CN103122322A - 一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌。本发明提供了一种构建重组菌的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因导入出发菌，得到重组菌；本发明的实验证明，用本发明的方法制备得到重组菌，其可以用来生产谷胱甘肽，且产量很高，为工业生产制备谷胱甘肽奠定了基础。

Description

一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于生产谷胱甘肽的毕赤酵母工程菌。

背景技术

谷胱甘肽作为一种重要的小分子三肽化合物，它广泛存在于动植物组织、细胞和微生物细胞中。谷胱甘肽最早在面包酵母中被发现，于1921年正式被命名为谷胱甘肽。谷胱甘肽的全称是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine，GSH)，是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通过肽键缩合而成的，结构式如下：

通常GSH以还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽两种形式存在，其分子量为307.33，熔点为189～193℃，晶体呈无色透明细长蜡状，等电点为5.93，易溶于水、稀醇、液氨和NN.二甲基甲酰胺，微溶或不溶于乙醇、醚和酮。研究表明只有还原型谷胱甘肽(GSH)具有生理活性，由于每分子还原型谷胱甘肽含有一个活泼的疏基，当GSH溶解在水中时，两分子还原型谷胱甘肽的活泼疏基会氧化缩合为二硫键，得到氧化型谷胱甘肽(简称GSSG，GSSG是两分子GSH脱氢后通过二硫键相联的二聚体)，因而GSH的溶液在空气中易被氧化。然而固体的GSH却比较稳定。

在生物体内，谷胱甘肽是一种主要的还原性物质，它参与细胞内的多种氧化还原反应来维持细胞内适宜的氧化还原状态；参与体内氨基酸的转运和解毒过程；参与血管保护；抗HIV和抗衰老作用等。由于GSH具有很多方面的生理功能而被广泛应用于医学、食品、化妆品行业。在医学临床应用方面，谷胱甘肽能够抑制艾滋病病毒，治疗眼角膜病的功效，还可以向肝脏提供甘氨酸及牛黄酸，保证甘氨酸及牛黄酸的结合胆碱的合成，促进消化道对脂溶性维生素(A、D、E、K)的吸收，从而促进肝脏合成维生素K依赖性凝血因子的生成，减轻出血倾向。在食品加工方面，谷胱甘肽可以改善食品的品质、增强食品的风味、延长食品保质期。在化妆品生产方面，谷胱甘肽能够保护细胞免受辐射的伤害，同时起到美白作用。

工业化生产GSH主要采用化学合成法、固定化细胞(或酶)法、发酵法。化学合成法生产GSH工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且存在环境污染等问题；酶法生产谷胱甘肽需要获得相关的酶系，需要消耗ATP，需要加入前体氨基酸等物质，造成成本较高；发酵法生产GSH就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量。由于该方法所用原料可再生，产物对环境无污染等优点而越来越受人们的关注。

目前国内外发酵法合成GSH的菌种主要是酿酒酵母、产朊假丝酵母等，而生产菌株主要依靠传统的诱变育种方法获得。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因导入出发菌，得到重组菌；

其中，所述双功能谷胱甘肽合成酶来源于单增李斯特菌(Ltsterta monocytogene)。

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列1。

在上述方法中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因通过重组载体导入出发菌。

在上述方法中，所述重组载体为将所述双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中的ClaI和NotI酶切位点间，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

在上述方法中，所述pGAPZαH为将his4的编码基因插入pGAPZαA的BamHI和BglII位点间得到的载体；

所述his4的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。

在上述方法中，所述出发菌为毕赤酵母菌(Pichia pastoris)；

在上述方法中，所述毕赤酵母菌(Pichia pastoris)具体为GSl15。

由上述方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中的ClaI和NotI酶切位点间，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

在上述重组载体中，所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；

在上述重组载体中，所述pGAPZαH为将his4的编码基因插入pGAPZαA的BamHI和BglII位点间得到的载体；

所述his4的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。

在上述重组载体中，所述双功能谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述的重组菌或上述的重组载体在制备谷胱甘肽中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种制备谷胱甘肽的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，收集发酵产物，即得到谷胱甘肽。

