CN102978267B - 酶法制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酶法制备谷胱甘肽（GSH）的方法，该方法将合成GSH的两步反应，即生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应和生成GSH的反应，分别在不同的反应罐中进行，并且每步反应之后都分离出反应使用的酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-I）和谷胱甘肽合成酶（GSH-II），使得GSH I和GSH II两种酶的酶活力得到最大程度利用，降低了两种酶促反应之间的相互抑制。本发明方法实现了GSH I和GSH II的循环利用，并且使用了适合制备GSH的反应所需的ATP再生系统，降低了制备GSH的生产成本，提高了GSH产率，实现了大规模连续生产，经济效益显著。
Description
技术领域
本发明涉及制备谷胱甘肽的方法，尤其涉及一种酶法制备谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。
GSH由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）通过肽键形成，分子中有一特殊的γ肽键，即由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2缩合成的肽键，它不同于蛋白质分子中的普通肽键。GSH为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。两分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽（GSSG），又称谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶体。
目前谷胱甘肽的主要制备方法有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已很少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。
近年颇受重视的是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但产量有待提高，而且下游工艺处理复杂。与三磷酸腺苷（ATP）再生体系偶联合成GSH，乙酰激酶尽管效率较高，但乙酰磷酸的高价格及稳定性限制了此法的产业化；酵母糖酵解途径成本低廉，虽在胞二磷胆碱和NADP的合成方面获得成功，但合成GSH的效率较低，主要是ATP再生反应效率不高，反应条件与GSH酶系催化合成GSH的条件不协调以及由此造成的成本较高限制了此方法潜力的发挥。
近年来国内外GSH生产基本采用发酵法，酶法生产GSH的技术还未成形。有研究者提出用固定化酶技术生产GSH，通过调节GSH I和GSH II两种酶的比例，将两种酶固定在载体上，通过加入底物和ATP来生产GSH。但是该方法存在以下问题，直接限制了该技术的工业化应用：
1）GSH I和GSH II两种酶固定在一起，无法解决两步反应之间的相互抑制，影响了生产速度；
2）固定化酶技术未解决酶活性的稳定性问题，提高了生产酶的成本；以及
3）酶法合成的最大问题是ATP的来源，由于ATP价格昂贵，使得利用酶法合成GSH的成本比传统发酵法高很多。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大规模、低成本、工业化生产GSH的方法，解决目前酶法生产GSH存在的问题。
本发明提供了一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸；
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶；
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽；
（4）在过滤器E2中分离GSH II酶；以及
（5）分离产物GSH。
本发明方法进一步包括以下步骤：
（6）在再生罐C中利用二磷酸腺苷（ADP）和/或磷酸腺苷（AMP）再生ATP，并分离生成的ATP。
本发明方法还可进一步包括以下步骤：
（7）所述步骤（2）中分离的GSH I酶的循环利用，即将分离的GSH I酶添加至反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；以及
（8）GSH I酶的连续分离，即在过滤器E1中连续分离GSH I酶。
本发明方法还可进一步包括以下步骤：
（9）所述步骤（4）中分离的GSH II酶的循环利用，即将分离的GSH II酶添加至反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应；以及
（10）GSH II酶的连续分离，即在过滤器E2中连续分离GSH II酶。
本发明方法还进一步包括以下步骤：
（11）产物GSH的连续分离。
在本发明方法中，循环利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重复所述步骤（6）至所述步骤（11）至少一次，优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。
本发明方法中，在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应如下：
反应温度为25-60℃，优选30-55℃，更优选35-50℃，最优选37-45℃；
反应PH为5-10，优选6-10，更优选7-9的条件下；
反应体系1为含有底物谷氨酸或其盐和半胱氨酸或其盐、以及镁离子、钾离子、钠离子和Tris的水溶液；
在反应体系1中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分离的GSHI酶，反应一段时间，例如1-10小时，优选2-8小时，最优选3-6小时生成γ-谷氨酰半胱氨酸；
其中所述镁离子源自氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁或硝酸镁中的一种或多种；所述钾离子源自氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾或柠檬酸钾中的一种或多种；所述钠离子源自氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种。
本发明方法中在反应罐B中生成谷胱甘肽的反应如下：
反应温度为25-60℃，优选30-55℃，更优选35-50℃，最优选37-45℃；
反应PH为5-10，优选6-10，更优选7-9的条件下；
反应体系2为添加了底物甘氨酸或其盐的所述步骤（2）的滤出液1；
