CN111073836A - 大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。所述发酵培养基包括组分:酵母提取物10‑12g/L、磷酸氢二钠3‑4g/L、磷酸二氢钾11.5‑13.5g/L、硫酸铵1.5‑2.5g/L、氯化铵0.5‑1.0g/L、柠檬酸钠1.0‑2.0g/L、葡萄糖10‑12g/L和七水硫酸镁1.0‑1.5g/L。本发明仅采用酵母提取物作为大肠杆菌发酵培养过程中的主要氮源,通过对发酵培养过程中的各种参数优化控制,获得目的蛋白的高效表达,可收获大量的生物产物。利用本发明提供的大肠杆菌发酵培养基,培养得到的生物湿菌产量不低于常规培养基,经过发酵过程的优化,生物湿菌产量可由20g/L提高至30g/L。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌发酵领域,具体地说,涉及一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。
背景技术
目前,常规的大肠杆菌发酵培养用培养基营养成分中均含有蛋白胨及酵母提取物。由于动物源蛋白胨引入的外源因子对人用产品可能带来风险。因此,在利用大肠杆菌制备的药物申报中限制使用动物源的蛋白胨,而采用植物源的蛋白胨进行发酵培养后,降低了目的蛋白产量并且增加了生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种不添加动物源和植物源成分的大肠杆菌发酵培养基。
本发明的另一目的是提供上述培养基发酵培养大肠杆菌的方法。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种大肠杆菌发酵培养基,包括如下组分:酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。
优选地,所述大肠杆菌发酵培养基包括如下组分:酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。
第二方面,本发明提供所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。
第三方面,本发明提供一种大肠杆菌发酵培养方法,包括以下步骤:
1)一级种子制备;
2)二级种子制备;
3)将二级种子接入所述发酵培养基中,进行发酵培养。
本发明中,所述大肠杆菌可以是利用基因工程手段改造得到的工程菌,例如,表达重组结核杆菌变态反应原(结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC)的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3),其构建方法可参见CN110423279A。
前述的方法,步骤1)包括:取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养8-10小时,得到一级种子。
其中,所述基础培养基的配方为:酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。
步骤2)包括:按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200ml基础培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养14-16小时,得到二级种子。
步骤3)包括:按10%v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中,装液量2.5L/5L,在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min,溶氧30%,转速200-600rpm的条件下进行发酵培养,发酵过程中,将发酵体系的pH值控制在7.0;待菌液OD600值为8-12,加入IPTG至终浓度为0.2mM,诱导4-6小时后,结束发酵,离心收获菌体。
进一步地,步骤3)还包括补料操作,具体如下:
按10%v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中,装液量2.5L/5L,在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min,溶氧30%,转速200-600rpm的条件下进行发酵培养,发酵过程中,将发酵体系的pH值控制在7.0;待菌液OD600值大于1.0按如下方式进行补料:
第一次补料采用定时补料方式,向发酵罐中加入补料培养基①,补料量2%-3.6%/L,每小时补加60-85mL,当菌液OD600值大于6.0停止补加补料培养基①,开始第二次补料;第二次补料采用定量补料的方式,向发酵罐中加入补料培养基②,补料量每小时50mL,当菌液OD600值为8-12,进入诱导期;加入IPTG至终浓度为0.2mM,诱导4-6小时后,结束发酵,离心收获菌体;进入诱导期后开始第三次补料,同时加入补料培养基①和补料培养基②,补料培养基①每小时补料3.6%/L,补料培养基②每小时补料50mL,直至发酵结束。