在上述方法中，所述发酵温度为26℃-30℃，在本发明的实施例中具体为30℃；所述发酵时间为39h-42h，在本发明的实施例中具体为42h。

本发明的实验证明，用本发明的方法制备得到重组菌，其可以用来生产谷胱甘肽，且产量很高，该菌株摇瓶条件下谷胱甘肽产量是野生毕赤酵母菌株的4.13倍，为工业生产制备谷胱甘肽奠定了基础。

与来源于酵母的谷胱甘肽合成酶系相比，将来源于革兰氏阳性菌的双功能谷胱甘肽合成酶用于毕赤酵母法生产GSH的可能存在以下优势：首先，由于γ-GCS和GS两个功能域在空间上十分接近，两步催化衔接更加紧密，理论上催化效率应当更高，中间前体应当更少；其次，从重组酵母菌株构建角度，只需要操作一个基因，在筛选高拷贝菌株时也更加简便；再次，研究表明一些gshF基因表现出良好的特性，如来源于S.agalactiae和S.thermophilus不存在GSH的反馈抑制；最后，从对酶的定向改造角度，如果要通过蛋白质工程手段提高催化谷胱甘肽合成酶的活性，显然改造gshF要更加简便。

附图说明

图1为HPLC检测胞内GSH结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、表达双功能谷胱甘肽合成酶的毕赤酵母菌株的获得

一、谷胱甘肽组成型表达载体的构建

1.重组质粒pGAPZαH的构建

将pGAPZαA(购自Invitrogen公司，产品目录号为V20520)用BamHI单酶切后去磷酸化，得到去磷酸化线性质粒pGAPZαA。

以Forward：5’-AGATCTATGACATTTCCCTTGCTACCTGCA-3’，Reverse：

5’-GGATCCTTAA ATAAGTCCCAGTTTCTC-3’为引物，pPIC9k质粒(购自Invitrogen公司，产品目录号为V17520)为模板扩增，得到2535bp的PCR产物，经过测序，PCR产物具有序列表中的序列3所示的核苷酸，即为his4；

用BamHI/BglII双酶切2535bpPCR产物用Omega纯化试剂盒纯化后直接与上述去磷酸化线性质粒pGAPZαA连接即得到重组质粒pGAPZαH。

2.谷胱甘肽合成酶基因的克隆

引物设计与合成

1)无乳链球菌Streptococcus agalacttae来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因

Forward：5’-AGATCGATACCATGATTATAGATCGACTGTTAC-3’

Reverse：5’-CTAGCGGCCGCTTAGCCTAAGGAACTCTTTTTA-3’

2)单增李斯特菌Listeria monocytogene来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因

Forward：5’-CTAGATCGATACCATGATAAAACTTGATATGAC-3’

Reverse：5’-CTAGCGGCCGCTTAGTCAAATAAGAAATCTAA-3’

3)植物乳杆菌Lactobacillus plantarum来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因

Forward：5’-AGATCGATACCATGGAATTAGATGCCGTTGGTA-3’

Reverse：5’-CAGCGGCCGCTTAATCTTCATTTTTAAACAATGC-3’

在α-factor信号肽编码序列上游有一个BstBI酶切位点(TTCGAA)，该酶与CalI(ATCGAT)是同尾酶，下游的多克隆位点中含有NotI(GCGGCCGC)位点。因此，引物Forward的设计是在谷胱甘肽合成酶基因之前引入ClaI位点，引物Reverse包含终止密码子TAA，并引入一个NotI酶切位点。通过该引物设计，即可将谷胱甘肽合成酶基因直接连接在pGAPZαH中，并将α-factor信号肽序列取代。

以无乳链球菌(Streptococcus agalactiae 2603V/R)总DNA为模板，加入其对应的引物Forward、引物Reverse、Prime STAR DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94℃ 3min；94℃ 25s，60-50℃ 25s，72℃ 3min，每个循环降1℃，共10个循环；94℃ 25s，54℃ 25s，72℃ 3min，共28个循环。PCR扩增得到2300bp左右的片段，命名为SagshF，用Omega纯化试剂盒纯化后，用NotI和ClaI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到连接产物；连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒pGAPZ(α)H-SagshF，将pGAPZ(α)H-SagshF送北京擎科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有GenBank号为AE009948.1的自5’端的第1816998-1819272位所示的核苷酸序列，该质粒为将GenBank号为AE009948.1的自5’端的第1816998-1819272位所示的核苷酸插入pGAPZαH载体的NotI和ClaI位点间得到的质粒。

