CN104059901A

CN104059901A - 一种热稳定性和分泌效率提高的蔗糖异构酶突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN104059901A
Application number: CN201410201468.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 程胜; 段绪果
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2014-09-24

Abstract

本发明公开了两种普城沙雷氏杆菌(Serratia plymuthica)蔗糖异构酶突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供了一种能使蔗糖异构酶热稳定性及分泌效率均得到提高的突变方案。通过对蔗糖异构酶晶体结构中B因子最高的氨基酸进行定点突变，即将蔗糖异构酶576位置处的K突变成P或D来提高蔗糖异构酶的热稳定性和分泌效率。本发明得到的两种突变体，至少以下性质之一发生改变：1)在pH6.0，40℃和45℃条件下的热稳定性提高；2)所需诱导剂IPTG的浓度大大降低，同时重组菌发酵后的胞外分泌效率显著提高。K576P和K576D两种突变体比天然蔗糖异构酶更适用于工业生产制备及应用。

Description

一种热稳定性和分泌效率提高的蔗糖异构酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种蔗糖异构酶的突变体及其制备方法，特别是利用蛋白质工程的定点突变方法来提高蔗糖异构酶的热稳定性和分泌效率的技术，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

蔗糖异构酶(EC5.4.99.11)，又称异麦芽酮糖合酶，蔗糖变位酶，是一种工业应用价值极高的异构酶，属于α-淀粉酶13家族，可以高效异构蔗糖生成异麦芽酮糖和海藻酮糖，异麦芽酮糖后续加氢可以生成异麦芽酮糖醇，异麦芽酮糖与异麦芽酮糖醇在医药上具有极高的价值，两者口感与蔗糖相似，特别是两者不容易引起人体血糖的升高，非常适合糖尿病患者的服用。利用蔗糖异构酶酶法转化蔗糖，与化学法合成异麦芽酮糖相比，具有转化率高，反应时间短，生产成本低。因此，在工业生产中可以达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。

发明人前期对来源于普城沙雷氏杆菌(Serratia plymuthica)的蔗糖异构酶进行了异源表达，通过摇瓶实验确定出：25℃、0.2mM IPTG诱导36h，重组菌胞外分泌产酶达到最大值，此时发明人对重组蔗糖异构酶在发酵上清及细胞内的比例进行分析发现重组菌胞外上清、胞内上清中的蔗糖异构酶活力分别占总酶活力的49.7％和50.3％。此外，发明人通过不同时间取样测酶活发现，24h重组菌胞外胞内总酶活力达到最大值，此时胞外上清中酶活力占总酶活力的17.9％左右；36h，虽然重组菌胞外上清中的蔗糖异构酶活力占总酶活力的49.7％，但此时胞内酶活力仅达到了24h的35.0％。因此，考虑到蛋白酶对蔗糖异构酶降解的原因，其实36h胞外上清中酶活力所占总酶活力比例仍然很低。可见重组蔗糖异构酶的胞外分泌效率很低，大部分重组酶存在于细胞内部。发酵后续处理过程中需要对菌体进行破碎等处理，来回收细胞内部的酶蛋白。然而大规模生产中细胞破碎的成本一般较高，而且细胞破碎过程中条件往往比较剧烈，酶蛋白容易失活。如果酶蛋白在发酵过程中能够主要分泌到胞外(培养基中)，后续分离纯化过程就只需要经过简单的菌体分离和浓缩，酶制剂的生产成本就可以显著降低。

来源于S.plymuthica蔗糖异构酶由600个氨基酸组成，包含了三个结构域。在酶转化底物生产产物时，温度越高，可以抑制转化过程中微生物的生长，防止酶在转化过程中被这些微生物降解。目前报道的大部分微生物来源的蔗糖异构酶热稳定性均很差，本发明中野生蔗糖异构酶在50℃下半衰期仅为8min左右，45℃下半衰期为40min。不利于工业上进行连续的酶转化过程，因此，通过分子改造提高蔗糖异构酶的稳定性显得尤为重要。

