CN110408667A - 一种提高β-胸苷产量的发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高β‑胸苷产量的发酵工艺，它是将β‑胸苷的生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有β‑胸苷的发酵液，所述的生产培养基包含如下组分：葡萄糖2‑10g/L，六偏磷酸钠0‑4g/L，磷酸二氢钾1‑5g/L，磷酸氢二铵1‑5g/L，氯化钙0.2‑0.8g/L，柠檬酸0.3‑0.8g/L，甘氨酸2.5‑5g/L，酵母粉10‑30g/L，脱脂豆粉10‑30g/L，植物源蛋白粉0.5‑3g/L，氯化钙0‑5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L。该工艺培养基配方合理，可实现高密度发酵培养，成本低，产量高。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，尤其是一种提高β-胸苷产量的发酵工艺。
背景技术
β-胸苷，又称2’-脱氧胸腺嘧啶核苷，是抗艾滋病齐多夫定、司他夫定的关键中间体。
随着全球艾滋病感染人群数量急剧增加，作为“鸡尾酒”疗法中最基本成分的齐多夫定需求量与日俱增，开发廉价、大规模生产β-胸苷的工艺技术得到广泛关注。传统的合成法生产工艺过程冗长，且需要使用大量的有机溶剂，生产过程中存在安全隐患。上海创诺医药集团自主研发并构建生产β-胸苷的大肠杆菌工程菌株CN108300727A，5L发酵罐β-胸苷单位达到6.5g/L，并在放大过程中达到10.0g/L的生产水平。
现有技术中，本公司目前使用的β-胸苷生产培养基，这里我们称之为β-胸苷的对照生产培养基，它的配方为：葡萄糖2.5g/L，六偏磷酸钠4g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二铵4g/L，氯化钙0.5g/L，柠檬酸0.5g/L，甘氨酸3g/L，酵母粉20g/L，脱脂豆粉30g/L，胰蛋白胨2g/L，碳酸钙5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L。该生产培养基的缺点是配方中无机盐添加量较多、固体不溶培养基比例较大，导致现有提取过程中固液分离和树脂除盐负荷增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高β-胸苷产量的发酵工艺，该工艺培养基配方合理，可实现高密度发酵培养，成本低，产量高。
本发明的技术方案是这样实现的：一种提高β-胸苷产量的发酵工艺，它是将β-胸苷的生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有β-胸苷的发酵液，其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：葡萄糖2-10g/L，六偏磷酸钠0-4g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，磷酸氢二铵1-5g/L，氯化钙0.2-0.8g/L，柠檬酸0.3-0.8g/L，甘氨酸2.5-5g/L，酵母粉10-30g/L，脱脂豆粉10-30g/L，植物源蛋白粉0.5-3g/L，氯化钙0-5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L。
进一步，所述的酵母粉为酿酒酵母粉或者面包酵母粉。
进一步，所述的植物源蛋白粉是大豆蛋白胨、小麦水解蛋白、植物多肽粉中的一种或者多种。
进一步，所述的消泡剂为聚醚类消泡剂。
进一步，在发酵过程中，按时间梯度补加葡萄糖，在各时间段补加葡萄糖的浓度为：6hr-10hr，2-5g/L/hr；10hr-16hr，3-6g/L/hr；16-40hr，4-8g/L/hr；40hr-放罐，6-10g/L/hr。
进一步，发酵过程中补料用的葡萄糖是50％-70％的葡萄糖溶液。
本发明和现有技术相比的优点为：
(1)磷元素是构成菌体核酸、核蛋白等细胞质的组成部分，是许多高能磷酸键和辅酶的成分，同时磷酸盐对培养基pH的缓冲起到一定作用。原配方中的六偏磷酸钠价格偏贵且不易获取，本发明通过对发酵配方中的其他磷酸盐调整，减少或者去除六偏磷酸钠，达到降低成本和培养基盐分的目的。