可人工合成GenBank号为AE009948.1的自5’端的第1816998-1819272位所示的核苷酸作为模板，用无乳链球菌(Streptococcus agalactiae 2603V/R)的引物Forward、引物Reverse进行PCR扩增，得到PCR产物经过NotI和ClaI酶切后与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到pGAPZ(α)H-SagshF。

以单增李斯特菌(Listeria monocytogene ATCC19114)总DNA为模板，加入其对应的引物Forward、引物Reverse、Prime STAR DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94℃ 3min；94℃ 25s，60-50℃ 25s，72℃ 3min，每个循环降1℃，共10个循环；94℃ 25s，54℃ 25s，72℃ 3min，共28个循环。PCR扩增得到2300bp左右的片段，命名为LmgshF，用Omega纯化试剂盒纯化后，用NotI和ClaI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到连接产物；连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒pGAPZ(α)H-LmgshF，将pGAPZ(α)H-LmgshF送北京擎科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有GenBank号为FM211688.1的自5’端的第2887567-2889847位所示的核苷酸序列，即为序列表中的序列1(可人工合成序列1)，其编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，该质粒为将序列表的序列1插入pGAPZαH载体的NotI和ClaI位点间得到的质粒。

可人工合成序列1作为模板，用单增李斯特菌(Listeria monocytogene)的引物Forward、引物Reverse进行PCR扩增，得到PCR产物经过NotI和ClaI酶切后与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到pGAPZ(α)H-LmgshF。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WCFS1)总DNA为模板，加入其对应的引物Forward、引物Reverse、Prime STAR DNA聚合酶及dNTP混合物，进行降落PCR(touchdown PCR)，反应条件如下：94℃ 3min；94℃ 25s，54-44℃ 25s，72℃ 3min，每个循环降1℃，共10个循环；94℃ 25s，48℃ 25s，72℃ 3min，共28个循环。PCR扩增得到2300bp左右的片段，命名为LpgshF，用Omega纯化试剂盒纯化后，用NotI和ClaI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到连接产物；连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒pGAPZ(α)H-LpgshF，将pGAPZ(α)H-LpgshF送北京擎科进行测序，测序结果表明PCR扩增得到的片段具有GenBank号为AL935263.2的自5’端的第2113325-2111070位所示的核苷酸序列((可人工合成)，该质粒为将GenBank号为AL935263.2的自5’端的第2113325-2111070位所示的核苷酸插入pGAPZαH载体的NotI和ClaI位点间得到的质粒。

可人工合成GenBank号为AL935263.2的自5’端的第2113325-2111070位所示的核苷酸作为模板，用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WCFS1)的引物Forward、引物Reverse进行PCR扩增，得到PCR产物经过NotI和ClaI酶切后与经过同样酶切的pGAPZαH连接，得到pGAPZ(α)H-LpgshF。

二、表达双功能谷胱甘肽合成酶的毕赤酵母菌株的获得

1、电转化巴斯德毕赤酵母细胞的制备

接种毕赤酵母菌(Pichia pastoris)菌株GSl15(Invitrogen，Ca.18100)于500mLYPD培养基(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母膏)，30℃，220r/min培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0。4℃，1,500g离心5min收集菌体，分别用500mL、250mL预冷的灭菌水和20mL预冷的1mol/L山梨醇各洗一次。每次洗后均在4℃，1,500g下离心5min收集菌体，最后用1mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞。

2、重组表达质粒电转化酵母细胞

将上述一中构建正确的重组表达质粒pGAPZAH-SagshF、pGAPZAH-LmgshF、pGAPZAH-LpgshF各约10ug分别用BstbI、NheI、BstbI酶切线性化，Omega纯化试剂盒纯化回收线性DNA并溶解于15uL无菌水中。将上述线性化DNA与80uL毕赤酵母GS115感受态细胞混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。采用美国BIO-RAD公司电转化仪，根据所使用电转化仪预设的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后立即加入1mL预冷的1M山梨醇至电击杯中，然后将电击杯中的溶液全部转移至1.5mL无菌离心管中，30℃孵育1-2h，取500uL涂布MD(2g/L葡萄糖、13.4g/L YNB、4×10^-4g/L生物素、1.5g/L琼脂)平板，于30℃倒置培养2-4天直至菌落出现。至此，得到含不同来源的gshF的重组毕赤酵母菌株，分别命名GS115/SagshF、GS115/LmgshF和GS115/LpgshF。