在反应体系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分离的GSHII酶，反应一段时间，例如1-10小时，优选2-8小时，最优选2-5小时生成谷胱甘肽。
本发明方法中在再生罐C中的再生反应如下：
反应温度为25-50℃，优选25-40℃；
反应PH为4-9，优选5-8；
再生反应体系为包含葡萄糖、酵母、镁离子、钾离子、钠离子和磷酸根离子的水溶液；
向再生罐C中添加的ADP和/或AMP为所述步骤（5）分离出产物GSH之后的反应液的浓缩液；
在再生罐C反应一段时间生成再生的ATP，再生的ATP通过离心或过滤方法分离；
其中所述酵母选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和/或毕赤酵母（Pichia pastoris），所述磷酸根离子源自：磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸钠或磷酸钾中的一种或多种。
本发明方法中过滤器E1或E2具有进料口、出料口和回流口，内设过滤膜，在循环利用GSH I酶或GSH II酶时，反应体系通过过滤器E1或E2添加至反应罐的方式如下：
向反应罐A或反应罐B中添加完分离的GSH I酶或GSH II酶之后，将补加的反应体系1的反应液或反应体系2的反应液经过滤器E1或过滤器E2的回流口、过滤器E1或E2、和过滤器E1或E2的进料口添加至反应罐A或反应罐B。
本发明方法中所提及的氨基酸或其盐都为L型氨基酸或其盐。
更具体地，本发明方法包括以下步骤：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GluCys）：
在反应体系1中添加ATP和GSH I酶，在25-60℃、PH为5-10的条件下反应生成γ-谷氨酰半胱氨酸，其中所述反应体系1为含有底物谷氨酸或其盐和半胱氨酸或其盐、以及镁离子、钾离子、钠离子和Tris的水溶液；
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶：
通过超滤方法，从所述步骤（1）的反应体系1的反应液中分离出GSH I酶，经过滤器E1的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液，其中所述过滤器E1具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于56kDa的膜；
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽：
在反应体系2中添加ATP和GSH II酶，在25-60℃、PH为5-10的条件下反应生成谷胱甘肽，其中所述反应体系2为添加了底物甘氨酸或其盐的所述步骤（2）的滤出液1；
（4）在过滤器E2中分离GSH II酶：
通过超滤方法，从所述步骤（3）的反应体系2的反应液中分离出GSH II酶，经过滤器E2的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液，其中所述过滤器E2具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于35kDa的膜；以及
（5）分离产物GSH
通过离子交换方法，从所述步骤（4）的滤出液2中分离产物GSH，经离子交换后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本发明方法还可进一步包含以下步骤：
（6）在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分离生成的ATP：
将所述步骤（5）的穿出液浓缩之后，将其含有的ADP和/或AMP在20-50℃、PH值为4-9的条件下在再生反应体系中再生为ATP，所述再生反应体系为包含葡萄糖、酵母、镁离子、钾离子、钠离子和磷酸根离子的水溶液；再生的ATP通过本领域技术人员熟知的离心或过滤方法分离，将再生反应体系中的酵母去除；
（7）反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应，即步骤（1）的连续反应：
将所述步骤（2）中分离出的GSH I酶经由过滤器E1的回流口添加至反应罐A，
将一定量所述步骤（6）中再生的ATP量添加至反应罐A，
添加完分离的GSH I酶之后，将补加的的反应体系1的反应液经由过滤器E1的回流口、过滤器E1、和过滤器E1的进料口添加至反应罐A，
在25-60℃、PH为5-10的条件下进行生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；以及
（8）在过滤器E1中连续分离GSH I酶，即步骤（2）的连续分离：
通过超滤方法，从所述步骤（7）即步骤（1）的连续反应步骤中的反应体系1的反应液中分离出GSH I酶，经过滤器E1的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（9）反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤（3）的连续反应：
所述步骤（4）中分离出的GSH II酶经由过滤器E2的回流口添加至反应罐B，
将一定量所述步骤（6）中再生的ATP添加至反应罐B，
添加完分离的GSH II酶之后，将反应体系2经由过滤器E2的回流口、过滤器E2、和过滤器E2的进料口添加至反应罐B，其中所述反应体系2为添加了底物1-10g/L甘氨酸或其盐的所述步骤（2）的连续分离步骤，即所述步骤（8）的滤出液1，
在25-60℃、PH为5-10的条件下进行反应生成谷胱甘肽的连续反应；
（10）在过滤器E2中连续分离GSH II酶，即步骤（4）的连续分离：
通过超滤方法，从所述步骤（3）的连续反应步骤，即所述步骤（9）的反应体系2的反应液中分离出GSH II酶，经过滤器E2的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液；以及
（11）分离产物GSH，即步骤（5）的连续分离：
通过离子交换方法，从所述步骤（4）的连续分离步骤，即所述步骤（10）的滤出液2中分离产物GSH，经离子交换后的穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP。
本发明的方法中所述步骤（6）至所述步骤（11）可以重复至少一次，优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。
本发明所采用的GSH I酶和GSH II酶来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