B因子(原子取代因素)指的是由热运动和位置混乱引起的原子在其平衡位置周围电子密度的模糊度。B因子越大，代表结构中一个氨基酸的活动范围越大，反之亦然。因此，氨基酸的B因子和其柔性具有一定的关系，B因子高的氨基酸更容易发生形状的改变和位置的移动，具有更好的柔性。反之，B因子低的氨基酸具有更好的刚性，不易发生变形和位移。在受热条件下，B因子高的氨基酸更容易受到影响而发生结构破坏，而导致酶活受到影响；而刚性好的B因子低的氨基酸则能更好地保持其构象的稳定，而维持酶活力。因此将蔗糖异构酶中B因子最高的氨基酸进行突变，降低其B因子，有可能提高酶的热稳定性。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种蔗糖异构酶突变体，突变体与亲本蔗糖异构酶相比有更好的热稳定性和胞外分泌效率。所述亲本基因与普城沙雷氏杆菌(Serratia plymuthica AS9CCUG61396)蔗糖异构酶基因(NCBI编号：NC_015567)一致，所述作为突变用的质粒模板为携带天然蔗糖异构酶编码基因的载体palI/pET24a(+)，蔗糖异构酶编码基因palI由上海捷瑞公司合成。

本发明所要解决的的第二个技术问题是提供热稳定性和胞外分泌效率至少其中一个得到提高的天然蔗糖异构酶定点突变体的制备方法，包括如下步骤：

1)在普城沙雷氏杆菌蔗糖异构酶晶体结构的基础上确定B因子最高的氨基酸，在此基础上分析此位点氨基酸的柔性，确定要突变成的氨基酸；

2)设计此处氨基酸定点突变的突变引物，以携带天然蔗糖异构酶编码基因的载体为模板进行基因扩增并构建含定点突变体的质粒载体；

3)将含有定点突变体编码基因的质粒转化进宿主细胞；

4)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化蔗糖异构酶突变体K576P、K576D。

所述质粒载体为pET系列，pGEX系列，pPICZ系列，pAN系列，或pUB中的任一一种。

所述的宿主细胞包括：细菌、酵母和真菌细胞。

本发明的有益效果：本发明构建了两个有价值的突变体，实现了蔗糖异构酶热稳定性和胞外分泌效率的提高，其中K576P、K576D的胞外酶活力占总酶活力的比例分别为82.8％和83.5％，分别是相应亲本蔗糖异构酶的4.6和4.7倍。在pH6.0，45℃的水浴中天然蔗糖异构酶的半衰期为39.2min，定点突变体K576P和K576D的半衰期分别为56.6min和69.8min左右；在pH6.0，40℃的水浴中天然蔗糖异构酶的半衰期为100h，定点突变体K576P和K576D的半衰期分别为178h和180h左右；蔗糖异构酶突变体比亲本更适合于酶的胞外分泌生产和在催化蔗糖生成异麦芽酮糖过程中的应用。

附图说明

图1天然蔗糖异构酶晶体结构B因子分布图

图2天然蔗糖异构酶及其定点突变体发酵上清SDS-PAGE凝胶电泳

图3野生型蔗糖异构酶及两种突变体纯酶SDS-PAGE凝胶电泳

图4蔗糖异构酶定点突变体的最适温度

图5蔗糖异构酶定点突变体40℃下热稳定性

图6蔗糖异构酶定点突变体45℃下热稳定性

具体实施方式

实施例1：蔗糖异构酶定点突变体的制备

(1)蔗糖异构酶定点突变体的构建

来源于S.plymuthica的蔗糖异构酶2种定点突变体K576P和K576D：

S.plymuthica AS9来源的蔗糖异构酶与来源于P.rubrum CBS574.77蔗糖异构酶一级结构同源性为99.83％，只有一个氨基酸不同，而且在蛋白质数据库里，后者晶体结构已经解析出来。因此，以来源于P.rubrum蔗糖异构酶为模板，模拟出S.plymuthica蔗糖异构酶蛋白结构，通过PyMol中B factor putty分析，结合已解析出的99.83％同源性的P.rubrum蔗糖异构酶晶体数据，确定576位赖氨酸(对应晶体结构中Lys-549位)B因子最高(图1)。寡聚-1，6-葡萄糖苷酶，具有与蔗糖异构酶非常相似的三维结构，都是属于α-淀粉酶13家族。来源于Geobacillus thermoglucosidasi和Gracilibacillus halophilus的oligo-1，6-glucosidase具有较好的热稳定性，通过一级序列比对分析，发现它们与蔗糖异构酶576位赖氨酸对应的是天冬氨酸(D)，尝试把赖氨酸突变成天冬氨酸，因此确定其中一个突变体为K576D。“脯氨酸效应”是指把蛋白质结构中loops处第二个位置氨基酸突变成脯氨酸可能会提高酶的热稳定性。结合蔗糖异构酶三维结构，发明人发现576位赖氨酸刚好处在loops上，因此可以尝试把赖氨酸突变成脯氨酸，确定第二个突变体K576P。