所述补料培养基①为:葡萄糖400-500g/L、硫酸镁10-12g/L和微量元素溶液2mL/L;所述微量元素溶液的配方为:三氯化铁27g/L、六水合氯化钴2g/L、钼酸钠2g/L、氯化钙24.6g/L、无水硫酸铜1g/L、硼酸0.5g/L、三氯化铝10g/L和盐酸100mL/L,其中,盐酸的浓度为36%-38%。
所述补料培养基②为:240g/L酵母提取物溶液。
在本发明的一个具体实施方式中,步骤3)的发酵过程见表1。
表1
其中,补料(1)的成分为:葡萄糖500g/L、硫酸镁10g/L和微量元素溶液2ml/L;定时补料,补料量2%-3.6%/L,每小时补加60-85mL。
补料(2)的成分为:240g/L酵母提取物溶液。定量补料,每小时补料量50mL。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
本发明仅采用酵母提取物作为大肠杆菌发酵培养过程中的主要氮源,通过对发酵培养过程中的各种参数优化控制,获得目的蛋白的高效表达,可收获大量的生物产物。
利用本发明提供的大肠杆菌发酵培养基,培养得到的生物湿菌产量不低于常规培养基(含蛋白胨),经过发酵过程的优化,生物湿菌产量可由20g/L提高至30g/L。目的蛋白产量约2.4~3.0mg/g。
附图说明
图1为本发明实施例1中3个实验组的菌体生长曲线。
图2为本发明实施例1中质粒稳定性检测结果。其中,A:F20190119质粒丢失率检测平板图,B:F20190121质粒丢失率检测平板图,C:F20190123质粒丢失率检测平板图。
图3为本发明实施例1中SDS-PAEG检测菌体蛋白表达情况。其中,1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:无蛋白胨成分培养基,3:动物源成分培养基,4:植物源成分培养基。
图4为本发明实施例1中SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果。其中,1:蛋白Marker,2:无蛋白胨成分培养基,3:动物源成分培养基,4:植物源成分培养基。
图5为本发明实施例2中3个菌种的菌体生长曲线。
图6为本发明实施例2中质粒稳定性检测结果。其中,A:菌种1质粒丢失率检测平板图,B:菌种2质粒丢失率检测平板图,C:菌种3质粒丢失率检测平板图。
图7为本发明实施例2中SDS-PAEG检测菌体蛋白表达情况。其中,45菌体蛋白表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:45菌体蛋白,rEC菌体蛋白表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:rEC菌体蛋白,EECC菌体蛋白表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:EECC菌体蛋白。
图8为本发明实施例2中SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果。其中,45菌体表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:45蛋白,rEC蛋白表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:rEC蛋白,EECC蛋白表达情况1:蛋白Marker,从上至下依次为98、66.2、45、31、20、14.4kD,2:EECC蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1
1、实验目的
通过发酵培养基成分中蛋白胨差异(动物源、植物源及不含有蛋白胨),比较三种发酵培养基对表达重组结核杆菌变态反应原的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)的菌体产量、目的蛋白含量及质粒丢失的影响。
2、培养基及试剂配方列表:
3、试验设备:
4、实验方法
包括3个实验组,第1组为无蛋白胨发酵培养组,第2组为植物源发酵培养组,第3组为动物源发酵培养组。其中,一级种子制备、二级种子制备以及发酵培养所用培养基如下:
培养基 | 第1组 | 第2组 | 第3组 |
一级种子制备 | 基础培养基 | 基础培养基 | 基础培养基 |
二级种子制备 | 基础培养基 | 含大豆蛋白胨的扩增培养基 | 含胰蛋白胨的扩增培养基 |
发酵培养 | 发酵培养基1 | 发酵培养基2 | 发酵培养基3 |
4.1重组菌活化、扩增