本发明方法步骤（1）添加的ATP为1-20g/L，优选2-15g/L；添加的GSHI酶的浓度为0.01-0.2g/L，优选0.05g/L；所述步骤（1）或步骤（1）的连续反应步骤中，反应温度为30-55℃，优选35-50℃，更优选37-45℃，反应PH为6-10，优选7-9，反应体系1为含有底物1-8g/L谷氨酸或其盐，优选2-6g/L谷氨酸或其盐；1-8g/L半胱氨酸或其盐，优选2-5g/L半胱氨酸或其盐；以及0.01-0.1M镁离子，优选0.01-0.08M镁离子；0.01-0.3M钾离子，优选0.05-0.2M钾离子；0.01-0.3M钠离子，优选0.05-0.2M钠离子；和2-12g/L Tris，优选4-8g/L Tris的溶液。
本发明方法步骤（2）和步骤（4）中采用的膜选自醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
本发明方法步骤（3）添加的ATP为1-20g/L，优选2-15g/L；添加的GSHII酶的浓度为0.01-0.2g/L，优选0.05g/L；所述步骤（3）或步骤（3）的连续反应步骤中，反应温度为30-55℃，优选30-50℃，更优选35-45℃，反应的pH值为6-10，优选7-9，添加的底物浓度为1-10g/L甘氨酸或其盐，优选2-8g/L甘氨酸或其盐。
本发明方法步骤（6）的反应温度为25-40℃、PH为5-8，所述再生反应体系包含：1-60g/L葡萄糖，优选10-50g/L葡萄糖，更优选10-40g/L葡萄糖；1-60g/L酵母，优选10-50g/L，更优选20-40g/L酵母；0.01-0.1M镁离子，优选0.02-0.08M镁离子；0.01-0.5M钾离子，优选0.05-0.3M钾离子；0.01-1M钠离子，优选0.05-0.8M钠离子；以及0.01-0.5M磷酸根离子，优选0.1-0.5M磷酸根离子；所述酵母选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和/或毕赤酵母（Pichiapastoris），所述磷酸根离子源自：磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸钠或磷酸钾中的一种或多种。
本发明方法将合成GSH的两步反应，即生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应和生成GSH的反应，分别在不同的反应罐中进行，并且每步反应之后都分离出反应使用的酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-I）和谷胱甘肽合成酶（GSH-II），使得GSH I和GSH II两种酶的酶活力得到最大程度利用，降低了两种酶促反应之间的相互抑制。本发明方法实现了GSH I和GSH II的循环利用，并且使用了适合制备GSH的反应所需的ATP再生系统，降低了制备GSH的生产成本，提高了GSH产率，实现了大规模工业化生产。
在本发明方法中，按实施例3计算，仅使用约5克GSH I酶和5克GSH II酶和约2400克ATP，在100升反应体系中，连续循环反应10次，在40小时内可以生产8000克GSH。如果用以前报道的工艺进行生产，至少需要使用ATP24960克，生产时间至少200小时。因此，用我们的发明方法生产GSH节约了约90%的ATP，相比于以前报道的固定化酶法制备GSH技术，效率提高了10倍以上。综上所述，本发明的方法具有如下优点：
1）抛弃固定化技术，将合成GSH所需的两种酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-I）和谷胱甘肽合成酶（GSH-II）分开反应，降低了两种酶促反应之间的相互抑制，同时使每种酶的酶活力最大程度的得到充分使用；
2）两步反应可以方便检测GSH I和GSH II两种酶的活性变化，有利于生产监控；
3）建立了适合GSH生产的ATP再生系统，降低了生产成本；
4）建立了适合GSH I和GSH II两种酶保持高活性的反应体系，可以大规模连续生产；
5）采用连续反应体系，分两步合成GSH，利用连续分离体系和ATP再生体系使酶促合成GSH连续稳定生产；以及
6）本发明方法缩短了反应时间。
附图说明
图1为本发明方法制备GSH的工艺流程图。
图2为本发明所表达的GSH I酶和GSH II酶的SDS-PAGE图。
图3为生成γ-谷氨酰半胱氨酸反应在起始0小时10倍稀释反应液的HPLC图谱。
图4为生成γ-谷氨酰半胱氨酸反应3小时10倍稀释反应液的HPLC图谱。
图5为反应罐A中γ-谷氨酰半胱氨酸生成量与时间关系图
图6为分离的GSH I和GSH II酶的SDS-PAGE图。
图7为生成谷胱甘肽反应2.5小时20倍稀释反应液的HPLC图谱。
图8为反应罐B中谷胱甘肽生成量与时间关系图
图9为阳离子交换穿出液的HPLC图谱
图10为ATP再生体系反应0小时的HPLC图谱。
图11为ATP再生体系反应3小时的HPLC图谱。
图12为循环反应次数与γ-GluCys生成量关系图。
图13为循环反应次数与GSH生成量关系图。
实施例
下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述。本领域的技术人员应能理解，以下实施例是示意性的而非限制性的。
实施例1GSH I酶和GSH II酶的制备
本发明方法中的GSH I酶和GSH II酶可以商购获得，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
GSH I酶和GSH II酶的制备过程如下：
根据gsh I与gsh II基因序列（GenBank:X03954.1和X01666），设计两对扩增引物，由中美泰和生物技术有限公司合成，引物序列如下：
gshI正义引物：5’-CCCATGGTCCCGGACGTATCACAGGCGCTG-3’；
gshI反义引物：5’-CGGATCCTCAGGCGTGTTTTTCCAGCCACAC-3’；
gsh II正义引物：5’-CCCATGGTCAAGCTCGGCATCGTGATGG-3’；
gsh II反义引物：5’-CGGATCCTTACTGCTGCTGTAAACGTGC-3’。
提取大肠杆菌（Escherichia coli）K12菌株（购于天根生化科技有限公司）DNA，以其为模板，通过PCR扩增出gsh I与gsh II基因片段，并将其分别连接至pET 28a载体（购于Invitrogen公司），经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株（购于天根生化科技有限公司）。
将转化后的E.coli BL21(DE3)单克隆接入LB培养基，培养至对数期后，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导5小时后，收集菌体，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）筛选高表达菌株。
