CN101831474B - 一种海藻糖的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海藻糖的生产方法，特别是一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，属于发酵工程及微生物技术领域。一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，包括恶臭假单胞菌培养步骤、β-巯基乙醇处理步骤和发酵步骤。本发明以麦芽糖为底物，通过制备恶臭假单胞菌的透性细胞，利用其细胞内海藻糖合酶将麦芽糖一步转化为海藻糖。经测定，用β-巯基乙醇处理的恶臭假单胞菌透性细胞溶液中约有3％-5％的海藻糖生成。
Description
技术领域
本发明涉及一种海藻糖的生产方法，特别是一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，属于发酵工程及微生物技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式为C12H22O11·2H2O，化学名α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glycopyranosyl-α-D-glycopyranoside)，是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖。广泛存在于细菌、酵母、真菌、藻类和昆虫中。海藻糖具有独特的生物学功能，可以保护蛋白质，生物膜及敏感细胞的细胞壁免受干旱、冷冻和渗透压的变化而造成的伤害，可作为不稳定药品、食品和化妆品的稳定剂、多种食品和药品甜味剂、种子的包衣、冷冻干燥菌株的保护剂等；海藻糖还可保护DNA防止放射线引起的损伤。
海藻糖的生产方法包括微生物抽提法、化学合成法、微生物发酵法、基因重组法、酶转化法等。酶转化法制取海藻糖的途径有多种，按其作用的底物，主要分为以葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物的三种方法。
1、以葡萄糖为底物
人们在研究酵母的生物合成途径时，发现酵母利用体内的6-P-海藻糖合成酶和6-P-海藻糖磷酸酯酶，经两步作用将两个葡萄糖分子转化为海藻糖。据此，Hidcki Kizawa等人在小球菌变异株菌体内提取出合成酶，转化葡萄糖为海藻糖。但这一过程需要消耗高能物质UDP或GDP，且酶活很不稳定，因此用该方法很难实现大规模的工业化生产。
2、以麦芽糖为底物
以麦芽糖为底物的酶转化法目前发现有两种。
(1)利用某些磷酸化酶由麦芽糖二步转化为海藻糖
Sawao Murao等详细研究了由麦芽糖生物合成海藻糖的途径：
第一步反应：麦芽糖在海藻糖磷酸化酶的作用下生成葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸。第二步反应是葡萄糖和β-葡萄糖-1-磷酸在海藻糖磷酸化酶作用下生成海藻糖和磷酸。日本专利曾介绍用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶处理麦芽糖就可以生产海藻糖。酶反应完成后，从反应液中除去沉淀物，含有海藻糖的液体进一步用阴离子交换树脂纯化，然后，再用一种硼酸型阴离子交换树脂吸附海藻糖，采用硼酸钾分级洗脱和收集。含有海藻糖部分经阳离子交换树脂处理和浓缩，然后加入少量乙醇蒸馏除去硼酸，最后的浓缩液用乙醇进行重结晶，可得到二水海藻糖晶体。研究表明，此法反应生产海藻糖转化率较低且酶制备及产物提取困难，不适宜于工业化生产。
(2)利用海藻糖合酶将麦芽糖-步转化为海藻糖
许多细菌中都有海藻糖合酶，如脂肪杆菌(Pimelobacter sp.)、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)、水生嗜热菌(Thermus aquaticus)等。这种酶是分子内转糖基酶，能将麦芽糖的α-1，4糖苷键转化成α-1，1糖苷键，但不作用于葡萄糖，麦芽三、四、五糖，麦芽寡糖、曲二糖、黑曲霉二糖、异麦芽糖、海藻寡糖、蔗糖、松二糖、异麦芽寡糖和乳糖。这种酶在催化麦芽糖转化为海藻糖的过程中不消耗高能物质，不需要磷酸，且转化率高达70-80％，海藻糖产率和麦芽糖的浓度(2.5％-40％)无关。这为海藻糖的大规模生产提共了有利条件。
该酶催化麦芽糖生成海藻糖的反应是：
(3)以淀粉或淀粉水解物为底物
低聚麦芽糖苷基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)是首先在节杆菌Q36中发现的，这两种酶能作用于麦芽寡糖或淀粉生成海藻糖。其中以直链淀粉为底物生产海藻糖的机理如下：
该反应分两步完成，第一步，MTSase由麦芽低聚糖(淀粉液化液)的还原性末端开始，通过分子内转苷作用，将α-1，4键转变成α-1，1键，使原麦芽低聚糖转变为带有一个海藻糖结构的麦芽低聚糖，是一种分子内转糖基酶，称为麦芽寡糖基海藻糖合酶；第二步，MTHase专一地作用于α-1，1键相邻的α-1，4键，从而使原麦芽低聚糖变为少两个葡萄糖苷的低聚糖和游离的海藻糖，称为麦芽寡糖海藻糖基水解酶。如果n-2≥3，则上述反应继续进行，所以如果反应完全，其最终产物主要为海藻糖及一部分葡萄糖和麦芽糖。
目前商品化的海藻糖主要从酵母细胞中提取，收率低且成本高，限制了海藻糖的广泛应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法。该方法通过使用试剂β-巯基乙醇，处理恶臭假单胞菌，使其改变细胞壁和细胞膜的通透性，制得透性细胞，生产出海藻糖。
本发明过程中涉及的技术方案详述如下：
一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，包括恶臭假单胞菌培养步骤、β-巯基乙醇处理步骤和发酵步骤，其特征在于，β-巯基乙醇处理步骤如下：
