CN105695427A - 一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法，所述生物酶为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，包括如下步骤：构建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，将核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转到宿主细胞中。本发明获得的酶催化效率高、生产成本低、而且环保，具有较高的经济价值和市场竞争力。

Description

一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法

技术领域

本发明涉及一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法，属生物技术领域。

背景技术

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。

1888年，GSH首先从酵母中分离出来，目前GSH的主要生产方法有：萃取法、生物发酵法、化学合成法、化学-酶法。

萃取法：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。

生物发酵法：存在着生产菌株中GSH含量较低，提取困难，成本造价高、产率不稳定等问题。

化学合成法：比较复杂，反应步骤多、反应时间长、成本高、操作复杂、可能会发生消旋而影响活性、环境污染等多种不利因素。

化学-酶法合成，即先用化学方法合成S-苄基甘氨酰半胱氨酸，再与谷氨酸在生物催化酶谷氨酰转肽酶的作用下生成GSH：S-苄基-谷胱甘肽的产率受到酶纯度的严重影响，而该酶的分离纯化工作量非常大，成本高。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的上述不足，为解决上述问题，本发明的第一目的在于生产一种催化合成谷胱甘肽的生物酶。

本发明的第二个目的在于提供一种用于催化谷胱甘肽合成的生物酶的基因工程菌株。

本发明的第三个目的在于提供一种编码所述催化合成谷胱甘肽的生物酶的核苷酸序列。

本发明的第四个目的在于提供一种催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法。

本发明的第五个目的在于提供一种催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法。

技术方案：一种催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。

根据上述催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌；

一种编码权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

一种如上述催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，包括如下步骤：

①构建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转到宿主细胞中；

②选用具有氨苄青霉素抗性的质粒，作为基因载体，使构建的基因工程菌获得氨苄青霉素抗性；

③挑选阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基活化培养；

④将③培养好的菌种转移至含氨苄青霉素的葡萄糖、铵盐培养基中，补加氨水，控制pH培养至OD600达到28～32；

⑤将发酵体系温度缓慢降低至23～30℃，补加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）低温诱导；诱导培养过程中根据菌体生长情况补加葡萄糖溶液，维持体系稳定发酵；

⑥诱导培养14～17h，得到发酵液，即催化谷胱甘肽合成的生物酶。

作为优选，所述步骤①中构建基因工程菌表达载体的核苷酸序列；所述步骤②中选用具有氨苄青霉素抗性的质粒作为基因载体；所述步骤①中选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为宿主细胞。

作为优选，所述步骤③、④中使用的培养基中添加了0.02～0.2mg/ml培养基的氨苄青霉素。

作为优选，所述步骤④中培养温度35～38℃，溶氧25～45%，pH6.5～7.5；所述步骤⑤中诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷补加量为0.04～0.4mg/ml发酵液；所述步骤⑥中诱导过程中补加葡萄糖水溶液补加碳源，刺激生长；所述步骤④中诱导温度23～30℃，溶氧20～40%，pH6.5～7.5；所述步骤②中磷酸盐缓冲液中有效成分含量：0.04416%NaH2PO4·H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O。

作为优选，所述步骤③中采用60～80MPa高压均质的方法进行细胞均质破碎两次；所述步骤⑤中采用超滤的方法清除小分子杂质，浓缩酶液，提高有效成分含量；所述步骤⑥中采用物料体系温度控制0～4℃。

一种上述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法，包括如下步骤：

①将上述得到的发酵液离心分离收集菌体；

②配制菌泥三倍质量的磷酸盐缓冲液与菌泥混合均匀；

③菌泥、磷酸盐缓冲液混合均质破碎；

④离心固液分离，将不溶性细胞残渣分离，收集清液，获得催化谷胱甘肽生物合成的中间酶液；

⑤中间酶液超滤浓缩、除杂，获得浓缩酶液；

⑥提取过程①～⑤步骤物料温度维持在0～4℃；

⑦浓缩酶液真空冷冻干燥，获得酶干粉。

作为优选，所述步骤⑦中采用冻干的方法获取酶干粉。

有益的效果：根据本发明所述催化谷胱甘肽合成的生物酶，催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸两步反应，直接转化为谷胱甘肽，转化率100%。