将筛选出的高表达菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入含5L发酵培养基的发酵罐中，培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mM IPTG诱导5小时后，离心收集菌体约1000g。
其中LB培养基成分为：1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%NaCl；种子培养基成分为：1%蛋白胨、0.5%酵母粉和1%氯化钠；发酵培养基成分为：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%氯化钠、5%磷酸氢二钠、1%磷酸二氢钠、0.01%硫酸镁和1%甘油。
收获的菌体经超声或高压匀浆破菌后，离心收集上清。然后加30%饱和的硫酸铵，离心收集沉淀。经Tris缓冲液pH 8.0溶解后，使用G25柱（购于通用电气医疗生物科学有限公司）脱盐，再经DEAE-Sepharose FF（购于通用电气医疗生物科学有限公司）层析可得到初步纯化的GSH I酶和GSH II酶。参见图2为所制备酶的SDS-PAGE图，泳道1为GSH I酶，约56kDa；泳道2为GSH II酶，约35kDa；泳道3为蛋白标志物14-97kDa（购于北京欣经科生物技术有限公司）。1000g菌体获得约10-30g粗纯的酶。使用现有技术记载的公知的测定GSH I酶和GSH II酶活性的方法，检测到GSH I酶和GSH II酶活性分别为7000U和10000U，其中将1μM底物完全转化定义为1个活性单位（U）。
实施例2反应时间的确定
参见图1，根据本发明制备GSH的工艺流程图进行如下反应：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GluCys）：
在反应罐A中，100L无菌水的反应体系1为含有底物600g谷氨酸和400g半胱氨酸，以及600g Tris、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，在反应体系1中添加5g GSH I酶，加氢氧化钾调节pH值至8.5，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为8.5，温度为40℃。
使用高效液相色谱（HPLC）检测反应第0、1、2、3、4、5小时γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量，参见参见图3、图4和图5。图3为反应起始0小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图4为反应3小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。图5为反应罐A中γ-谷氨酰半胱氨酸生成量与时间关系图。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱（购于AKZO NOBEL公司）（250×4.6mm），检测波长210nm。流动相为含有6.8g/L磷酸二氢钾、2.0g/L庚烷磺酸钠和3%甲醇的水溶液，pH=3.0。
从结果可以看出：3小时后，γ-谷氨酰半胱氨酸生成量达到约6.6g/L，反应增长缓慢，ATP用量约为1200g。继续补充ATP，5小时后，ATP用量约为2000g，γ-谷氨酰半胱氨酸生成量约7g/L。从中可以看出，反应3小时后，由于产物的抑制作用，γ-谷氨酰半胱氨酸生成速度明显降低。由此确定，反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应时间为3小时。
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶：
通过超滤方法，将步骤（1）的反应体系1的反应液经过滤器E1的进料口至过滤器E1过滤分离GSH I酶，过滤器E1内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E1的出料口流出的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
分离的GSH I酶参见图6酶的SDS-PAGE图，泳道1为膜包截留的GSH I酶，约56kDa；泳道2为滤出液1，无蛋白滤出；泳道3为蛋白标志物14-97kDa（购于北京欣经科生物技术有限公司）。使用实施例1中描述方法，检测GSH I酶的活性约为7000U。
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽：
在反应罐B中，向反应体系2中添加5g GSH II，反应体系2为添加了底物300g甘氨酸的实施例2步骤（2）的滤出液1，控制pH恒定为8.5，温度为35℃，流加ATP开始反应。使用高效液相色谱（HPLC）检测反应第0、1、2、2.5、3、4、5小时GSH的生成量，参见参见图7和图8。图7为生成谷胱甘肽反应2.5小时20倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。图8为反应罐B中谷胱甘肽生成量与时间关系图。HPLC检测条件同上述步骤（1）。
从结果可以看出：2.5小时后，谷胱甘肽生成量达到约8g/L，98%以上γ-谷氨酰半胱氨酸被耗尽，ATP用量约为1200g。继续补充ATP，5小时后，ATP用量约为2000g，谷胱甘肽生成量没有明显增加。由此确定，反应罐B中生成谷胱甘肽的反应时间为2.5小时。
实施例3谷胱甘肽的制备
参见图1，根据本发明制备GSH的工艺流程图按照如下步骤制备谷胱甘肽：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GluCys）：
在反应罐A中，100L无菌水的反应体系1为含有底物600g谷氨酸和400g半胱氨酸，以及600g Tris、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，在反应体系1中添加5g GSH I酶，加氢氧化钾调节pH值至8.5，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为8.5，温度为40℃。3小时后，ATP用量约为1200g。
高效液相色谱（HPLC）检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为6.6g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP），参见图4，为反应3小时10倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶：
