CN103184172A - 一种大肠杆菌高密度培养的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明一种大肠杆菌高密度培养的培养基属于生物领域,本发明的批培养基每升包含有下列配比组分:酵母提取物5.00g/L,甘油7.75ml/L,硫酸铵3.0g/L,磷酸氢二钠6.0g/L,磷酸二氢钾3.0g/L,柠檬酸1.7g/L,硫酸镁1.2g/L,培养基用1Mol/LNaOH等碱性溶液调pH值至6.8。补料培养基每升包含有下列配比组分:酵母提取物40g/l;甘油631g/l;二水钼酸钠0.02g/l;七水硫酸镁2.0g/l;五水硫酸铜0.007g/l;二水氯化钙0.665g/l;六水氯化钴0.007g/l;六水氯化铁0.20g/l;硼酸0.002g/l;七水硫酸锌0.05g/l;生物素 0.002g/l;一水硫酸锰0.04g/l;盐酸1.25ml/l;谷氨酸钠5.0g/l。本发明的培养基能显著提高大肠杆菌工程菌发酵密度,同时不降低每单位菌体蛋白表达量。提高目的蛋白表达总量,可减少试剂的消耗,节约成本。
Description
技术领域
本发明:一种大肠杆菌高密度培养的培养基属于生物领域,特别是涉及一种培养基。
背景技术
随着生物制药的发展,利用重组DNA技术克隆大肠杆菌制得的工程菌,生产生物药数量越来越多,为生物技术获得生物药物产品的主要途径。
一般情况下,生物药物的产率与大肠杆菌发酵密度密切相关,大肠杆菌的收率直接关系到生物药物的产率。所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下,大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的生产成本。特别是在同样的纯化技术条件下。
不断有学者进行这方面的研究,如根据化学计量模式(stoichiometric model)的方法重新对培养基配方进行设计和优化。在发酵策略方面,为了提高细菌发酵密度,发酵工艺普遍采用补料-分批发酵(fed-batch)的方式提高菌体生长密度和目标产物的表达总量。
有必要开发出一种适用于工程菌高密度发酵培养的培养基。对于不同生物工程菌有不同的高密度发酵配方。我们开发了一种新的大肠杆菌高密度发酵配方。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工程菌高密度发酵培养的培养基。
本发明的目的是通过以下措施来达到的,本发明的培养基每升包含有下列配比组分:
表一:批培养基:
成分 | 浓度 |
酵母提取物(yeast extract) | 5.00 g/L |
甘油 (glycerol) | 7.75 ml/L |
硫酸铵((NH4)2SO4 ) | 3.0g/L |
磷酸氢二钠(Na2HPO4) | 6.0 g/L |
磷酸二氢钾(KH2PO4 ) | 3.0 g/L |
柠檬酸 (citric acid) | 1.7 g/L |
硫酸镁(MgSO4) | 1.2 g/L |
表二:补料培养基:
成分 | 浓度 |
酵母提取物(Yeast extract) | 40 g/l |
甘油(Glycerol 100%) | 631 g/l = 513 ml/l |
二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) | 0.02 g/l |
七水硫酸镁(MgSO4.7H2O) | 2.0 g/l |
五水硫酸铜(CuSO4.5H2O) | 0.007 g/l |
二水氯化钙(CaCl2.2H2O) | 0.665 g/l |
六水氯化钴(CoCl2.6H2O) | 0.007 g/l |
六水氯化铁(FeCl3.6H2O) | 0.20 g/l |
硼酸(H3BO3) | 0.002 g/l |
七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O) | 0.05 g/l |
生物素(Biotine) | 0.002 g/l |
一水硫酸锰(MnSO4.H2O) | 0.04 g/l |
盐酸(HCl 37% ) | 1.25 ml/l |
谷氨酸钠(Glutamate de Na) | 5.0 g/l |
其中,酵母提取物(yeast extract)为法国Springer公司产品,型号:Springer?0251/0–MG–L。
在使用本发明的培养基进行发酵时,按上述配比组分配制的批培养基,在补料发酵阶段添加补料培养基,补料量阶梯上升。