4.1.1从-80℃冰箱中取出表达重组结核杆菌变态反应原(结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC)的重组大肠杆菌菌种(pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌,参见CN110423279A);
4.1.2一级种子制备:在生物安全柜中,菌种室温自然融化,取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中,放置大容量全温振荡器中,37℃、200rpm振荡培养8-10小时,得到一级种子。
其中,基础培养基的配方为:酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2g/L和卡那霉素50mg/L。
4.1.3二级种子制备:按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200ml基础培养基或扩增培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养14-16小时,得到二级种子。
扩增培养基包括:含大豆蛋白胨的扩增培养基以及含胰蛋白胨的扩增培养基,它们的成分分别如下:
含大豆蛋白胨的扩增培养基:大豆蛋白胨6-8g/L、酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L。
含胰蛋白胨的扩增培养基:胰蛋白胨6-8g/L、酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L。
4.2发酵培养及诱导表达
4.2.1 pH电极校正,5L发酵罐装液量2.5L,发酵培养基121℃、30min灭菌待用。
4.2.2灭菌结束,连接各路进出阀门,电极等部位,进行溶氧0点校正,转数提高到600rpm进行溶氧100%校正。
4.2.3设定发酵培养温度37℃、通气量2NL/min,溶氧30%,转速200rpm,pH7.0,按照10%v/v的比例取三角瓶扩增菌液(二级种子)在火焰保护下于接种口加入至发酵罐中培养,同时将分别灭菌的葡萄糖溶液、硫酸镁溶液及微量元素加至发酵罐中。接种后取样检测接OD600值。
4.2.4在pH项下设定关联酸碱泵,pH值设定为7.0,将酸碱泵调到自动位;在溶氧项设定溶氧30%,关联通气量和搅拌。其中最大通气量为4NL/min,最高转速600rpm。发酵1小时后开始取样,每小时1次(接近诱导值或发酵结束时取样频繁),检测OD值,OD600在8-12之间,将温度降至30℃,待温度稳定后,按照培养体积加入1M IPTG至终浓度为0.2mmol/L,进行诱导,诱导时间4-6小时,终止发酵,离心收获菌体。
5、试验结果
5.1第1组(无蛋白胨)发酵培养结果如下:
5.2第2组(动物源)发酵培养结果如下:
5.3第3组(植物源)发酵培养结果如下:
3个实验组的菌体生长曲线见图1。
生物量检测(1000ml菌体的菌体湿重)结果见表2。
表2
组别 | 批号 | 菌体湿重(g) |
第1组 | F20190119(无蛋白胨) | 29g |
第2组 | F20190121(动物源) | 26.4g |
第3组 | F20190123(植物源) | 26.6g |
质粒稳定性检测结果见图2(A-C)。质粒丢失率见表3。
表3
SDS-PAEG检测各组菌体目的蛋白表达情况见图3,SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果见图4和表6。目的蛋白表达率、目的蛋白产量分别见表4和表5。
表4
组别 | 批号 | 目的蛋白表达率(%) |
第1组 | F20190119(无蛋白胨) | 11 |
第2组 | F20190121(动物源) | 12 |
第3组 | F20190123(植物源) | 9 |
表5
组别 | 批号 | 硫酸铵沉淀蛋白产量(g/10g湿菌) |
第1组 | F20190119(无蛋白胨) | 3.0 |
第2组 | F20190121(动物源) | 5.9 |
第3组 | F20190123(植物源) | 6.0 |
表6
组别 | 批号 | 硫酸铵沉淀蛋白纯度(%) |
第1组 | F20190119(无蛋白胨) | 24 |
第2组 | F20190121(动物源) | 20 |
第3组 | F20190123(植物源) | 14 |
三种培养基相同克数湿菌,经硫酸铵沉淀后收获的目的蛋白量动物源和植物源相差甚微,无蛋白胨成分培养基发酵培养的结果低于含有蛋白胨的实验组,但无蛋白胨成分培养基发酵培养的质粒保有率高,菌体湿重收获量高,相同湿重硫酸铵沉淀后目的纯度、蛋白回收率高,并且菌体蛋白表达率和动物源发酵培养的相当,同时可降低生产成本,因此优选无蛋白胨成分培养基作为工艺生产用发酵培养。选用无蛋白胨成分培养发酵培养菌体湿重在30g/L左右。
本发明提供的发酵培养方法和培养基配方,能够使大肠杆菌产生的蛋白在没有动、植物源蛋白胨的情况下高效表达,适合于规模化生产的需要。
实施例2
1、实验目的