在制备方法步骤②中作为载体的质粒具有氨苄青霉素抗性，在培养基中添加氨苄青霉素，有效避免培养过程中质粒丢失，使培养基具有抗生素降低染菌风险；步骤②中作为载体的质粒具有氨苄青霉素抗性，相对不引入抗性，发酵稳定性有质的提升；步骤②中作为载体的质粒具有氨苄青霉素抗性，产酶量比卡拉霉素抗性增加20倍；步骤③LB液体培养基添加氨苄青霉素量由0.02～0,2mg/ml，优化到0.08～0.12mg/ml，可有效控制菌体裂殖过程中质粒丢失；步骤③LB液体培养基增加试管培养，有效缩短激活时间，加快菌体生长速度；步骤③摇瓶培养温由32～40℃，优化到36.5～37.5℃，有效调和生长速度，菌种活性、老化；步骤④以20～30%工业氨水调节pH6.5～7.5，优化到6.9～7.1，菌体的稳定性最好，抗老化能力最好，同时补充氮源；步骤④控制温度由32～40℃，调整至36.5～37.5℃，培养菌体快速生长，不出现明显老化，维持整个周期较高的生长活力；步骤④增加发酵体系溶氧监控，将发酵体系溶氧控制在25-45%，促进菌体无负担高速裂殖；步骤⑤诱导剂IPTG使用量0.04～0.4mg/ml，优化至0.1～0.15mg/ml，有效诱导菌体代谢产酶，而且菌体生命活性受影响较小，避免菌体过早自溶；步骤⑤诱导温度24～26℃，不影响菌体的生长速度，产酶速度快，菌体生命周期长；步骤⑤诱导培养过程中，溶氧控制20～35%，有效延长培养周期，降低诱导剂对菌体生理影响。步骤⑤诱导培养过程中，pH控制在6.8～7.2；，有效结合产酶速度和菌体的生命周期；步骤⑥葡萄糖溶液浓度55～60%，每升发酵液的补加速度维持6.25g/h确保菌体整个生长周期延长，酶产量增加一倍以上；步骤⑥诱导时间14～16h，菌体量达到最大，酶产量高；步骤⑧磷酸盐缓冲液组分：0.04416%NaH2PO4·H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O，维持稳定的pH值，减少酶活降低；步骤⑧磷酸盐缓冲液质量是菌体质量的3倍，减少酶损失；步骤⑨均质压力60～80MPa，均质两次，确保酶有效释放，与传统超声破碎，酶提取量增加1倍；采用超滤的方法有效清除中间酶液小分子杂质，浓缩，去除80%的小分子杂质及水，降低后续工作量；酶提取过程中由常温提取，优化至将含酶物料降温至0～4℃，酶提取过程中酶损失减少20%；冷冻干燥过程中预冻温度-60℃，二级解冻，真空干燥，不损失酶的前提下有效降低运输、储藏费用一半以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

LB固体培养基：蛋白胨1g、酵母粉0.5g，NaCl1g，琼脂粉2g，定容至100ml，氨苄青霉素10mg。

LB液体培养基：蛋白胨1g、酵母粉0.5g，NaCl1g，定容至100ml，氨苄青霉素10mg。

葡萄糖、铵盐培养基：（NH4）2SO454.6g，酵母粉30g，MgSO4·7H2O108.9g，KH2PO4414g，消泡剂15g，KOH70.5g，定容至30L，氨苄青霉素3g。

实施例1

生物酶的基因工程菌构建

将全基因合成的生物酶基因片段（序列如SEQIDNO:1所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ（购自NewEnglandBiolabs公司，根据说明书进行操作）酶切后重组到大肠杆菌表达载体pET29a相应位点上，得到重组质粒pET29b-GSH。

将构建好的质粒pET29b-GSH用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3),得到基因工程菌BL21(DE3)/pET29b-GSH。

实施例2

生物酶的制备

制备LB固体培养基：电子称称量生物级蛋白胨1g、酵母粉0.5g，工业级NaCl1g，置于200ml烧杯中，加饮用水定容至100ml，搅拌混匀至完全溶解。电子称称量生物级琼脂粉2g加入烧杯中，搅拌混匀，消毒后添加无菌氨苄青霉素。

平板培养：取原菌种在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上划线，恒温培养箱中37℃恒温倒置培养15～17h。

试管培养：从平板上挑选单菌落（直径1～2mm，饱满、光滑，边缘无褶皱）至5～10ml含氨苄青霉素的液体培养基中（蛋白胨1g、酵母粉0.5g，NaCl1g，定容至100ml，氨苄青霉素10mg）37±1℃、转速200rpm，恒温振荡培养5.5～6.5h，取样检测，OD600=0.4～0.6。

