CN112941049B

CN112941049B - 一种脂肪酶及其在水解虾青素酯中的应用

Info

Publication number: CN112941049B
Application number: CN202110205046.7A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 孙建安; 祖泽宇; 高坤鹏
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112941049A

Abstract

本发明公开了一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码权该脂肪酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述脂肪酶在水解虾青素酯/制备虾青素中的应用，水解条件为：最适温度为30℃，最适pH为7.0～8.0。本发明还公开了一种重组载体和重组工程菌，包含有编码脂肪酶的基因。本发明的脂肪酶，可以针对来源于雨生红球藻的虾青素酯进行高效水解，在优化条件下水解虾青素酯20h，虾青素酯的水解率可达99.5％，较传统皂化法明显降低了副产物的产生，同时与其他酶水解法相比，水解效率也具有较大优势。

Description

一种脂肪酶及其在水解虾青素酯中的应用

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶，及其在水解虾青素酯中的应用，属于功能酶筛选及应用技术领域。

背景技术

脂肪酶是一类能够水解甘油三酯的酯键，产生有利脂肪酸的生物酶，其也可以水解非甘油三酯的脂质，产生相应的产物。其在自然界分布广泛，从动物、植物、微生物体内都可以分离到催化功能各异的脂肪酶。脂肪酶由于其优良的催化效率和催化选择性，在食品、农业、工业等领域有着广泛的应用。

虾青素是类胡萝卜素家族的重要一员，其分子结构中的共轭双键链及共轭双键链末端的不饱和酮基和羟基，具有比较活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，有效地猝灭氧化性极强的单线态活性氧以及环境中其他自由基，从而起到清除自由基和抗氧化作用，在食品和日化品领域有着很大的开发利用潜力。雨生红球藻是天然虾青素的最好来源之一，但其中大部分虾青素都以虾青素酯的形式存在，造成虾青素的活性和稳定性受到不同程度的影响。因此，如何有效水解虾青素酯制备游离虾青素，对虾青素的高值化利用和功能产品开发具有较大意义。

脂肪酶以其高效的酯键水解活性，具备水解虾青素酯制备游离虾青素的应用潜力，但能够对虾青素酯进行高效水解的专用脂肪酶的发掘与应用是实现游离虾青素高效水解制备的关键因素。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种能够有效水解虾青素酯制备游离虾青素的脂肪酶。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MAPKPKLSFDRELDSLLPDYNDLIQLPEVNDILPPGVTHEEHTFLGPDKNPLILSIFRKESPPDSFPQKRPAIYHIHGGGMIMGNRFCTLSGPLEFVREHDAICTTIEYRLAPKHPYPAPIEGCYAGLVWVHEHAEELGIDSTRIVINGLSAGGGLAAGVALLCRDRKGPPLIGQSLFSPMIDDCNDSVSAHEFTGTGIWDRNANMAGWNAYLGDRRGSYNVNVYAAPIRAKNLTGLPPAYIDVGSTETFRDEDVQYAQNMWRDGTQCELHVWPGAYHGFEGLCPRAQLSIMARKARLDWLRRSLFC。