分别进行测序验证，GS115/SagshF、GS115/LmgshF和GS115/LpgshF中分别含有重组载体pGAPZAH-SagshF、pGAPZAH-LmgshF、pGAPZAH-LpgshF，说明重组菌构建正确。

实施例2、重组菌株产谷胱甘肽

1、重组菌的发酵培养

将上述获得的表达不同来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的重组毕赤酵母菌菌株GS115/SagshF、GS115/LmgshF、GS115/LpgshF和对照菌株GS115分别接种于25ml已灭菌YPD液体培养基中于30℃，220r/min摇床培养42h后，分别收集等OD的上述发酵液中的菌体，15000g/min离心2min，弃去上清液并用灭菌水洗涤两次，洗涤后的菌体-20℃保存备用。

2、谷胱甘肽含量检测

将收集的各菌体室温(25℃)解冻，加入等量细碎玻璃珠和等体积的Breaking buffer(50mM pH7.4的磷酸钾缓冲液，5％甘油(v/v)，5mM巯基乙醇和1mM EDTA)后进行细胞破碎20min(涡旋机上30s，冰浴30s反复进行)。12000r/min离心10min，收集上清液，取90μL上清液加入到200μL的50mM的HEPPSO(pH7.5)缓冲液(含有50％乙腈，1mM的DTT，5mM的DTPA)中，再加入5μL的50mM的mBBr(溶解在乙腈中)，放置于60℃水浴中30min，取出加入5μL的1.2mM的甲基磺酸终止反应，20,000g/min离心5min，上清液用于HPLC分析。

HPLC的检测条件及方法如下：

色谱柱：PLRP-S

(4.6mm×250mm)packed with 5μmreversed-phase material(Polymer Laboratories，Church Stretton，UK)，using aWaters 600E HPLC。

柱温：采用室温(25℃)

检测：激发光：390nm；发射光：480nm

流动相A：5％(v/v)的乙腈和0.25％(v/v)冰醋酸(pH3.5)

流动相B：90％的乙腈和0.25％(v/v)冰醋酸

洗脱方法：100％的A维持2min；在35min内上升至35％的B；3min内升至100％的B，并维持5min；立即返回起始的100％A的条件，重新平衡15min。

流速：1ml/min

以Cysteine、GSH、γ-Glutamylcysteine(γ-GC)、Cysteineglycine(CG)(均购自sigma公司，货号分别为W326305，G4251，G0903，C0166)各100μM的混合液作为标准品。

HPLC检测胞内GSH图谱见图1，A为Cysteine、GSH、γ-Glutamylcysteine(γ-GC)、Cysteineglycine(CG)各100μM的混合液；B为GS115/LmgshF发酵42h结果，可以看出收集保留时间为12.420min峰即为胞内GSH。

而GSH的浓度如表1所示，

表1为不同菌株生产谷胱甘肽

结果表明重组毕赤酵母GS115/LmgshF胞内合成谷胱甘肽，且产谷胱甘肽的量为190mg/L发酵液，而对照组毕赤酵母GS115野生菌产谷胱甘肽仅为46mg/L。

Claims (10)

1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因导入出发菌，得到重组菌；

所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述双功能谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因通过重组载体导入出发菌。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组载体为将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

所述pGAPZαH为将his4的编码基因插入pGAPZαA的多克隆位点间得到的载体；

所述his4的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述出发菌为毕赤酵母菌(Pichia pastoris)；

所述毕赤酵母菌(Pichia pastoris)具体为GSl15。

6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备的重组菌。

7.一种重组载体，为将双功能谷胱甘肽合成酶的编码基因插入pGAPZαH中，得到表达双功能谷胱甘肽合成酶的重组载体；

所述双功能谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；

所述pGAPZαH为将his4的编码基因插入pGAPZαA的多克隆位点得到的载体；

所述his4的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：

所述双功能谷胱甘肽合成酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

9.权利要求6所述的重组菌或权利要求7或8所述的重组载体在制备谷胱甘肽中的应用。

10.一种制备谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：发酵权利要求6所述的重组菌，收集发酵产物，即得到谷胱甘肽；

所述发酵温度具体为26℃-30℃；所述发酵时间具体为39h-42h。

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