摇瓶培养：将培养好的试管菌种接种至300ml含氨苄青霉素的液体培养基中（蛋白胨3g、酵母粉1.5g，NaCl3g，定容至300ml，氨苄青霉素30mg）37±1℃，转速200rpm，恒温振荡培养3.5-4.5h，OD600=1.0～2.0。

发酵罐培养：以10%接种量接种至含有氨苄青霉素的葡萄糖、铵盐培养基中（（NH4）2SO454.6g，酵母粉30g，MgSO4·7H2O108.9g，KH2PO4414g，消泡剂15g，KOH70.5g，定容至30L，氨苄青霉素3g），维持发酵体系的温度在35～38℃恒温培养，培养过程中通过补加氨水，调控发酵体系pH控制在6.5～7.5之间，同时向发酵体系补充氮源；调节通气、罐压、搅拌速度，控制发酵体系的溶氧控制在25～45%，至体系溶氧突变上升，补加60%葡萄糖水溶液，维持体系呈现稳定的生长状况，培养至OD值达到28～32。

降温：将发酵体系缓慢降温至23～30℃，同时控制发酵体系pH：6.5～7.5，溶氧：20～40%；

添加诱导剂：降温至23～30℃，稳定培养30min，添加3.6g诱导剂（IPTG）；

低温诱导培养：补加60%葡萄糖水溶液，控制培养温度25～30℃，发酵体系pH在6.5～7.5；

溶氧20～40%，诱导培养14～17h后发酵液OD值达到70～90准备放罐。

实施例3

生物酶的提取

降温：通过增加发酵罐的罐压，将发酵液压送至储藏容器中，将发酵液降温至0～4℃。

离心：通过高速离心的方法，进行固液分离，收集菌泥。

缓冲液配置：磷酸钠盐缓冲液配制：0.04416%NaH2PO4·H2O和0.60144%Na2HPO4·12H2O混合溶液，称量需要使用磷酸钠盐，在缓冲液配制容器中混匀搅拌至完全溶解，待用。

菌泥混匀：缓冲液质量=菌泥重量×3。添加缓冲液，搅拌混匀至无固形物，搅拌混匀的过程中将体系降温至0～4℃。

高压均质：均质机进料杯中加水，通过调节一级、二级压力阀将均质压力调至75～80MPa，待水出料完毕时，将菌泥混合液过滤倒入均质机进料杯中，开始均质，均质机会自动限定进料速度，取样镜检均质破碎度：均质液稀释10倍，取一滴稀释液滴在载玻片上，均匀涂满整个载玻片，烤干、染色后镜检，一个视野中完整细胞不得超过5个即达到均质破碎要求。将出料口转接至收集容器中，冰浴降温至0～4℃。

二次均质，将均质机增压75～80MPa的压力，取样镜检均质破碎度：均质液稀释10倍，取一滴稀释液滴在载玻片上，均匀涂满整个载玻片，烤干、染色后镜检，一个视野中完整细胞不得超过2个达到均质破碎要求。

降温：均质液搅拌降温至0～4℃。

离心：低温均质液高速离心进行固液分离，收集上清液，得中间酶液。

超滤：将中间酶液降温至0～4℃，开启超滤设备，体积减少约5～6倍，得浓缩酶液。

冻干：将浓缩酶液预冻至-60℃，维持4h，将真空度提升至-0.095MPa以上，温度-10℃真空冻干8h，维持真空度升温至0℃，维持真空干燥，至物料含水量≤5%，得稳定性酶干粉。