编码上述脂肪酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGGCTCCAAAACCAAAGCTGTCATTCGATCGCGAGCTAGACTCCCTCCTTCCAGATTATAATGACTTAATCCGTGAACAGAGTTACCCGAAGTCAATGATATACTACCTCCGGGAGTCACTCACGAAGAACACACTTTCCTCGGCCCTGACAAGAACCCGCTGATCCTCTCAATCTTCCGCAAGGAGAGTCCGCCAGACTCTTTTCCACAGAAACGACCAGCCATCTACCATATCCATGGTGGAGGCATGATCATGGGCAACCGCTTCTGCACACTAAGCGGCCCGCTCGAATTCGTTCGCGAACATGACGCTATCTGCACCACGATCGAATACCGCCTTGCGCCTAAACATCCCTACCCTGCACCGATCGAAGGTTGCTACGCTGGCCTGGTCTGGGTACATGAGCACGCAGAGGAACTCGGAATCGACTCGACTCGTATTGTAATCAATGGACTCTCAGCAGGAGGTGGCCTGGCAGCAGGTGTTGCGCTGCTGTGTCGGGACCGGAAAGGCCCTCCTTTGATCGGACAATCGCTGTTCTCGCCTATGATCGATGACTGTAATGACTCAGTTTCGGCGCATGAGTTTACTGGAACGGGGATCTGGGACCGCAATGCCAATATGGCAGGTTGGAATGCGTATCTAGGTGACCGCAGAGGAAGTTACAATGTCAATGTGTATGCAGCTCCTATTAGGGCAAAGAATCTTACAGGCCTTCCGCCGGCGTATATCGATGTCGGATCGACAGAGACATTTCGCGACGAAGATGTCCAGTATGCGCAGAACATGTGGCGTGACGGCACTCAGTGTGAACTGCATGTTTGGCCTGGTGCATATCATGGATTCGAGGGACTGTGCCCGAGAGCGCAGTTGTCTATTATGGCGAGGAAAGCGAGGTTGGATTGGCTACGGCGAAGTCTCTTCTGTTGA-3’。

上述脂肪酶在水解虾青素酯/制备虾青素中的应用。

进一步地，水解条件为：最适温度为30℃，最适pH为7.0～8.0。

一种重组载体，包含有上述编码脂肪酶的基因。进一步地，所述载体为pPICZαA。

一种重组工程菌，包含有上述编码脂肪酶的基因，或包含有上述重组载体。

进一步地，所述工程菌为毕赤酵母表达菌株X-33。

所述重组工程菌在制备上述脂肪酶中的应用。

本发明的脂肪酶，可以针对来源于雨生红球藻的虾青素酯进行高效水解，在优化条件下水解虾青素酯20 h，虾青素酯的水解率可达99.5%，较传统皂化法明显降低了副产物的产生，同时与其他酶水解法相比，水解效率也具有较大优势。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：不同培养基发酵策略下重组菌X-33的生长状态。

图2：不同培养基发酵策略下重组菌X-33的产酶情况。

图3：不同甲醇添加量下重组菌X-33的生长状态。

图4：不同甲醇添加量下重组菌X-33的产酶情况。

图5：酯酶EST3-14水解虾青素酯的HPLC检测，其中，A为游离虾青素标品；B为Est3-14催化水解产物，峰1：13-顺-虾青素，峰2：全反式虾青素，峰3：9-顺-虾青素；C为底物虾青素酯。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 脂肪酶Lip AF01片段的克隆与表达菌株构建

从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买烟曲霉菌株（Aspergillus fumigatus）（CGMCC NO.3.13920），根据烟曲霉的全基因测序结果，选取序列为序列表中SEQ ID NO：2的编码片段进行异源表达，考虑到生物安全性，采用毕赤酵母表达菌株X-33作为宿主。

根据脂肪酶Lip AF01基因序列设计引物，引物中含有限制性内切酶EcoR I和XbaI 酶切位点，酶切连接后连接至质粒pPICZα A上，构建充足表达质粒pPICZα A-AF01。使用电转化法转化至毕赤酵母X-33感受态细胞，构建表达菌株。

上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTCCAAAACCAAAGCTGTCAT-3’；

下游引物：5’-TGCTCTAGATCAACAGAAGAGACTTCGCCGTAGC-3’。

实施例2 重组表达菌株X-33不同培养基发酵策略研究

分别考察在不同阶段使用不同成分培养基对脂肪酶X-33表达的影响，不同的培养基成分如下：

YPD培养基：2%蛋白胨，1%酵母抽提物，2%葡萄糖（葡萄糖溶液灭菌后加入），配制固体培养基时加入2%琼脂粉，于121℃灭菌20 min。

BMGY培养基：100 mM磷酸盐缓冲溶液，2%蛋白胨，1%酵母抽提物，于121℃灭菌20min，冷却至60℃后，在超净台上添加过滤除菌的1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油。