通过超滤方法，将步骤（1）的反应体系1的反应液经过滤器E1的进料口至过滤器E1过滤分离GSH I酶，过滤器E1内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E1的出料口流出的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
使用实施例1中描述方法，检测GSH I酶的活性约为7000U。
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽：
在反应罐B中，向反应体系2中添加5g GSH II，反应体系2为添加了底物300g甘氨酸的步骤（2）的滤出液1，控制pH恒定为8.5，温度为35℃，流加ATP开始反应。2.5小时后，ATP用量约为1200g。
HPLC检测GSH的生成量约为8g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP），参见图7，为反应2.5小时20倍稀释反应液的HPLC图谱，图中未标出峰为氨基酸。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
（4）在过滤器E2中分离GSH II酶：
通过超滤方法，将步骤（3）的反应体系2的反应液经过滤器E2的进料口至过滤器E2过滤分离GSH II酶，过滤器E2内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E2的出料口流出的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
分离的GSH II酶参见图6酶的SDS-PAGE图，泳道3为为蛋白标志物14-97kDa（购于北京欣经科生物技术有限公司）；泳道4为滤出液2，无蛋白滤出；泳道5为膜包截留的GSH II酶，约35kDa。使用实施例1中描述的方法，检测GSH II酶的活性约为10000U。
（5）分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质，参见图9，为阳离子交换穿出液的HPLC图谱。HPLC检测条件为：Kromasil C18色谱柱（购于AKZO NOBEL公司）（250×4.6mm），检测波长254nm。流动相为50mM磷酸盐缓冲液，pH=6.0。穿出液经浓缩后含有ATP、ADP和/或AMP。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱阳离子交换树脂上的GSH，GSH产量共计720g，收率可达90%。
（6）在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分离生成的ATP：
将步骤（5）的穿出液在蒸馏塔中减压蒸馏浓缩至约5倍，至ADP和/或AMP约0.24M后，将其含有的ADP和/或AMP在30℃、PH值为5.5的条件下在再生反应体系中再生为ATP，所述再生反应体系为：20L无菌水中包含600g葡萄糖、320g氯化镁、360g氯化钾、600g氯化钠、320ml 85%H3PO4和500g干燥处理过的酿酒酵母，加NaOH调pH至5.5。3小时后，ATP再生转化率为90%以上，参见图10和图11。图10为ATP再生体系反应0小时的HPLC图谱，从图10可以看出，步骤（5）的穿出液中主要含有ADP和AMP。图11为ATP再生反应体系反应3小时的HPLC图谱，从图11可以看出，90%的ADP和AMP已再生转化为ATP，共计2200g ATP。HPLC检测条件同上述步骤（5）。
再生的ATP在离心机中以5000rpm转速通过离心从再生反应体系中分离，将再生反应体系中的酵母去除。
（7）反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应，即步骤（1）的连续反应：
将步骤（2）中分离出的GSH I酶经由过滤器E1的回流口添加至反应罐A，
将一定量步骤（6）中再生的ATP添加至反应罐A，例如按补加的反应体系1所需量，约1200g以流加方式添加ATP至反应罐A，
添加完分离的GSH I酶之后，将补加的反应体系1经由过滤器E1的回流口、过滤器E1、和过滤器E1的进料口添加至反应罐A，以便将过滤器E1中的膜上吸附的少量GSH I酶反冲至反应罐A；
在40℃、PH为8.5的条件下进行生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；3小时后，HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为6.5g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
在该步骤中，ATP和GSH I酶被循环利用。GSH I酶循环反应10次后，酶活性约降低15%，需补加15%新酶。参见图12，为循环反应次数与γ-GluCys生成量关系图。
（8）在过滤器E1中连续分离GSH I酶，即步骤（2）的连续分离：
通过超滤方法，从所述步骤（7）的反应体系1的反应液中分离出GSH I酶，经过滤器E1的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（9）反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤（3）的连续反应：
将步骤（4）中分离出的GSH II酶经由过滤器E2的回流口添加至反应罐B；
将一定量步骤（6）中再生的ATP添加至反应罐B，例如按反应体系2所需量，约1200g以流加方式添加ATP至反应罐B，
添加完分离的GSH II酶之后，将反应体系2（为添加了底物1-10g/L甘氨酸的步骤（2）的连续分离步骤，即步骤（8）的滤出液1）经由过滤器E2的回流口、过滤器E2、和过滤器E2的进料口添加至反应罐B，以便将膜包中吸附的少量GSH II酶反冲至反应罐B；
在35℃、PH为8.5的条件下进行反应生成谷胱甘肽的连续反应；2.5小时后，HPLC检测GSH的生成量约为8g/L，共计800g。90%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
在该步骤中，实现了ATP以及GSH II的循环利用。GSH II循环反应10次后，酶活性约降低11%，需补加11%新酶。参见图13，为循环反应次数与GSH生成量关系图。
（10）在过滤器E2中连续分离GSH II酶，即步骤（4）的连续分离：
通过超滤方法，从步骤（3）的连续反应步骤，即步骤（9）的反应体系2的反应液中分离出GSH II酶，经过滤器E2的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
（11）分离产物谷胱甘肽，即步骤（5）的连续分离：
使用盐酸调节步骤（4）的连续分离步骤，即步骤（10）的滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱GSH，GSH产量共计720g，收率可达90%。