(2)胰蛋白胨含有丰富的氮源和氨基酸，是微生物生长代谢的重要氮源，由于进口胰蛋白胨价格昂贵，国产胰蛋白胨一般通过动物源的肉质或者骨头经过胰酶消化获得，存在TSE/BSE风险。本发明通过使用植物蛋白源，通过平衡植物蛋白源中的总氮和氨基氮，达到替代动物源蛋白胨的目的。
(3)碳酸钙在发酵培养基中起着缓冲pH的作用。本发明通过优化发酵配方中磷酸盐浓度，减少或者去除碳酸钙，达到减少发酵配方中不溶固形物的目的，从而降低下游提纯中固液分离的难度。
(4)大肠杆菌以葡萄糖作为碳源的发酵过程中，葡萄糖补加过慢会导致菌体碳源匮乏，从而菌体生长和合成代谢营养不足；葡萄糖补加过快会导致发酵液中残留葡萄糖积累，大肠杆菌代谢产生乙酸，进而影响菌体生长速率和代谢方向。该发明通过建立梯度补料策略，在确保发酵液中葡萄糖浓度残留很低的情况下，保证碳源充足，进而提高菌体浓度，增加β-胸苷的发酵单位。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：将β-胸苷的菌种接种于如下种子培养基中，葡萄糖2.5g/L，甘油5g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸铵1.5g/L，消泡剂0.15ml/L，培养6-8小时后，取样检测，OD值(吸光度)达到1.0-1.2，pH值6.0-6.5，镜检菌体形态均匀、整齐、量大，无杂菌，符合优良种子移种条件。
将本实施例制得的优良种子接种到背景技术中所述的β-胸苷的对照生产培养基中，培养63小时放罐，检测发酵液中电导率，固含量，菌体OD值和β-胸苷含量。
实施例2：采用例1中的优良种子，移种到如下发酵培养基中，葡萄糖8g/L，六偏磷酸钠2g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二铵4g/L，氯化钙0.8g/L，柠檬酸0.3g/L，甘氨酸5g/L，酵母粉20g/L，脱脂豆粉20g/L，大豆蛋白胨1.5g/L，小麦水解蛋白0.5g/L，氯化钙0.5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L，培养65小时放罐，检测发酵液中电导率，固含量，菌体OD值和β-胸苷含量。
实施例3：采用例1中的优良种子，移种到如下发酵培养基中，葡萄糖2g/L，磷酸二氢钾5g/L，磷酸氢二铵5g/L，氯化钙0.3g/L，柠檬酸0.3g/L，甘氨酸4g/L，酵母粉15g/L，脱脂豆粉20g/L，小麦水解蛋白1.5g/L，植物多肽粉1.5g/L，氯化钙0.5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L，培养65小时放罐，检测发酵液中电导率，固含量，菌体OD值和β-胸苷含量。
实施例4：采用例1中的优良种子，移种到如下发酵培养基中，葡萄糖5g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二铵4g/L，氯化钙0.3g/L，柠檬酸0.3g/L，甘氨酸5g/L，酵母粉25g/L，脱脂豆粉15g/L，大豆蛋白胨2.5g/L，氯化钙0.5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L，培养66小时放罐，检测发酵液中电导率，固含量，菌体OD值和β-胸苷含量。
实施例5：采用例1中的优良种子，移种到如下发酵培养基中，葡萄糖5g/L，磷酸二氢钾4g/L，磷酸氢二铵4g/L，氯化钙0.3g/L，柠檬酸0.3g/L，甘氨酸5g/L，酵母粉15g/L，脱脂豆粉25g/L，小麦水解蛋白2.5g/L，氯化钙0.5g/L，维生素B10.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L，培养62小时放罐，检测发酵液中电导率，固含量，菌体OD值和β-胸苷含量。
表一：实施例1-5发酵液中电导率、固含量、菌体OD值和β-胸苷含量。
| 组别 | 电导率us/cm | 固含量％ | OD值 | β-胸苷含量g/L |