通过3种不同的重组蛋白,采用本发明的发酵培养方法,以考察本方法是否具有针对表达重组制品大肠杆菌发酵培养的普适性。
2、培养基及试剂配方列表:
3、试验设备:
4、实验方法
包括3个实验组,第1组为表达重组结核杆菌变态反应原大肠杆菌(pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌)发酵组,第2组为表达重组结核杆菌融合蛋白rEc大肠杆菌(pET28a-rEC/BL21(DE3)工程菌)发酵组,第3组为重组结核杆菌Rv2645大肠杆菌(pET28a-Rv2645/BL21(DE3)工程菌)发酵组。其中,一级种子制备、二级种子制备以及发酵培养所用培养基如下:
培养基 | 第1组 | 第2组 | 第3组 |
一级种子制备 | 基础培养基 | 基础培养基 | 基础培养基 |
二级种子制备 | 基础培养基 | 基础培养基 | 基础培养基 |
发酵培养 | 发酵培养基 | 发酵培养基 | 发酵培养基 |
4.1重组菌活化、扩增
4.1.1从-80℃冰箱中分别取出表达重组结核杆菌变态反应原的重组大肠杆菌菌种(pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌,标记菌种1)、重组结核杆菌rEC的重组大肠杆菌菌种(pET28a-rEC/BL21(DE3)工程菌,标记菌种2)、重组结核杆菌Rv2645大肠杆菌(pET28a-Rv2645/BL21(DE3),工程菌标记菌种3);
4.1.2一级种子制备:在生物安全柜中,菌种室温自然融化,分别取三种菌种200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中,放置大容量全温振荡器中,37℃、200rpm振荡培养8-10小时,得到一级种子。
其中,基础培养基的配方为:酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2g/L和卡那霉素50mg/L。
4.1.3二级种子制备:按1‰v/v的比例将一级种子分别接种至装有200ml基础培养基或扩增培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养14-16小时,得到二级种子。
扩增培养基包括:酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2g/L和卡那霉素50mg/L。
4.2发酵培养及诱导表达
4.2.1 pH电极校正,5L发酵罐装液量2.5L,发酵培养基121℃、30min灭菌待用。
4.2.2灭菌结束,连接各路进出阀门,电极等部位,进行溶氧0点校正,转数提高到600rpm进行溶氧100%校正。
4.2.3设定发酵培养温度37℃、通气量2NL/min,溶氧30%,转速200rpm,pH7.0,按照10%v/v的比例取三角瓶扩增菌液(二级种子)在火焰保护下于接种口加入至发酵罐中培养,同时将分别灭菌的葡萄糖溶液、硫酸镁溶液及微量元素加至发酵罐中。接种后取样检测接OD600值。
4.2.4在pH项下设定关联酸碱泵,pH值设定为7.00,将酸碱泵调到自动位;在溶氧项设定溶氧30%,关联通气量和搅拌。其中最大通气量为4NL/min,最高转速600rpm。发酵1小时后开始取样,每小时1次(接近诱导值或发酵结束时取样频繁),检测OD值,OD600在8-12之间,将温度降至30℃,待温度稳定后,按照培养体积加入1M IPTG至终浓度为0.2mmol/L,进行诱导,诱导时间4-6小时,终止发酵,离心收获菌体。
5、试验结果
5.1第1组(pET28a-EECC/BL21(DE3)工程菌)发酵培养结果如下:
第2组:(pET28a-rEC/BL21(DE3)工程菌)发酵培养结果如下:
第3组:pET28a-Rv2645/BL21(DE3)工程菌发酵培养结果如下:
3个实验组的菌体生长曲线见图5。
生物量检测(1000ml菌体的菌体湿重)结果见表7。
表7
组别 | 批号 | 菌体湿重(g) |
第1组 | F20190119 | 29g |
第2组 | F20190815 | 28.6g |
第3组 | F201900815 | 29.3g |
质粒稳定性检测结果见图6(A-C)。质粒丢失率见表8。
表8
组别 | 批号 | 丢失率(%) |
第1组 | F20190119(EECC) | 0 |
第2组 | F20190(rEC)815 | 0 |
第3组 | F20190(45)815 | 0 |
SDS-PAEG检测各组菌体目的蛋白表达情况见图7,SDS-PAEG检测硫酸铵沉淀蛋白纯度结果见图8和表11。目的蛋白表达率、目的蛋白产量分别见表9和表10。
表9
组别 | 批号 | 目的蛋白表达率(%) |
第1组 | F20190119(EECC) | 11 |
第2组 | F20190121(rEC) | 13 |
第3组 | F20190123(45) | 12 |
表10
