CN103060286B

CN103060286B - 一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用

Info

Publication number: CN103060286B
Application number: CN201210532006.4A
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 刘光; 李琳; 侯轶; 王昕哲
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangzhou yingzan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-12-10
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2032-12-10
Also published as: CN103060286A

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用，所述黑曲霉（Aspergillus niger）AN0512，已于2012年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，保藏号是CGMCCNo.6835。黑曲霉在以橄榄油为主要碳源的培养基中发酵后，去除菌体即得脂肪酶粗酶液，粗酶液通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析和分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶，该脂肪酶具有较广泛的温度适用范围；在pH 4.0-6.0内有较好的活性，具有较好的耐酸性。该脂肪酶可应用于食品加工、药物制备、化工合成等行业。

Description

一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶及其生产方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉所产生的胞外脂肪酶，以及脂肪酶的生产方法和应用。

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3），即三酰基甘油酰基水解酶，能将甘油三酯催化水解为游离脂肪酸和二酰甘油、一酰甘油或甘油。此外，还可以催化一系列反应如酯化反应、酯交换反应、酸解、醇解、氨解等反应（徐玉丽等，微生物学报，2011，51(2)：233-240）。脂肪酶广泛存在于动物、植物、微生物中（王自社等，安徽农业科学，2011，39(7)：3798-3800），而微生物脂肪酶比动、植物脂肪酶具备更好的稳定性、更强的耐有机溶剂性、更广的底物特异性（刘海洲等，食品研究与开发，2009，30(1)：141-143），胞外脂肪酶被证实为具有高产、高效和高选择的生物催化剂，在制药、食品、化妆品和洗涤剂等工业得到广泛应用（Pandey A，Appl.Biochem.，1999，29：119-131）。

随着人们对微生物脂肪酶认识的不断加深，应用范围正在不断拓宽，对酶的耐受性（极端温度、压力）要求也越来越高，许多工业用脂肪酶不能够满足苛刻的工艺温度、pH和有机溶剂而限制了其使用（董明奇等，四川大学学报（自然科学版），2008，45（4）：985-990）。因此，发掘具有特殊酶学性质的产脂肪酶菌株具有很大的工业应用价值，而这些菌株一般都来源于特殊的生长环境。

关于黑曲霉产脂肪酶，国内只有零星的菌种选育（任丽虹等，工业微生物，26（1）：23~26，1996）和脂肪酶的分离纯化（舒正玉等，生物工程学报，23（1）：96~100，2007）报道，而且目前的脂肪酶大部分为碱性或中性脂肪酶，限制了工业应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉菌株产生的脂肪酶及其生产方法和应用，利用来源于西藏传统食品中的黑曲霉，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过盐析、透析和层析分离制备电泳纯脂肪酶。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明从西藏奶渣中分离出一株脂肪酶产生菌，编号为0512。根据菌株的形态特征和18S rRNA分子鉴定，确定0512菌株为黑曲霉（Aspergillus niger），并进一步将该菌株编号为AN0512。本发明菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2012年11月19日，保藏号是CGMCC No.6835。

一种利用上述黑曲霉菌株生产脂肪酶的方法，包括如下步骤：

将处于对数生长期的黑曲霉（Aspergillus niger）AN0512菌悬液接种于液体发酵培养基，接种量为1.4%-1.6%v/v，进行发酵培养，将得到的发酵液离心或过滤去除菌体即得粗酶液；液体发酵培养基主要包括w/w：橄榄油0.8%-1.2%，酵母提取物0.5%-2%，pH 5.0-7.0，以及磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钾0.05%，余量为水。

优选地，所述粗酶液还经如下分离纯化步骤：粗酶液经百分饱和浓度为 50-70%w/v的硫酸铵沉淀，离心取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心去沉淀，将清液透析除盐后，采用阴离子层析、分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶。