SEQIDNO:1

ATGAAATTTAAAGAACTGCTGCAGCAGAAAACCATTCGCCCGTATGTGATGGCGGCGCGCTTTGGCCTGGAAAAAGAAAGCCAGCGCACCACCTTTGATGGCCAGCTGGCGACCACCGATCATCCGGAAGTGCTGGGCAACCGCAGCTATCATCCGTATATTCAGACCGATTTTAGCGAAAGCCAGATGGAACTGATTACCCCGGTGGCGAACAGCATTCATGAAATGATGCGCTATCTGGCGGCGATTCATGATGTGGCGCTGCGCAGCATGAACAAACATGAAATGCTGTGGCCGCTGAGCATGCCGCCGAAACTGCCGCTGAAAGATGAAGATATTAAAATTGCGAAACTGGATCAGTTTGAAGGCATTCTGTATCGCCGCTATCTGGCGCGCGAATATGGCAAACGCAAACAGATGGTGAGCGGCATTCATTTTAACTTTGAATATGATATTGAACTGGTGAAACAGCTGTTTAGCGCGCAGACCGAATATGAAACCATTGAAGAATTTAAAAACATTCTGTATATGAAAGTGAGCCGCAACTATCTGCGCTATCGCTGGCTGATTACCTATCTGTTTGGCGCGAGCCCGGTGAGCGAAAGCGGCTATTTTACCGAACGCGAAGAACGCCCGAAAGAACCGGTGCGCAGCATTCGCAACAGCAGCTTTGGCTATAAAAACAACGAAAACGTGAAAGTGAGCTATGAAAGCCTGCAGCATTATATTGATGATATTCATCGCATGGTGGAAAACGGCATTCTGAGCGAAGAAAAAGAATTTTATAGCGCGGTGCGCCTGCGCGGCGGCAAACAGATGGCGGATCTGCCGAAAACCGGCGTGCGCTATATTGAACTGCGCAACCTGGATCTGAACCCGTTTGCGCCGCTGGGCGTGGATGAAGATAGCCTGGAATTTATTCATCTGTTTATGCTGTATCTGCTGTGGACCGATGAAAAAGAAGCGCCGAACGATTGGGTGGCGACCGGCGATTTTCTGAACGAACAGGTGGCGCTGGGCCATCCGTTTGCGCAGGTGAAACTGCTGGCGGAAGGCGATCGCATTTTTGCGGAAATGGATGAAATGATTGAAGCGCTGGGCCTGTTTCGCACCAAAAAAAGCCTGGAAGTGCATCGCGCGCAGCTGCGCACCCCGGATCTGACCATTGCGGGCAAAATGTGGACCATTATTGAAAGCAACAGCAACCAGGAACTGGGCATTATTTTTGGCAAAGAATATCAGGGCATGGCGTTTGAACGCCCGTATCAGCTGGCGGGCTTTCGCAACATGGAACTGAGCACCCAGCTGTTTCTGTTTGATATTATTCAGAAAGGCGTGGAAGTGGAAATTCTGGATGAACAGGAACAGTTTCTGAAACTGAAACATCAGGATCATATTGAATATGTGAAAAACGCGAACATGACCAGCAAAGATAGCTATATTGTGCCGCTGATTATGGAAAACAAAACCGTGACCAAAAAAGTGCTGGCGGAAGCGGGCTTTAACGTGCCGGCGGGCGATGAATTTGATACCCCGGAAAGCGCGGAACAGGCGTATGTGAAATATAGCGAAAAAGCGTTTGTGATTAAACCGAAAACCACCAACTATGGCCTGGGCATTACCATTTTTAAAGAAGGCGCGAGCCTGGCGGATTATGCGGAAGCGCTGAAACTGGCGTTTAAAGAAGATAGCGCGGTGCTGATTGAAGAATTTCTGCCGGGCACCGAATATCGCTTTTTTGTGCTGGATGATCAGGTGCGCGCGATTATGCTGCGCGTGCCGGCGAACGTGGTGGGCGATGGCCTGCGCAGCGTGGAAGCGCTGGTGGCGGAAAAAAACCTGGATCCGCTGCGCGGCACCCATCATCGCAGCCCGCTGGAACTGATTCAGCTGGGCGATGTGGAACGCCTGATGCTGAAAGAACAGAACCTGCTGACCACCAGCGTGCCGGAAAAAGATCAGATTGTGTATCTGCGCGAAAACAGCAACGTGAGCACCGGCGGCGATAGCATTGATGTGACCGATAACTTTGATGAAAGCTATAAACAGATTGCGATTGAAGCGGTGCAGGCGCTGGGCGCGAAAATTTGCGGCATTGATCTGATTGTGCCGGATAAAAGCGTGAAAGGCACCAAAAACAGCCGCACCTATGGCATTATTGAAGCGAACTTTAACCCGGCGATGCACATGCATGCGTATCCGCATAGCGGCAAAGGCCGCCATCTGACCATGGATGTGCTGAAAATGCTGTATCCGGAAGTGTTTGAATAA