蔗糖异构酶576位氨基酸远离酶的催化中心，因此进行定点突变可能不会影响到蔗糖异构酶催化效率。该位点处在蔗糖异构酶的C端，此位点氨基酸的B因子最高，具有很大的摇摆性，同时发明人发现在发酵过程中胞内蔗糖异构酶容易被蛋白酶攻击降解。而突变之后，可能会引起该区域结构的紧凑，降低C端的摇摆性和减弱蛋白酶对它的攻击，因此有可能会导致蔗糖异构酶胞外分泌效率的增加。

两种突变体分别命名为K576P和K576D。

2种定点突变体K576P及K576D的制备方法，根据S.plymuthica蔗糖异构酶的编码基因序列，分别设计并合成引入K576P和K576D定点突变的引物，对蔗糖异构酶576位置进行定点突变，测定DNA编码序列，分别测序确认蔗糖异构酶突变体K576P的编码基因(由AAA突变成CCG)；定点突变体K576D的编码基因(由AAA突变成GAT)。将突变体基因连接到适当的表达载体中并导入大肠杆菌中进行表达，得到两种蔗糖异构酶定点突变体。

定点突变体K576P和K576D编码基因的PCR扩增：利用PCR技术，以表达载体palI/pET-24a(+)为模板，

引入K576P定点突变的突变引物为：

K576P-F：5’-ATTGACAGCAATAGCCCGAACGTGGTGAAAAAG-3’

K576P-R：5’-CTTTTTCACCACGTTCCGGCTATTGCTGTCAAT-3’

引入K576D定点突变的突变引物为：

K576D-F：5’-ATTGACAGCAATAGCGATAACGTGGTGAAAAAG-3’

K576D-R：5’-CTTTTTCACCACGTTATCGCTATTGCTGTCAAT-3’

PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min10s；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

PCR产物纯化后，加入DPnI，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，LB液体培养基培养8-10h，保甘油管，送去测序。测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达突变体K576P和K576D的两种重组菌株。

(2)天然蔗糖异构酶和两种定点突变体的表达与纯化：

挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的阳性单克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB液体培养基(含30μg/mL卡那霉素)；大肠杆菌在37℃摇床培养2h，至OD₆₀₀＝1.2左右，野生型蔗糖异构酶(WT)加入0.2mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，两种突变体K576P和K576D均加入0.05mM终浓度的IPTG 诱导胞外表达，并在25℃摇床继续培养发酵36h后，将发酵液于4℃、8000g离心15min除菌体，收集离心发酵上清液，并对发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。如图2所示，与天然酶相比，突变体所需诱导剂IPTG的量显著降低，同时K576P和K576D蛋白条带明显变粗，说明K576P和K576D胞外可溶性蛋白分泌量得到了明显提高。

磁力搅拌子低速搅拌下，向发酵上清液中缓慢加入60％(NH₄)₂SO₄，4℃放置盐析过夜。4℃、10000g离心20min，收集沉淀。用50mmol/L pH5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液复溶沉淀后，在50mmol/L pH5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中透析过夜，期间更换2-3次透析缓冲液，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品。采用AKTA avant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，整个纯化过程温度控制为4℃。阳离子交换色谱纯化步骤：(1)平衡：用5倍体积的50mmol/LpH5.3柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡强阳离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速1.0mL/min，洗脱液为含有1M NaCl的50mmol/L pH5.3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，进行线性洗脱，检测波长为280nm，分批收集含蔗糖异构酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是野生型，还是突变体，峰顶收集的酶液为最纯的部分。如图3所示。

实施例2：本实施例说明酶活分析。

1)酶活测定方法

蔗糖异构酶酶活性的测定采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。蔗糖异构酶在一定条件下，催化蔗糖生成异麦芽酮糖，以及少量的海藻酮糖、葡萄糖和果糖。异麦芽酮糖为还原糖，蔗糖为非还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：在上述条件下，反应初始阶段每分钟释放1μmol异麦芽酮糖的酶量作为一个活力单位。

酶活力测定步骤：

A.预热：取1.8ml的10％蔗糖溶液(50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)于试管中，置于30℃水浴锅预热。

B.反应：加入0.2ml适当稀释的样品酶液，振荡混匀，准确计时15min，加入3ml DNS混匀，放入冰水中终止反应，沸水浴7min，冷却。

C.测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15ml的，混匀。在540nm下测量其吸光值并计算酶活力。