BMMY培养基：100 mM磷酸盐缓冲溶液，2%蛋白胨，1%酵母提取物，于121℃灭菌20min，冷却至60℃后，在超净台上加入过滤除菌的1.34% YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

mBMGHY培养基：100 mM磷酸盐缓冲溶液，1%硫酸铵，1%酵母提取物，于121℃灭菌20min，冷却至60℃后，在超净台加入过滤除菌的4×10^-3%组氨酸，4×10^-5%生物素，1%甘油。

mBMMY培养基：100 mM磷酸盐缓冲溶液，1%硫酸铵，0.1%酵母提取物，于121℃灭菌20 min，冷却至60℃后，在超净台上加入过滤除菌的1.34% YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

mBMMHY培养基：100 mM磷酸盐缓冲溶液，1%硫酸铵，0.1%酵母提取物，于121℃灭菌20 min，冷却至60℃后，在超净台加入过滤除菌4×10^-3%组氨酸，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

初始诱导条件为先将重组菌接种到YPD 液体培养基220 rpm、30℃过夜培养，将培养好的种子液接种至BMGY液体培养基中，摇瓶培养至OD₆₀₀=4-6，离心收集菌体，使用BMMY液体培养基重悬菌体后培养菌体，每隔24 h向培养液中添加一定量的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%（v/v），共诱导表达3 d。

在此基础上采用分阶段不同培养基的发酵策略研究，分别为：YPD-BMGY-mBMMY、YPD-BMGY-mBMMHY、YPD-mBMGHY-mBMMY、YPD-mBMGHY-mBMMHY，诱导发酵72 h分别取样测定菌体的生长量和脂肪酶酶活，以得到最有利于毕赤酵母的发酵策略。

实验结果如图1和图2所示。从结果可以看出，YPD-BMGY-BMMY的发酵策略最有利于菌体生长，在发酵72 h时，菌体培养液在OD₆₀₀处吸光值最高，达到0.92。脂肪酶测定结果表明在YPD-BMGY-BMMY的发酵策略下可得到最大的脂肪酶酶活10.5 U/mL，其他发酵策略则基本没有脂肪酶产生，说明在原始培养基基础上进行培养基成分的调整，不利于菌体生长与酶活的诱导表达，综上结果采用YPD-BMGY-BMMY的发酵策略培养重组菌X-33生产脂肪酶。

实施例3 重组表达菌株X-33甲醇诱导条件研究

在YPD-BMGY-BMMY的发酵培养条件下，研究不同甲醇诱导浓度对菌体生长和脂肪酶酶活的影响，在甲醇诱导表达阶段，每隔24 h分别添加0.2%、0.5%、0.8%、1.1%和1.4%（v/v）浓度的甲醇，诱导发酵72 h时取样测定菌体的生长量和脂肪酶酶活，研究重组菌生长和产酶的最适诱导条件。

实验结果如图3和图4所示，可以看出不同的甲醇添加量对菌体生长和酶活表达都有较大的影响，其中甲醇添加量为1.1%时最有利于菌体的生长和酶活的表达，培养液在OD₆₀₀处吸光值达到0.98，脂肪酶酶活达到11.3 U/mL，因此在使用该菌产脂肪酶时，采用每隔24 h添加1.1%甲醇诱导的策略。

实施例4 脂肪酶Lip AF01酶制剂的制备

使用以上实施例中的酶诱导表达策略获得脂肪酶Lip AF01发酵液，将发酵液1000rpm、4℃条件下离心10 min，收集上清液。上清液使用使用硫酸铵溶液进行沉淀，沉淀于1000 rpm、4℃条件下离心10 min进行收集，收集后使用透析袋透析48 h脱盐，脱盐后酶液冻干得到脂肪酶Lip AF01酶制剂。