重复步骤（6）至步骤（11）8次，参见图12和图13，分别为为循环反应次数与γ-GluCys生成量关系图和循环反应次数与GSH生成量关系图。
实施例4使用氨基酸盐生成γ-谷氨酰半胱氨酸
在反应罐A中，100L无菌水的反应体系1为含有底物763g谷氨酸钠和580g半胱氨酸盐酸盐，以及600g Tris、1100g氯化钾、870g氯化钠和800g氯化镁的溶液，在反应体系1中添加5g GSH I酶，加氢氧化钾调节pH值至8.5，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为8.5，温度为40℃。3小时后，ATP用量约为1200g。
HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为6.6g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
从结果可以看出：使用谷氨酸盐和半胱氨酸盐替代相同摩尔浓度的谷氨酸和半胱氨酸对反应结果没有影响。生产中可使用谷氨酸盐和半胱氨酸盐替代谷氨酸和半胱氨酸。
实施例5使用氨基酸盐生成谷胱甘肽
在反应罐B中，向反应体系2中添加5g GSH II，反应体系2为添加了底物388g甘氨酸钠的实施例2步骤（2）的滤出液1，控制pH恒定为8.5，温度为35℃，流加ATP开始反应。2.5小时后，ATP用量约为1200g。
HPLC检测GSH的生成量约为8g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
从结果可以看出：使用甘氨酸盐替代相同摩尔浓度的甘氨酸对反应结果没有影响。生产中可使用甘氨酸盐替代甘氨酸。
实施例6谷胱甘肽的制备
参见图1，根据本发明制备GSH的工艺流程图按照如下步骤制备谷胱甘肽：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GluCys）：
在反应罐A中，100L无菌水的反应体系1为含有底物100g谷氨酸和100g半胱氨酸，以及200g Tris、2200g氯化钾、60g氯化钠和200g氯化镁的溶液，在反应体系1中添加1g GSH I酶，加氢氧化钾调节pH值至10，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为10，温度为60℃。3小时后，ATP用量约为100g。
HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为0.5g/L，95%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶：
通过超滤方法，将步骤（1）的反应体系1的反应液经过滤器E1的进料口至过滤器E1过滤分离GSH I酶，过滤器E1内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E1的出料口流出的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽：
在反应罐B中，在反应体系2中添加1g GSH II，反应体系2为添加了底物100g甘氨酸的步骤（2）的滤出液1，控制pH恒定为10，温度为60℃，流加ATP开始反应。2.5小时后，ATP用量约为100g。
HPLC检测GSH的生成量约为0.6g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述步骤（1）。
（4）在过滤器E2中分离GSH II酶：
通过超滤方法，将步骤（3）的反应体系2的反应液经过滤器E2的进料口至过滤器E2过滤分离GSH II酶，过滤器E2内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E2的出料口流出的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
（5）分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和AMP。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱GSH，GSH产量共计55g，收率可达90%。
（6）在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分离生成的ATP：
将步骤（5）的穿出液在蒸馏塔中减压蒸馏浓缩约5倍，至ADP和/或AMP约0.02M后，将其含有的ADP和/或AMP在20℃、PH值为9.0的条件下在再生反应体系中再生为ATP，所述再生反应体系为：20L反应液中包含20g葡萄糖、40g氯化镁、750g氯化钾、12g氯化钠、13.6ml 85%H3PO4和20g干燥处理过的酿酒酵母，加NaOH调pH至9.0。5小时后，ATP再生转化率为90%以上。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（6）。
再生的ATP在离心机中以5000rpm转速通过离心分离。
（7）反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应，即步骤（1）的连续反应：
将步骤（2）中分离出的GSH I酶经由过滤器E1的回流口添加至反应罐A，
将步骤（6）中再生的ATP约100g以流加方式添加至反应罐A，
添加完分离的GSH I酶之后，将补加的的反应体系1经由过滤器E1的回流口、过滤器E1、和过滤器E1的进料口添加至反应罐A，以便将过滤器E1中的膜上吸附的少量GSH I酶反冲至反应罐A；
在60℃、PH为10的条件下进行生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；3小时后，HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为0.5g/L，95%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述步骤（1）。
该步骤中，ATP以及GSH I酶的循环利用。GSH I酶循环反应10次后，酶活性约降低25%，需补加25%新酶。
（8）在过滤器E1中连续分离GSH I酶，即步骤（2）的连续分离：
通过超滤方法，从所述步骤（7）的反应体系1的反应液中分离出GSH I酶，经过滤器E1的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（9）反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤（3）的连续反应：
将步骤（4）中分离出的GSH II酶经由过滤器E2的回流口添加至反应罐B；