2)发酵液上清及胞内酶活力分布比较：

重组菌株经过摇瓶发酵，发酵液在10000g离心15min，收集发酵上清液和菌体。菌体用12.5mmol/L pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮后，用超声波破碎仪进行破碎。细胞破碎液在12000g离心5min，收集上清液为胞内上清。对胞外发酵上清、胞内上清的蔗糖异构酶酶活力进行测定。

实验结果列于表1，如果不考虑胞内蔗糖异构酶的降解，天然酶的胞外酶活力仅占总酶活力的17.9％，定点突变体K576P和K576D胞外酶活所占比例明显提高，达到82.8％和83.5％，分别是天然酶的4.6和4.7倍。同时定点突变体在胞内上清的酶活力占总酶活力的比例下降非常明显。测野生菌及两种突变体不同时间产酶发现，野生型在0.2mM IPTG诱导36h时胞外上清酶活达到最大，135U/mL。而K576P和K576D所需IPTG的诱导量降低到0.05mM，但诱导36h时，胞外发酵上清酶活分别为218.8和229.6U/mL。由此可见，两种蔗糖异构酶定点突变体相对于对照具有更好的胞外可溶性分泌表达能力，具有更好的应用于发酵生产的潜力。

表1天然蔗糖异构酶及两种定点突变体的酶活力分布

实施例3：本实施例说明蔗糖异构酶的最适温度和热稳定性。

以pH6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠(50mM)为缓冲液，在20到50℃温度范围测定天然蔗糖异构酶及突变体的最适温度。如图4，K576P的最适温度是35℃，比天然酶的最适温度提高5℃；K576D的最适温度为30℃，与天然酶的最适温度相同。K576P和K576D在40℃分别保留85.7％和83.2％的活性，都比天然酶在40℃保留的活性要高一些。

将纯化的天然蔗糖异构酶和突变体用50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释至蛋白含量为0.25mg/mL，且pH为6.0，置于40℃和45℃恒温水浴中，40℃恒温水浴时，每隔24h取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性，如图5所示，K576P和K576D半衰期分别为178h和180h，分别是天然酶半衰期的1.78和1.80倍；45℃恒温水浴时，每隔20min取样一次，测其残留酶活，比较其稳定性，如图6所示。K576P和K576D半衰期分别为56.6 min和69.8min，分别是天然酶半衰期的1.4和1.8倍。可见，两种蔗糖异构酶定点突变体的稳定性得到了不同程度的提高；

实施例4：本实施例说明蔗糖异构酶的突变体的动力学参数测定。

天然酶、K576P和K576D的动力学参数如表2所示。

相比于天然酶，B因子最高位点突变导致了突变体K576P和K576D对蔗糖底物的结合能力的降低。K576P和K576D的K_m值分别是天然酶的1.3倍和1.4倍，虽然结合能力有所降低，但是降低幅度不是很大。突变体K576P和K576D的V_max值分别是天然酶的0.9倍和0.8倍。此外，从表2可以看出K576P和K576D的K_cat/K_m值与天然酶相比，分别是天然酶的75.0％和50％，这可能主要是由于C端B因子突变体对底物结合能力降低或者底物结合能力和K_cat系数同时降低引起的。但是，在相同的转化条件下，三者最终的蔗糖转化率都可以达到81％左右。所以，即使催化动力学参数有所下降，但是两种定点突变体的稳定性提高了，且突变体最终转化蔗糖的效率没有降低，因此可能具有更好的应用价值。

表2蔗糖异构酶定点突变体动力学参数

Claims

1.两种蔗糖异构酶突变体，其特征在于对蔗糖异构酶中B因子最高的氨基酸进行定点突变。

2.权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变氨基酸的B因子最高。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于B因子最高的氨基酸突变成两种不同氨基酸。

4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于蔗糖异构酶576位置处的K分别突变为P或D。

5.根据权利要求1-4所述的突变体，其特征在于所述改造后蔗糖异构酶为普城沙雷氏杆菌蔗糖异构酶两种突变体K576P和K576D。

6.获得权利要求1-4任一所述突变体的方法，包括如下步骤：

1)对蔗糖异构酶晶体结构进行分析，确定B因子最高的氨基酸，并分析突变成何种氨基酸可以降低B因子；

2)设计定点突变所用引物，以携带蔗糖异构酶编码基因的载体为模板进行突变并构建两种突变体的质粒载体；

3)将突变质粒转化进宿主细胞；

4)挑选阳性克隆进行发酵培养，纯化获得蔗糖异构酶突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述质粒载体为pET系列，pGEX系列，pPICZ系列，或pAN系列，或pUB中的任一一种。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述宿主细胞为细菌、酵母和真菌细胞。