实施例5 脂肪酶Lip AF01在水解虾青素酯中的应用

利用制备好的Lip AF01酶制剂，水解雨生红球藻油中的虾青素酯制备游离虾青素。将1500 U脂肪酶Lip AF01酶粉用6 mL Tris-HCl缓冲液（100 mM，pH 8.0）溶解后加入反应体系，然后加入用0.5 mL无水乙醇溶解的0.5%的底物雨生红球藻油（虾青素酯含量为0.5%，w/w）。充入氮气避免虾青素氧化降解，同时避光置于40℃水浴摇床中水解20 h，水解完毕使用高效液相色谱测定游离虾青素含量，计算虾青素酯水解率，测定结果如图5所示，可以看出Lip AF01脂肪酶可高效水解虾青素酯生成游离虾青素。经测定，使用Lip AF01水解雨生红球藻中的虾青素酯，底物的水解率达到99.5%。

在虾青素酯水解反应中，由于存在产物抑制效应，水解率在达到98%以上时，产生的游离虾青素会抑制水解虾青素酯的脂肪酶的催化效率，此时再进一步提高虾青素酯的水解效率较为困难。因此，能否在98%时进一步提高虾青素酯的水解率，就需要筛选高催化效率的虾青素酯酶，以实现更高水解度的虾青素酯水解，从而得到品质更高的游离虾青素产物。

在虾青素酯水解相关报道中，各报道所列举的虾青素酯水解案例均为在该虾青素酯的最优水解条件下多次进行实验得到的结果，因此虽然各报道案例使用的脂肪酶和水解条件不相同，但俱为各脂肪酶的最优水解能力，可以进行横向比较。同时，计算虾青素酯水解率一般采用高效液相色谱法对底物和产物进行测定和计算，根据高效液相色谱技术灵敏度高的特点，水解度的计算都较为精确，可有效避免测定误差，反映真实的实验结果。

其他虾青素酯水解相关专利报道：

一种虾青素酯酶及虾青素单体的制备方法（公开号：CN111778227A）中虾青素酯水解率为98.2%；

一种酯酶及其应用（公开号：CN107119030A）中，虾青素酯的水解率可达到99%以上，但水解时间需要48 h；

高效异源表达圆弧青霉脂肪酶的毕赤酵母（公开号：CN105861465A）中虾青素酯的水解率为96%；

一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用（公开号：CN104877944A）中虾青素酯的水解率为96%；

一种制备游离虾青素的方法（公开号：CN104293874A）中虾青素酯的水解率为83%。

可以看出，与已报道其他脂肪酶水解虾青素酯过程相比，使用本专利中的脂肪酶水解虾青素酯的水解效率和水解率都具有较大优势。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种脂肪酶及其在水解虾青素酯中的应用

<140> 2021102050467

<141> 2021-02-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 307

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ala Pro Lys Pro Lys Leu Ser Phe Asp Arg Glu Leu Asp Ser Leu