| 实施例1 | 8325 | 28.5 | 68.5 | 10.25 |
| 实施例2 | 7674 | 27.7 | 64.2 | 10.75 |
| 实施例3 | 7524 | 26.5 | 65.8 | 11.23 |
| 实施例4 | 6658 | 26.8 | 66.6 | 11.05 |
| 实施例5 | 6749 | 26.0 | 63.8 | 10.58 |
实施例6：采用例1中的优良种子，例3中的发酵配方，补料策略为：6hr-10hr，4.2g/L/hr；10hr-16hr，4.8g/L/hr；16-40hr，5.8g/L/hr；40hr-放罐，7.8g/L/hr，培养65小时放罐，检测发酵液中的菌体OD值，β-胸苷含量。
实施例7：采用例1中的优良种子，例3中的发酵配方，补料策略为：6hr-10hr，4.8g/L/hr；10hr-16hr，5.2g/L/hr；16-40hr，6.8g/L/hr；40hr-放罐，7.0g/L/hr，培养65小时放罐，检测发酵液中的菌体OD值，β-胸苷含量。
实施例8：采用例1中的优良种子，例4中的发酵配方，补料策略为：6hr-10hr，2.5g/L/hr；10hr-16hr，4.5g/L/hr；16-40hr，5.3g/L/hr；40hr-放罐，6.2g/L/hr，培养65小时放罐，检测发酵液中的菌体OD值，β-胸苷含量。
实施例9：采用例1中的优良种子，例4中的发酵配方，补料策略为：6hr-10hr，5.0g/L/hr；10hr-16hr，6.0g/L/hr；16-40hr，6.6g/L/hr；40hr-放罐，7.7g/L/hr，培养65小时放罐，检测发酵液中的菌体OD值，β-胸苷含量。
实施例10：采用例1中的优良种子，例5中的发酵配方，补料策略为：6hr-10hr，4.2g/L/hr；10hr-16hr，4.8g/L/hr；16-40hr，5.8g/L/hr；40hr-放罐，7.8g/L/hr，培养65小时放罐，检测发酵液中的菌体OD值，β-胸苷含量。
表二：实施例6-10发酵液中菌体OD值和β-胸苷含量。
| 组别 | OD值 | β-胸苷含量g/L |
| 实施例6 | 83.2 | 13.57 |
| 实施例7 | 89.5 | 14.02 |
| 实施例8 | 80.5 | 12.78 |
| 实施例9 | 91.5 | 14.22 |
| 实施例10 | 82.5 | 13.11 |
Claims (6)
1.一种提高β-胸苷产量的发酵工艺，它是将β-胸苷的生产菌种接种到生产培养基上，经过发酵培养，制得含有β-胸苷的发酵液，其特征在于：所述的生产培养基包含如下组分：葡萄糖2-10g/L，六偏磷酸钠0-4g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，磷酸氢二铵1-5g/L，氯化钙0.2-0.8g/L，柠檬酸0.3-0.8g/L，甘氨酸2.5-5g/L，酵母粉10-30g/L，脱脂豆粉10-30g/L，植物源蛋白粉0.5-3g/L，氯化钙0-5g/L，维生素B1 0.01g/L，烟酸0.01g/L，三氯化铁0.03g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，消泡剂0.15ml/L。
2.根据权利要求1所述的提高β-胸苷产量的发酵工艺，其特征在于：所述的酵母粉为酿酒酵母粉或者面包酵母粉。
3.根据权利要求2所述的提高β-胸苷产量的发酵工艺，其特征在于：所述的植物源蛋白粉是大豆蛋白胨、小麦水解蛋白、植物多肽粉中的一种或者多种。
4.根据权利要求3所述的提高β-胸苷产量的发酵工艺，其特征在于：所述的消泡剂为聚醚类消泡剂。
5.根据权利要求4所述的提高β-胸苷产量的发酵工艺，其特征在于：在发酵过程中，按时间梯度补加葡萄糖，在各时间段补加葡萄糖的浓度为：6hr-10hr，2-5g/L/hr；10hr-16hr，3-6g/L/hr；16-40hr，4-8g/L/hr；40hr-放罐，6-10g/L/hr。
6.根据权利要求5所述的提高β-胸苷产量的发酵工艺，其特征在于：发酵过程中补料用的葡萄糖是50％-70％的葡萄糖溶液。
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