将步骤（6）中再生的ATP约100g以流加方式添加至反应罐B；
添加完分离的GSH II酶之后，将反应体系2（为添加了底物1-10g/L甘氨酸的步骤（2）的连续分离步骤，即步骤（8）的滤出液1）经由过滤器E2的回流口、过滤器E2、和过滤器E2的进料口添加至反应罐B，以便将膜包中吸附的少量GSH II酶反冲至反应罐B；
在60℃、PH为10的条件下进行反应生成谷胱甘肽的连续反应；2.5小时后，HPLC检测GSH的生成量约为0.6g/L，90%以上ATP转化为ADP（AMP）。
在该步骤中，实现了ATP以及GSH II的循环利用。GSH II循环反应10次后，酶活性约降低17%，需补加17%新酶。
（10）在过滤器E2中连续分离GSH II酶，即步骤（4）的连续分离：
通过超滤方法，从步骤（3）的连续反应步骤，即步骤（9）的反应体系2的反应液中分离出GSH II酶，经过滤器E2的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
（11）分离产物谷胱甘肽，即步骤（5）的连续分离：
使用盐酸调节步骤（4）的连续分离步骤，即步骤（10）的滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质。使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱GSH，GSH产量共计54g，收率可达90%。
重复步骤（6）至步骤（11）10次。
实施例7谷胱甘肽的制备
参见图1，根据本发明制备GSH的工艺流程图按照如下步骤制备谷胱甘肽：
（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-GluCys）：
在反应罐A中，100L无菌水的反应体系1为含有底物800g谷氨酸和800g半胱氨酸，以及1200g Tris、75g氯化钾、1750g氯化钠和2000g氯化镁的溶液，在反应体系1中添加20g GSH I酶，加氢氧化钾调节pH值至5，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为5，温度为25℃。3小时后ATP用量约为2000g。
HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为5g/L，50%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（1）。
（2）在过滤器E1中分离GSH I酶：
通过超滤方法，将步骤（1）的反应体系1的反应液经过滤器E1的进料口至过滤器E1过滤分离GSH I酶，过滤器E1内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E1的出料口流出的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽：
在反应罐B中，在反应体系2中添加20g GSH II，反应体系2为添加了底物1000g甘氨酸的步骤（2）的滤出液1，控制pH恒定为5，温度为25℃，流加ATP开始反应。2.5小时后，ATP用量约为2000g。
HPLC检测GSH的生成量约为6.5g/L，55%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述步骤（1）。
（4）在过滤器E2中分离GSH II酶：
通过超滤方法，将步骤（3）的反应体系2的反应液经过滤器E2的进料口至过滤器E2过滤分离GSH II酶，过滤器E2内装膜包（购于Pall公司，截留分子量10kDa），从滤器E2的出料口流出的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
（5）分离产物谷胱甘肽：
使用盐酸调节滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质。
使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱GSH，GSH产量共计600g，收率可达90%。
（6）在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分离生成的ATP：
将步骤（5）的穿出液在蒸馏塔中减压蒸馏浓缩约5倍，至ATP、ADP和/或AMP约0.4M后，将其含有的ADP和/或AMP在50℃、PH值为4.0的条件下在再生反应体系中再生为ATP，所述再生反应体系为：20L无菌水中包含1200g葡萄糖、400g氯化镁、15g氯化钾、1200g氯化钠、680ml 85%H3PO4和1200g干燥处理过的酿酒酵母，加NaOH调pH至4.0。3小时后，ATP再生转化率为85%以上。HPLC检测条件同上述实施例2中的步骤（6）。
再生的ATP在离心机中以5000rpm转速通过离心分离。
（7）反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应，即步骤（1）的连续反应：
将步骤（2）中分离出的GSH I酶经由过滤器E1的回流口添加至反应罐A，
将步骤（6）中再生的ATP约2000g以流加方式添加至反应罐A，
添加完分离的GSH I酶之后，将补加的的反应体系1经由过滤器E1的回流口、过滤器E1、和过滤器E1的进料口添加至反应罐A，以便将过滤器E1中的膜上吸附的少量GSH I酶反冲至反应罐A；
在25℃、PH为5的条件下进行生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；3小时后，HPLC检测γ-谷氨酰半胱氨酸的生成量约为5g/L，50%以上ATP转化为ADP（AMP）。HPLC检测条件同上述步骤（1）。
该步骤中，ATP以及GSH I酶的循环利用。GSH I酶循环反应10次后，酶活性约降低16%，需补加16%新酶。
（8）在过滤器E1中连续分离GSH I酶，即步骤（2）的连续分离：
通过超滤方法，从所述步骤（7）的反应体系1的反应液中分离出GSH I酶，经过滤器E1的滤出液1为分离出GSH I酶之后的反应体系1的反应液。
（9）反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应，即步骤（3）的连续反应：
将步骤（4）中分离出的GSH II酶经由过滤器E2的回流口添加至反应罐B；
将步骤（6）中再生ATP约2000g以流加方式添加至反应罐B；
添加完分离的GSH II酶之后，将反应体系2（为添加了底物1-10g/L甘氨酸的步骤（2）的连续分离步骤，即步骤（8）的滤出液1）经由过滤器E2的回流口、过滤器E2、和过滤器E2的进料口添加至反应罐B，以便将膜包中吸附的少量GSH II酶反冲至反应罐B；
在25℃、PH为5的条件下进行反应生成谷胱甘肽的连续反应；2.5小时后，HPLC检测GSH的生成量约为6.6g/L，55%以上ATP转化为ADP（AMP）。