1 5 10 15

Leu Pro Asp Tyr Asn Asp Leu Ile Gln Leu Pro Glu Val Asn Asp Ile

20 25 30

Leu Pro Pro Gly Val Thr His Glu Glu His Thr Phe Leu Gly Pro Asp

35 40 45

Lys Asn Pro Leu Ile Leu Ser Ile Phe Arg Lys Glu Ser Pro Pro Asp

50 55 60

Ser Phe Pro Gln Lys Arg Pro Ala Ile Tyr His Ile His Gly Gly Gly

65 70 75 80

Met Ile Met Gly Asn Arg Phe Cys Thr Leu Ser Gly Pro Leu Glu Phe

85 90 95

Val Arg Glu His Asp Ala Ile Cys Thr Thr Ile Glu Tyr Arg Leu Ala

100 105 110

Pro Lys His Pro Tyr Pro Ala Pro Ile Glu Gly Cys Tyr Ala Gly Leu

115 120 125

Val Trp Val His Glu His Ala Glu Glu Leu Gly Ile Asp Ser Thr Arg

130 135 140

Ile Val Ile Asn Gly Leu Ser Ala Gly Gly Gly Leu Ala Ala Gly Val

145 150 155 160

Ala Leu Leu Cys Arg Asp Arg Lys Gly Pro Pro Leu Ile Gly Gln Ser

165 170 175

Leu Phe Ser Pro Met Ile Asp Asp Cys Asn Asp Ser Val Ser Ala His

180 185 190

Glu Phe Thr Gly Thr Gly Ile Trp Asp Arg Asn Ala Asn Met Ala Gly

195 200 205

Trp Asn Ala Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Gly Ser Tyr Asn Val Asn Val

210 215 220

Tyr Ala Ala Pro Ile Arg Ala Lys Asn Leu Thr Gly Leu Pro Pro Ala

225 230 235 240

Tyr Ile Asp Val Gly Ser Thr Glu Thr Phe Arg Asp Glu Asp Val Gln

245 250 255

Tyr Ala Gln Asn Met Trp Arg Asp Gly Thr Gln Cys Glu Leu His Val

260 265 270

Trp Pro Gly Ala Tyr His Gly Phe Glu Gly Leu Cys Pro Arg Ala Gln

275 280 285

Leu Ser Ile Met Ala Arg Lys Ala Arg Leu Asp Trp Leu Arg Arg Ser

290 295 300

Leu Phe Cys

305

<210> 2

<211> 932

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctccaa aaccaaagct gtcattcgat cgcgagctag actccctcct tccagattat 60

aatgacttaa tccgtgaaca gagttacccg aagtcaatga tatactacct ccgggagtca 120

ctcacgaaga acacactttc ctcggccctg acaagaaccc gctgatcctc tcaatcttcc 180

gcaaggagag tccgccagac tcttttccac agaaacgacc agccatctac catatccatg 240

gtggaggcat gatcatgggc aaccgcttct gcacactaag cggcccgctc gaattcgttc 300

gcgaacatga cgctatctgc accacgatcg aataccgcct tgcgcctaaa catccctacc 360

ctgcaccgat cgaaggttgc tacgctggcc tggtctgggt acatgagcac gcagaggaac 420

tcggaatcga ctcgactcgt attgtaatca atggactctc agcaggaggt ggcctggcag 480

caggtgttgc gctgctgtgt cgggaccgga aaggccctcc tttgatcgga caatcgctgt 540

tctcgcctat gatcgatgac tgtaatgact cagtttcggc gcatgagttt actggaacgg 600

ggatctggga ccgcaatgcc aatatggcag gttggaatgc gtatctaggt gaccgcagag 660

gaagttacaa tgtcaatgtg tatgcagctc ctattagggc aaagaatctt acaggccttc 720

cgccggcgta tatcgatgtc ggatcgacag agacatttcg cgacgaagat gtccagtatg 780

cgcagaacat gtggcgtgac ggcactcagt gtgaactgca tgtttggcct ggtgcatatc 840

atggattcga gggactgtgc ccgagagcgc agttgtctat tatggcgagg aaagcgaggt 900

tggattggct acggcgaagt ctcttctgtt ga 932

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccggaattca tggctccaaa accaaagctg tcat 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tgctctagat caacagaaga gacttcgccg tagc 34

Claims

1.一种水解虾青素酯制备虾青素的方法，其特征在于：将1500U的脂肪酶Lip AF01酶粉用6mL的浓度为100mM、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，然后加入0.5mL的无水乙醇溶解的虾青素酯含量为0.5％的底物雨生红球藻油，充入氮气避免虾青素氧化降解，同时避光置于40℃水浴摇床中水解20小时；

所述脂肪酶Lip AF01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。