在使用本发明的培养基发酵时,按上述配比组分配制的培养基,在补料-分批发酵(fed-batch fermentation )模式下,与补料培养基联用。
本发明的培养基在不影响目的蛋白表达情况下,能显著提高大肠杆菌工程菌发酵密度,从而提高蛋白表达总量,可减少试剂的消耗,节约成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例:按照本发明配方配制的培养基大规模发酵工艺研究实验
(1)发酵采用fed-batch模式,发酵罐50L(德国B. Braun公司产品),发酵培养基按具体实施例配方表一配制,配45L,发酵罐原位灭菌后备用。
补料培养基配方如表二:共配4L,灭菌备用。
(2)实验过程如下:
① 摇瓶培养:所用培养基为本发明的培养基,用冻存菌种接种于摇瓶培养基中,30℃剧烈振荡16hr至对数生长期(A650为2.8)。取40ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中,开始进行补料培养(fed-batch)模式的发酵培养。
② 批培养阶段:接种后首先为批培养阶段。在批培养阶段,温度控制在30oC;通过补加10%浓氨水溶液和10%磷酸溶液控制pH值在6.80;溶氧控制在18%左右,开始阶段搅拌速度设为200rpm,通气量为75 L/min。当溶氧水平低于阈值18%时,搅拌速度与溶氧18%偶联,在批培养阶段搅拌速度最高值设为700 rpm。在批培养阶段后期由于氧供应不足溶氧将会下降,最低至2%左右。批培养末期营养组分将消耗尽,此时工程菌代谢将趋于停止,故溶氧值将在短期内跃升,此时发酵开始进入补料培养阶段 。
③ 在补料阶段,溶氧值依然控制在18%左右并与转速偶联,直至达到最高转速(700rpm);在fed 阶段,补料开始后两小时,进行42 oC升温诱导。此时按预设的补料速度进行补料(补料值在4小时内从100g/h线性递增到400g/h,之后补料速度维持在400g/h),在fed 阶段,通气量保存不变,当搅拌速度达到最高转数时,溶氧因供氧矛盾而趋于下降,42 oC升温诱导4小时后进行收菌。
④ 在发酵过程中,每隔1 h取样 ,检测菌密度。菌密度的测定采用紫外分光光度计测定650nm波长的 A值。
实验结果见表3。由结果可知,利用本发明培养基的发酵工艺可制得大量大肠杆菌工程菌菌体。与原发酵培养基配方相比,在蛋白表达量的相当的情况下,菌体得率提高了三倍。从而使每批纯化后蛋白收获量提高了三倍。结果如表三。
表三(DH5α/GM-CSF)
Claims (3)
1.一种大肠杆菌高密度培养的培养基,特征:每升批培养基包含下列配比组分:
酵母提取物 5.00 g/L
甘油 7.75 ml/L
硫酸铵 3.0g/L
磷酸氢二钠 6.0 g/L
磷酸二氢钾 3.0 g/L
柠檬酸 1.7 g/L
硫酸镁 1.2 g/L
培养基用1 Mol/L NaOH等碱性溶液调pH值至6.8
每升补料培养基包含有下列配比组分:
酵母提取物(Yeast extract) 40 g/l
甘油(Glycerol 100%) 631 g/l = 513 ml/l
二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 0.02 g/l
七水硫酸镁(MgSO4.7H2O) 2.0 g/l
五水硫酸铜(CuSO4.5H2O) 0.007 g/l
二水氯化钙(CaCl2.2H2O) 0.665 g/l
六水氯化钴(CoCl2.6H2O) 0.007 g/l
六水氯化铁(FeCl3.6H2O) 0.20 g/l
硼酸(H3BO3) 0.002 g/l
七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O) 0.05 g/l
生物素(Biotine) 0.002 g/l
一水硫酸锰(MnSO4.H2O) 0.04 g/l
盐酸(HCl 37%) 1.25 ml/l
谷氨酸钠(Glutamate de Na) 5.0 g/l。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌高密度培养的培养基,其特征是在分批发酵模式下单独用于大肠杆菌工程菌的高密度发酵培养。
3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌高密度培养的培养基,其特征是在补料-分批发酵模式下,与补料培养基联用,可用大肠杆菌工程菌高密度发酵培养。
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