优选地，所述发酵培养条件为：搅拌转速150-250r/m，培养温度27-29℃，发酵时间90-100h。

上述所得粗酶液用于催化酯交换或酯化反应，反应温度为25-60℃，pH为4.0-10.0。优选地，所述粗酶液催化反应的温度为27-35℃，pH为6.0-8.0。

上述所得电泳纯脂肪酶用于催化酯交换或酯化反应的温度为20-60℃，反应的pH为3.0-8.0。优选地，所述脂肪酶催化反应的温度为45-55℃，pH为4.0-6.0。进一步优选地，所述脂肪酶的催化反应温度为50℃，pH为5.0。

在所述酯交换或酯化反应中添加Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁醇以促进脂肪酶的催化反应。而加入Fe²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、EDTA、洗涤剂则可以抑制所述脂肪酶的催化反应。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供的AN0512菌株具有良好的商业前景，其发酵产酶温度稳定，培养基来源广泛，发酵生产成本低。

2、利用本发明所述方法采用常规单批发酵方式培养AN0512，以pNPP（对硝基棕榈酸苯酯）为底物测定粗酶液的酶活，其最大酶活达到30IU/ml，最适酶催化温度为27-35℃，pH为4.0-6.0；在25-60℃内具有稳定酶活，温度作用范围广。

3、应用本发明提供的方法分离纯化脂肪酶，脂肪酶比活从6.2IU/mg提高到1262.2IU/mg，酶纯度提高了203.6倍，酶活性得率为22.1%。

4、本发明提供的电泳纯脂肪酶的最适作用温度为50℃，在20-60℃酶活稳定性较好，在60℃保温30min仍有50%的酶活性，具备较好的高温耐受性；该酶的最适pH为5.0，在pH4.0-6.0内具有较好的稳定性内稳定。因此，该酶补充了工业用耐高温酸性脂肪酶的种类，具备较大的意义。

5、金属离子Cu²+、Ca²⁺、Co²⁺对该脂肪酶活性有激活作用，而且，有机试剂甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和丁醇对酶活也具有激活作用，说明该酶适用于这些有机溶剂体系的酶催化反应。

6、本发明脂肪酶应用于催化酯交换或酯化反应中，具有较高的催化效率及产品得率。本发明脂肪酶能用于食品、医药、纺织、化妆品和洗涤剂等领域。

附图说明

图1是本发明实施所得菌株AN0512在PDA培养基斜面形态图。

图2是本发明实施所得菌株AN0512菌丝体显微观察图（上图为100倍显微观察图，左图为1000倍观察图，右图为400倍显微观察图）。

图3是本发明实施所得菌株AN0512 18s rRNA基因进化树，有下划线的为本发明菌株。

图4是本发明实施所得粗酶在不同反应温度下的酶活曲线图。

图5是本发明实施所得粗酶在不同反应pH下的酶活曲线图。

图6是本发明实施过程各分离步骤获得的酶液的SDS-PAGE凝胶电泳图，分离胶的浓度为12%，从左至右的各条泳道分别为标记蛋白、盐析粗酶液、阴离子交换层析酶液、分子排阻层析酶液和粗酶液。从图中可以明显看出通过分子排阻层析后收集的脂肪酶达到了电泳纯纯度。

图7是本发明实施所得电泳纯脂肪酶在不同反应温度下的酶活曲线图。

图8是本发明实施所得电泳纯脂肪酶在不同反应pH下的酶活曲线图。

图9是金属离子对本发明实施所得脂肪酶酶活的对比图，从图中可以看出多种金属离子对该脂肪酶有激发作用，其中Cu²⁺最大。

图10是有机溶剂对本发明实施所得脂肪酶酶活的对比图，从图可以得到本发明脂肪酶在多种有机溶剂中表现出更大的酶活。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。

