体所选用的原始载体可以是常用的用于蛋白表达的载体，比如pET28a。

本发明还提供了包含所述基因的基因工程菌。

本发明还提供了包含所述重组载体的基因工程菌。

可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上以获得稳定表达所述ω-转氨酶突变体蛋白的重组基因工程菌，也可以是通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供了所述ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。手性选择性为(R)型。

本发明ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。

附图说明

图1为ω-转氨酶引入二硫键后的局部三维结构示意图；

图2为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱示意图；

图3为酶活检测结果图；

图4为半失活温度检测结果图，其中，图A为野生型ω-转氨酶，图B为本发明ω-转氨酶突变体；

图5为酶活半衰期检测结果图，其中，图A为野生型ω-转氨酶，图B为本发明ω-转氨酶突变体；

图6为本发明ω-转氨酶突变体酶活最适温度检测结果图。

具体实施方式

实施例1

首先将土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶的PDB文件(PDB ID：4CE5)上传至Disulfideby Design(DbD，http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2)以及Disulfide Bonds in Proteins(MODIP，http://caps.ncbs.res.in/dsdbase/modip.html)网址，上述软件设计二硫键时充分考虑了两个半胱氨酸的C-S键旋转角度、C^α之间的距离以及C^β之间的距离，利用生物信息学计算分析键长、键角以及能量来预测可行的引入二硫键的位点共有8个，分别为R131C与D134C、N25C与A28C、D113C与Y146C、E213C与V234C、A44C与L48C、M150C与M280C、A32C与F142C、R161C与Y201C。根据ω-转氨酶的晶体结构表明，G129-D134区域氨基酸残基的温度因子(B-factor)值较高，对蛋白质而言，如果某一氨基酸残基的B-factor值越高，则表明该氨基酸残基所在部位的结构就越不稳定。因此，在G129-D134区域(该区域三维结构如图1所示)引入额外二硫键更容易提高该蛋白的稳定性。所以最终确定R131C与D134C两点引入二硫键。

实施例2

采用定点突变PCR方法依次对ω-转氨酶基因位点的R131C和D134C进行定点突变，定点突变的引物如表1所示，从而得到同时含有两个半胱氨酸的突变体。该突变体经过测序验证其核苷酸序列在第497及499位密码子处发生突变，由131、134位点编码精氨酸(R，Arg)、天冬氨酸(D，Asp)的密码子CGT、GAT都突变为编码半胱氨酸(C，Cys)的密码子TGC。

表1定点突变引物。

引物名称	序列5’→3’
		R131C-F	GGTGCGAGGAACTTGCCCGGAAGATATAGTG
R131C-R	CTATATCTTCCGGGCAAGTTCCTCGCACCCC
		D134C-F	GGAACTTGCCCGGAATGCATAGTGAACAACCTGTAC
D134C-R	ACAGGTTGTTCACTATGCATTCCGGGCAAGTTCCTC

以含有野生型ω-转氨酶基因的pET28a-ω-opt-TA质粒为模板，进行131位的定点PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，包含：Prime STAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)25μL，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(100ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。

PCR扩增程序为：98℃变性1min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环30次；72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测正确。

所得定点PCR反应产物用Dpn I在37℃下酶解2h以消除野生模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞E.coli DH5α，转化液涂布含有卡那霉素(50μg/μL)的LB固体平板得到定点突变文库，于37℃培养12h得到带突变的克隆，提取其质粒并测序，测序结果显示为131位的精氨酸突变为半胱氨酸后，再以该突变体为模板进行134位定点突变，突变方法与131位相同，从而得到131位点和134位点都突变为半胱氨酸的突变体。经测序验证正确，将最后所得质粒命名为pET28a(+)-ω-AT，该质粒图谱如图2所示。

实施例3

将实施例2中测序正确的带有双突变ω-转氨酶突变体基因的质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的100mL的LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH 7.0)中，37℃、180r/min培养至OD₆₀₀值为0.4～0.6时，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃、150r/min条件下诱导培养18h后收集菌体。

将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，用破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300W，工作3s，间歇6s，超声8min。破胞液于12000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有ω-转氨酶突变体的粗酶液。

采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯的ω-转氨酶突变体蛋白。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。

所用缓冲液配制如下：

破胞缓冲液/20mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0；

50mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH8.0；

100mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，100mM咪唑，pH8.0；

250mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH8.0。

实施例4

对实施例3纯化所得的ω-转氨酶突变体蛋白进行酶活检测，同时以野生型ω-转氨酶作为对比，酶活检测方法如下：以(R)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶液(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α甲基苄胺，2.5mM丙酮酸)，20μL纯酶液(约1mg/mL)。利用酶标仪检测波长245nm处OD值随时间的变化曲线，结果如图3所示，实验结果表明ω-转氨酶突变体的活性提高到野生型的近2倍。

酶活计算方法如下：

$U=\frac{(A_1-A_0)/t}{L\×\mathrm{\ϵ}\×M}\×V$

其中，U为酶活，以每mg酶的量表示；A₁为终点时间的吸光值；A₀为起始时间的吸光值；t为时间，单位为min；V为加样体积，一般为200μL；L为光的路径长度，为0.6cm；ε为常数，值为12000mol^-1·L·cm^-1；M为酶量，单位为mg。

实施例5

半失活温度(T₅₀ ¹⁰)是指酶在特定温度下孵育一定时间后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。分别将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶在25～60℃水浴中保温10min，保温结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，计算半失活温度(T₅₀ ¹⁰)。结果如图4所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体的T₅₀ ¹⁰为39.6℃，比野生型酶提高1.6℃。

半衰期(t_1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。将野生型ω-转氨酶和突变体ω-转氨酶在40℃下分别保温2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50min，保温结束后迅速放置在冰上冷却5min，然后测定酶的残余比活力。结果如图5所示，实验结果表明，ω-转氨酶突变体的t_1/2为10.4min，比野生型酶延长3.5min。由此说明，该突变体增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。

实施例6

以(R)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α甲基苄胺，2.5mM丙酮酸)，加入20μL纯酶液(约0.3mg/mL)后(并做三组平行对照)，放入不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)的恒温混匀仪中进行反应(400r/min)，3min后放入100℃的水浴中煮沸10min，最后在冰上放置10min后，利用酶标仪检测波长245nm处的OD值。结果如图6所示，野生型ω-转氨酶和ω-转氨酶突变体(R131C/D134C)最适反应温度均为45℃。

Claims (8)

1.一种ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。

3.如权利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含如权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.包含如权利要求2或3所述基因的重组载体。

6.包含如权利要求2或3所述基因的基因工程菌。

7.包含如权利要求5所述重组载体的基因工程菌。

8.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。