在该步骤中，实现了ATP以及GSH II的循环利用。GSH II循环反应10次后，酶活性约降低13%，需补加13%新酶。
（10）在过滤器E2中连续分离GSH II酶，即步骤（4）的连续分离：
通过超滤方法，从步骤（3）的连续反应步骤，即步骤（9）的反应体系2的反应液中分离出GSH II酶，经过滤器E2的滤出液2为分离出GSH II酶之后的反应体系2的反应液。
（11）分离产物谷胱甘肽，即步骤（5）的连续分离：
使用盐酸调节步骤（4）的连续分离步骤，即步骤（10）的滤出液2的pH值至3.0，在离子交换柱中通过D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（购于天津树脂厂），溶液中的GSH、部分氨基酸及阳离子被吸附，穿出液中含有ATP、ADP和/或AMP等物质。使用0.2M NaOH、0-0.8M NaCl梯度洗脱GSH，GSH产量共计600g，收率可达90%。
重复步骤（6）至步骤（11）9次。
对比例1
在100L无菌水中，加入600g谷氨酸、400g半胱氨酸、300g甘氨酸、600g Tris、1100g氯化钾、870g氯化钠、800g氯化镁，加氢氧化钾调节pH值至8.5，加入5g GSH I、5g GSH II，流加ATP开始反应。反应期间控制pH恒定为8.5，温度为37℃。3小时后，ATP用量约为2400g，HPLC检测GSH的生成量约为2.5g/L，共计600g，30%以上ATP转化为ADP（AMP），HPLC检测条件同上述实施例2中步骤（1）。
从对比例1可以看出，由于GSH I与GSH II反应条件例如温度、时间等略有不同，以及GSH对GSH I的抑制作用，两种酶放在一起催化底物生成GSH的产量低于本发明方法中将两种酶分开反应的产量。
本领域的技术人员应能理解，在实际应用中，在本发明的启示下，其他人员也可能作出与本发明相似的设计或对本发明进行一些添加或改变。特别需要指出的是，只要不脱离本发明的设计宗旨，所有显而易见的改变以及具有等同替换的相似设计，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
(1)在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸；
(2)在过滤器E1中分离GSH I酶；
(3)在反应罐B中生成谷胱甘肽；
(4)在过滤器E2中分离GSH II酶；以及
(5)分离产物GSH。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：
(6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ATP，并分离生成的ATP。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括以下步骤：
(7)所述步骤(2)中分离的GSH I酶的循环利用，即将分离的GSH I酶添加至反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；以及
(8)GSH I酶的连续分离，即在过滤器E1中连续分离GSH I酶。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括以下步骤：
(9)所述步骤(4)中分离的GSH II酶的循环利用，即将分离的GSH II酶添加至反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应；以及
(10)GSH II酶的连续分离，即在过滤器E2中连续分离GSH II酶。
5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括以下步骤：
(11)产物GSH的连续分离。
6.根据权利要求5所述的方法，循环利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重复所述步骤(6)至所述步骤(11)至少一次，重复多次。
7.根据权利要求6所述的方法，在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应如下：
反应温度为25-60℃；
反应PH为5-10的条件下；
反应体系1为含有底物谷氨酸或其盐和半胱氨酸或其盐、以及镁离子、钾离子、钠离子和Tris的水溶液；
在反应体系1中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分离的GSHI酶，反应一段时间生成γ-谷氨酰半胱氨酸；
其中所述镁离子源自氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁或硝酸镁中的一种或多种；所述钾离子源自氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾或柠檬酸钾中的一种或多种；所述钠离子源自氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法，在反应罐B中生成谷胱甘肽的反应如下：
反应温度为25-60℃；
反应PH为5-10的条件下；
反应体系2为添加了底物甘氨酸或其盐的所述步骤(2)的滤出液1；
在反应体系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分离的GSHII酶，反应一段时间生成谷胱甘肽。
9.根据权利要求2所述的方法，在再生罐C中的再生反应如下：
反应温度为25-50℃；
反应PH为4-9；
再生反应体系为包含葡萄糖、酵母、镁离子、钾离子、钠离子和磷酸根离子的水溶液；
向再生罐C中添加的ADP和/或AMP为所述步骤(5)分离出产物GSH之后的反应液的浓缩液；
在再生罐C反应一段时间生成再生的ATP，再生的ATP通过离心或过滤方法分离；
其中所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或毕赤酵母(Pichia pastoris)，所述磷酸根离子源自：磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸钠或磷酸钾中的一种或多种。
10.根据权利要求4所述的方法，过滤器E1或E2具有进料口、出料口和回流口，内设过滤膜，在循环利用GSH I酶或GSH II酶时，反应体系通过过滤器E1或E2添加至反应罐的方式如下：
向反应罐A或反应罐B中添加完分离的GSH I酶或GSH II酶之后，将补加的反应体系1的反应液或反应体系2的反应液经过滤器E1或过滤器E2的回流口、过滤器E1或E2、和过滤器E1或E2的进料口添加至反应罐A或反应罐B。
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