以pNPP（对硝基棕榈酸苯酯）为底物，采用分光光度法测定粗酶液和电泳纯脂肪酶酶活性。具体测定和计算方法如下：

测量方法：称取3mg pNPP溶于1ml异丙醇中，用作底物溶液；配制20mMpH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，并加入1‰(w/v)的阿拉伯胶，用作缓冲溶液；取50μl底物溶液加入到400μl缓冲溶液中，漩涡振荡均匀后，放入37℃水浴摇床中180r/m预热30min，然后加入同样条件下处理的酶液50μl，反应5min后加入0.5ml 0.5M Na₂CO₃终止反应，10000r/m离心3min取清液在410nm处测定吸光度。

计算方法：定义反应体系每分钟每毫升底物溶液释放1μmol 4-NPP（对硝基苯酚）为一个酶活单位（IU）。酶活计算公式如下：其中K为摩尔吸光系数，l/(mol·cm)；b为吸收层厚度，cm；A为吸光物质浓度，μmol/l；t为反应时间，min；V为反应体系体积，ml。

实施例1

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）AN0512

1、菌株AN0512的鉴定

从西藏奶渣中分离出的产脂肪酶菌株0512在PDA斜面培养基上28℃培养48h后，观察到菌落蔓延迅速，斜面长满白色菌丝，培养到72h后，菌体变为浅黄色直至黑褐色厚绒状（图1）。菌丝体显微观察结果如图2所示，不同放大倍数下的菌丝和孢子清晰可见，有的有二叉分枝，横贯或多或少，孢子呈椭圆形或圆形。根据以上形态初步确定菌株0512属于霉菌属。

为了进一步确定菌株0512的物种属性，采用PCR扩增0512的18s rRNA，扩增引物采用真菌通用引物：F：5’-CCA GTA GTC ATA TGC TCT-3’；R：5’-ACC TTG TTA CGA CTT TTA CC-3’，并测定18s rRNA的碱基序列，部分保守序列参见序列表。经由BLAST程序将上述所得序列与NCBI中已公布真菌18s rRNA序列进行比对，利用Clustalx分析软件对菌株AN0512进行同源序列比对并绘制进化树，结果如图3所示（菌株编号为各菌株18s rRNA序列在NCBI数据库中的注册号），发现菌株0512与AM270052.1 Aspergillus nigercontig An03c0110同源性最高，达到99%。故命名本发明提供的菌株为黑曲霉AN0512。

2、菌株AN0512的发酵培养

将AN0512保存于PDA斜面培养基中，4℃保存于冰箱中。

从斜面接一环菌体至含100ml种子培养基的250ml三角瓶中，28℃条件下，置于180r/min的恒温摇床上培养12h后，获得一级种子。上述种子培养基（液体培养基）组成为：磷酸二氢钾0.2%（w/w，下同），硫酸镁0.05%，氯化钾0.05%，橄榄油1%（v/w），蛋白胨1%，余量为水。

通过对发酵条件优化，获得的AN0512的最佳培养基组成和最佳培养条件。配制含橄榄油1%(v/w)、酵母提取物1%（w/w，下同）、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钾0.05%的培养基，调节pH至6.0，按1.4%（v/v）的量接入一级种子，28℃、180r/m下培养96h后，所得发酵液于4℃、10000r/m离心20min后，去菌体取上清液作为粗酶液，其酶活为30IU/ml。

实施例2

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）AN0512生产制备脂肪酶的方法

1、粗酶液的制备

配制含橄榄油0.8%(v/w)、酵母提取物2%（w/w，下同）、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钾0.05%的培养基，调节pH至7.0，121℃下灭菌后，按1.5%（v/v）的量接入一级种子，29℃、250r/m下培养90h后，所得发酵液于4℃、10000r/m离心20min后，去菌体取上清液作为粗酶液，取粗酶液进行酶学性质实验。

（1）最适反应温度：考察了温度范围为25-70℃时酶活变化，结果如图4所示，结果表明，该粗酶的最适反应温度为30℃，该粗酶在60℃时仍保留有60%以上的酶活，具有高温反应活性。