组别 | 批号 | 硫酸铵沉淀蛋白产量(g/10g湿菌) |
第1组 | F20190119(EECC) | 3.0 |
第2组 | F20190(rEC)815 | 3.1 |
第3组 | F20190(45)815 | 2.8 |
表11
组别 | 批号 | 硫酸铵沉淀蛋白纯度(%) |
第1组 | F20190119(EECC) | 24 |
第2组 | F20190(rEC)815 | 23.8 |
第3组 | F20190(45)815 | 25.6 |
三种重组蛋白经培养基培养菌体湿重克数基本一致,硫酸铵沉淀后收获的目的蛋白也基本一致。本发明提供的发酵培养方法和培养基配方,能够使大肠杆菌产生的不同种蛋白在没有动、植物源蛋白胨的情况下高效表达,适合于规模化生产的需要。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.大肠杆菌发酵培养基,其特征在于,包括如下组分:酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基,其特征在于,包括如下组分:酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。
3.权利要求1或2所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。
4.大肠杆菌发酵培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)一级种子制备;
2)二级种子制备;
3)将二级种子接入权利要求1所述培养基中,进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述大肠杆菌为表达重组结核杆菌变态反应原的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤1)包括:取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养8-10小时,得到一级种子;
其中,所述基础培养基的配方为:酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤2)包括:按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200mL基础培养基的三角瓶中,37℃、200rpm振荡培养14-16小时,得到二级种子。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤3)包括:按10%v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中,装液量2.5L/5L,在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min,溶氧30%,转速200-600rpm的条件下进行发酵培养,发酵过程中,将发酵体系的pH值控制在7.0;待菌液OD600值为8-12,加入IPTG至终浓度为0.2mM,诱导4-6小时后,结束发酵,离心收获菌体。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤3)还包括补料操作,具体如下:
按10%v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中,装液量2.5L/5L,在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min,溶氧30%,转速200-600rpm的条件下进行发酵培养,发酵过程中,将发酵体系的pH值控制在7.0;待菌液OD600值大于1.0按如下方式进行补料:
第一次补料采用定时补料方式,向发酵罐中加入补料培养基①,补料量2%-3.6%/L,每小时补加60-85mL,当菌液OD600值大于6.0停止补加补料培养基①,开始第二次补料;第二次补料采用定量补料的方式,向发酵罐中加入补料培养基②,补料量每小时50mL,当菌液OD600值为8-12,进入诱导期;加入IPTG至终浓度为0.2mM,诱导4-6小时后,结束发酵,离心收获菌体;进入诱导期后开始第三次补料,同时加入补料培养基①和补料培养基②,补料培养基①每小时补料3.6%/L,补料培养基②每小时补料50mL,直至发酵结束;
所述补料培养基①为:葡萄糖400-500g/L、硫酸镁10-12g/L和微量元素溶液2mL/L;所述微量元素溶液的配方为:三氯化铁27g/L、六水合氯化钴2g/L、钼酸钠2g/L、氯化钙24.6g/L、无水硫酸铜1g/L、硼酸0.5g/L、三氯化铝10g/L和盐酸100mL/L,其中,盐酸的浓度为36%-38%;
所述补料培养基②为:240g/L酵母提取物溶液。
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