SEQIDNO:2

MKFKELLQQKTIRPYVMAARFGLEKESQRTTFDGQLATTDHPEVLGNRSYHPYIQTDFSESQMELITPVANSIHEMMRYLAAIHDVALRSMNKHEMLWPLSMPPKLPLKDEDIKIAKLDQFEGILYRRYLAREYGKRKQMVSGIHFNFEYDIELVKQLFSAQTEYETIEEFKNILYMKVSRNYLRYRWLITYLFGASPVSESGYFTEREERPKEPVRSIRNSSFGYKNNENVKVSYESLQHYIDDIHRMVENGILSEEKEFYSAVRLRGGKQMADLPKTGVRYIELRNLDLNPFAPLGVDEDSLEFIHLFMLYLLWTDEKEAPNDWVATGDFLNEQVALGHPFAQVKLLAEGDRIFAEMDEMIEALGLFRTKKSLEVHRAQLRTPDLTIAGKMWTIIESNSNQELGIIFGKEYQGMAFERPYQLAGFRNMELSTQLFLFDIIQKGVEVEILDEQEQFLKLKHQDHIEYVKNANMTSKDSYIVPLIMENKTVTKKVLAEAGFNVPAGDEFDTPESAEQAYVKYSEKAFVIKPKTTNYGLGITIFKEGASLADYAEALKLAFKEDSAVLIEEFLPGTEYRFFVLDDQVRAIMLRVPANVVGDGLRSVEALVAEKNLDPLRGTHHRSPLELIQLGDVERLMLKEQNLLTTSVPEKDQIVYLRENSNVSTGGDSIDVTDNFDESYKQIAIEAVQALGAKICGIDLIVPDKSVKGTKNSRTYGIIEANFNPAMHMHAYPHSGKGRHLTMDVLKMLYPEVFE

Claims (10)

1.一种催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述催化谷胱甘肽合成的生物酶，其特征在于，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株；所述基因工程菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

3.一种编码权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

4.一种如权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①构建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转到宿主细胞中；

②选用具有氨苄青霉素抗性的质粒，作为基因载体，使构建的基因工程菌获得氨苄青霉素抗性；

③挑选阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基活化培养；

④将③培养好的菌种转移至含氨苄青霉素的葡萄糖、铵盐培养基中，补加氨水，控制pH培养至OD600达到28～32；

⑤将发酵体系温度缓慢降低至23～30℃，补加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）低温诱导；

⑥诱导培养过程中根据菌体生长情况补加葡萄糖溶液，维持体系稳定发酵；

⑦诱导培养14～17h，得到发酵液，即催化谷胱甘肽合成的生物酶。

5.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步骤①中构建基因工程菌表达载体的核苷酸序列；所述步骤②中选用具有氨苄青霉素抗性的质粒作为基因载体；所述步骤①中选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为宿主细胞。

6.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步骤③、④中使用的培养基中添加了0.02～0.2mg/ml培养基的氨苄青霉素。

7.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的制备方法，其特征在于，所述步骤④中使用20～30%的工业氨水，控制发酵体系pH稳定在6.5～7.5；培养温度35～38℃，溶氧25～45%，pH6.5～7.5；所述步骤⑤中诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷补加量为0.04～0.4mg/ml；所述步骤④中诱导温度23～30℃，溶氧20～40%，pH6.5～7.5；所述步骤②中磷酸盐缓冲液中有效成分含量：0.04416%NaH2PO4·H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O。

8.根据权利要求4所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶制备方法，其特征在于，所述步骤③中采用60～80MPa高压均质的方法进行细胞均质破碎至少两次；所述步骤⑤中采用超滤的方法清除小分子杂质，浓缩酶液，提高有效成分含量；所述步骤⑥中采用物料体系温度控制0～4℃。

9.一种权利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

①将上述发酵液离心收集菌泥；

②配制菌泥三倍质量的磷酸盐缓冲液与菌泥混合均匀；

③菌泥、磷酸盐缓冲液混合均质破碎；

④离心固液分离，将不溶性细胞残渣分离，收集清液，获得催化谷胱甘肽生物合成的中间酶液；

⑤中间酶液超滤浓缩、除杂，获得浓缩酶液；

⑥提取过程①～⑤步骤物料温度维持在0～4℃；

⑦浓缩酶液真空冷冻干燥，获得酶干粉。

10.根据权利要求9所述的生物酶提取方法，其特征在于，所述步骤⑦中采用冻干的方法获取酶干粉。