（2）最适反应pH：在最适作用温度30℃下，采用20mM Na₂HPO4-柠檬酸缓冲液（pH4.0-8.0）和20mM甘氨酸-NaOH缓冲溶液（pH8.5-10.0）调节酶反应体系的酸碱度，考察不同pH范围（4.0-10.0）内粗酶活性的变化规律，结果如图5所示。在实验所选的pH范围内，酶活出现两次峰值（pH7.0和pH 9.5），pH9.5时的酶活是pH7.0时酶活的70%，在pH7.0-9.5之间，酶活呈现先下降后上升的趋势，在pH8.5的时候达到最低，原因可能粗酶液中存有蛋白酶，在pH8.5时有最大水解活性，导致脂肪酶活力下降。

2、脂肪酶的分离纯化

配制含橄榄油1.2%（w/w，下同）、酵母提取物0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、氯化钾0.05%的培养基，调节pH至5.0，121℃下灭菌后，按1.6%（v/v）的量接入一级种子，27℃、150r/m搅拌速度培养100h后，所得发酵液于4℃、10000r/m离心20min后，去菌体取上清液作为粗酶液。

于0℃下向粗酶液中加入硫酸铵至浓度达到其饱和浓度的60%，静置于4℃冰箱内12h后，在4℃、10000r/m离心15min取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，在4℃、10000r/m离心15min，回收上清液。

经上述步骤盐析后所得上清液经透析除盐后，上样至预先用pH 7.020mM磷酸盐缓冲液平衡好的阴离子交换层析柱上，用含1mol/l NaCl磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，分部收集并合并具有脂肪酶活性的组分。

经阴离子交换层析后所得脂肪酶组分上样至预先用含0.15mol/l NaCl的20mM pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡好的分子排阻层析柱上，用相同的缓冲液进行洗脱，流速为2.6ml/min，分部收集并合并具有脂肪酶活性的组分。

以上盐析、阴离子交换层析和分子排阻层析等步骤中，脂肪酶的纯化倍数和得率如下表1所示。各步分离后获得脂肪酶组分的SDS-PAGE电泳图如图6所示，经分子排阻层析收集的脂肪酶经SDS-PAGE电泳后为单一条带，说明该脂肪酶的纯度已达到电泳纯。

表1黑曲霉脂肪酶纯化结果

实施例3

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）AN0512生产制备的脂肪酶

电泳纯脂肪酶的性质

取实施例2中经分子排阻层析收集的电泳纯脂肪酶进行脂肪酶性质实验。

（1）最适反应温度：采用pH7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲溶液配制脂肪酶活性测定反应体系，将反应体系分别置于20-70℃的温度下预热30min后测定酶活，结果如图7，由图可得该脂肪酶的最适反应温度为50℃，在60℃内仍具有50%的酶活。

（2）最适反应pH：采用不同pH范围的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配制脂肪酶催化反应体系，将反应体系于37℃反应30min后测定酶活，结果如图8，由图可得该脂肪酶的最适反应pH为5.0，pH在4.0-6.0内酶活稳定。当pH大于6.0时，脂肪酶活力急速下降。

（3）金属离子对酶活的影响：采用含金属离子为2mM的20mM pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制脂肪酶催化反应体系，将反应体系置于37℃下反应30min后测定酶活，结果如图9，由图可得，Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺对该脂肪酶有激活作用，其中Cu²⁺的激活作用最大；Fe²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺对该脂肪酶有抑作用。

（4）酶抑制剂和洗涤剂对酶活的影响：采用含酶抑制剂和洗涤剂2mM的20mM pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配制脂肪酶催化反应体系，将反应体系置于37℃下反应30min后测定酶活，结果如表2所示，可见除1,10-邻氮菲对脂肪酶活力有微弱的促进作用外，其他酶抑制剂和洗涤剂都对脂肪酶活力有抑制作用。

表2酶抑制剂和洗涤剂对酶活影响

注：ND为没有检测到酶活

（5）有机溶剂对酶活的影响：采用有机溶剂配制脂肪酶催化反应体系，将反应体系置于37℃下反应30min后测定酶活，结果如图10，由图可得，该脂肪酶对有机溶剂具有较好的耐受性。在甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇和丙酮中，脂肪酶表现出更大的酶活力，其中异丙醇中最大。异丁醇则对酶活有微弱的抑制作用，己烷和丁醚使酶完全失活。

实施例4

电泳纯脂肪酶的应用

取实施例2中经分子排阻层析收集的电泳纯脂肪酶进行脂肪酶应用实验

（1）食品工业的应用：类可可脂作为在分子组成和结晶性能上与可可脂最为接近的一类可可脂替代品，是近年来发展较为迅速的食品专用油脂之一。类可可脂广泛地应用于巧克力及相关糖果工。合成类可可脂的原料硬脂酸和棕榈油按3:1的体积比混匀，再加入等体积的异丙醇超声（400w）溶解10min，50℃下预热10min后加入1ml酶液，以180r/min的搅拌速度在相同温度下反应6h后，反应液经HPLC检测分析，结果显示，经本发明脂肪酶催化反应液中有硬脂酸含量高的类可可脂生成，且催化产率达到47.5%，较其他法具备更高的效率和产率。

（2）制药工业的应用：异维生素C棕榈酸酯，是一种安全无毒高效的酯溶性抗氧化剂，性质稳定，常添加到易氧化的药物生产中。以异维生素C和棕榈酸为原料，利用本发明脂肪酶能够高效催化合成异维生素C棕榈酸酯。反应体系是在50mL具塞锥形瓶中别加入1g异V_C和5ml棕榈酸,加入20ml异丙醇超声（400w）溶解10min，50℃预热10min后加入1ml酶液，150r/m的搅拌速度反应4h，反应液经HPLC检测分析，结果显示，经过4h的催化反应后，反应液中异维生素C棕榈酸酯的含量达到了65.2%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种黑曲霉菌株生产的脂肪酶，其特征在于，所述黑曲霉菌株为黑曲霉( Aspergillus niger)AN0512，已于2012年11月19日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6835。

2.权利要求1所述脂肪酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

将处于对数生长期的黑曲霉(Aspergillus niger)AN0512菌悬液接种于液体发酵培养基，接种量按体积百分比计为1.4％-1.6％，进行发酵培养，将得到的发酵液离心或过滤去除菌体即得粗酶液；液体发酵培养基按重量百分比计主要包括：橄榄油0.8％-1.2％，酵母提取物0.5％-2％，所述橄榄油为唯一碳源，液体发酵培养基的pH为5.0-7.0。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粗酶液还经如下分离纯化步骤：粗酶液经百分饱和浓度按重量体积比计为50-70％的硫酸铵沉淀，离心取沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，离心去沉淀，将清液透析除盐后，采用阴离子层析、分子排阻层析分离，获得电泳纯脂肪酶。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：搅拌转速150-250r/m，培养温度27-29℃，发酵时间90-100h。

5.根据权利要求2所得粗酶液的应用，其特征在于，将所述粗酶液用于催化酯交换或酯化反应，反应温度为25-60℃，pH为4.0-10.0。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应温度为27-35℃，pH为6.0-8.0。

7.根据权利要求3所得电泳纯脂肪酶的应用，其特征在于，将所述脂肪酶用于催化酯交换或酯化反应，反应温度为20-60℃，pH为3.0-8.0。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应温度为45-55℃，pH为4.0-6.0。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反应温度为50℃，pH为5.0。

10.根据权利7～9任意一项所述的应用，其特征在于，在反应中添加Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮或丁醇以促进脂肪酶的催化反应。