将经过恶臭假单胞菌培养步骤获得的菌液进行浓缩，使恶臭假单胞菌菌体占菌液的质量体积比为8％-12％的浓缩菌液，然后向浓缩菌液中加入β-巯基乙醇，使菌液中β-巯基乙醇的终浓度达到0.1％-1％，反应2小时，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液。
上述质量体积比单位为g/ml或kg/l。
优选的，所述恶臭假单胞菌菌体占菌液的质量百分比为10％。
所述的恶臭假单胞菌培养步骤，具体如下：
将恶臭假单胞菌于发酵培养基中，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养72h后即得菌液。
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO4 0.1％，NaH2PO4 0.1％，MgSO4 0.05％，水余量。
所述的发酵步骤，具体如下：
向经过β-巯基乙醇处理步骤制得的恶臭假单胞菌透性细胞溶液中，加入麦芽糖，使麦芽糖的终浓度为10wt％，培养10-14小时，离心或过滤，得到海藻糖溶液。经检测，海藻糖溶液的海藻糖含量为3％-5％。
优选的，所述的恶臭假单胞菌购自中国科学院微生物研究所，名称：恶臭假单胞菌(PseudOmonasputida)，代号：As1.1003。
本发明有益效果如下
本发明以麦芽糖为底物，通过制备恶臭假单胞菌的透性细胞，利用其细胞内海藻糖合酶将麦芽糖一步转化为海藻糖。经过β-巯基乙醇处理的恶臭假单胞菌细胞，细胞膜的选择透过性被破坏，海藻糖可以自由排到细胞外，而海藻糖合酶属于大分子蛋白质，可以留在细胞内。当细胞膜具有选择性时，由于细胞内产生的海藻糖不会排到细胞外，因此细胞内海藻糖的浓度不断升高，当细胞内海藻糖的浓度达到一定浓度后，海藻糖合酶停止转化，因此，细胞膜具有选择性的恶臭假单胞菌细胞培养液中并没有海藻糖生成，并且海藻糖产量有限；当细胞膜不具有选择性时，细胞内产生的海藻糖会随时扩散到培养液中，因此，只有当培养液中海藻糖的浓度达到特定浓度后，海藻糖合酶才会停止转化，因此，培养液中可以获得大量海藻糖。经测定，同样的酶解条件下，没有用β-巯基乙醇处理的恶臭假单胞菌透性细胞溶液没有任何海藻糖生成，而用β-巯基乙醇处理的恶臭假单胞菌透性细胞溶液有3％-5％的海藻糖生成。
附图说明
图1是未经处理的恶臭假单胞菌细胞溶液和经过β-巯基乙醇处理后的恶臭假单胞菌透性细胞溶液加入等量麦芽糖在相同条件下酶解后，通过薄层层析后的层析图谱；
其中：图上部黑色处为麦芽糖，下部黑色处为海藻糖，第一泳道为未经处理的恶臭假单胞菌细胞溶液，第二泳道为经过β-巯基乙醇处理后的恶臭假单胞菌透性细胞溶液。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。
实施例中所用培养基成分麦芽糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4均为市售产品。
恶臭假单胞菌购自中国科学院微生物研究所，名称：恶臭假单胞菌(Pseud Omonasputida)，代号：As1.1003。
实施例1
取恶臭假单胞菌，经30℃、180r/min摇床发酵培养72h。发酵培养基为：麦芽糖2wt％，蛋白胨0.5wt％，牛肉膏0.2wt％，K2HPO4 0.1wt％，NaH2PO4 0.1wt％，MgSO4 0.05wt％，余量水。发酵培养后4800r/min离心20min，制得浓缩菌液100mL，其中含有菌体10g。向上述浓缩菌液中加入0.5mL的β-巯基乙醇，反应2h，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液，然后，向制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液中加入10g麦芽糖，反应12h，离心后，取上清液，即得到含有4g海藻糖的海藻糖溶液。
实施例2
取恶臭假单胞菌，经30℃、180r/min摇床发酵培养72h。发酵培养基为：麦芽糖2wt％，蛋白胨0.5wt％，牛肉膏0.2wt％，K2HPO4 0.1wt％，NaH2PO4 0.1wt％，MgSO4 0.05wt％，余量水。发酵培养后10000r/min离心5min，制得浓缩菌液50mL，其中含有菌体5g。向上述浓缩菌液中加入0.5mL的β-巯基乙醇，反应2h，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液，然后，向制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液中加入5g麦芽糖，反应12h，离心后，取上清液，即得到含有2g海藻糖的海藻糖溶液。
实施例3
取恶臭假单胞菌，经30℃、180r/min摇床发酵培养72h。发酵培养基为：麦芽糖2wt％，蛋白胨0.5wt％，牛肉膏0.2wt％，K2HPO4 0.1wt％，NaH2PO4 0.1wt％，MgSO4 0.05wt％，余量水。发酵培养后8000r/min离心10min，制得浓缩菌液1000mL，其中含有菌体80g。向上述浓缩菌液中加入8mL的β-巯基乙醇，反应2h，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液，然后，向制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液中加入100g麦芽糖，反应12h，离心后，取上清液，即得到含有31g海藻糖的海藻糖溶液。将该海藻糖溶液与在相同条件下培养的未经处理的恶臭假单胞菌细胞溶液通过薄层层析后，发现约有30％的麦芽糖转化为海藻糖。层析图谱见图1。
实施例4
取恶臭假单胞菌，经30℃、180r/min摇床发酵培养72h。发酵培养基为：麦芽糖2wt％，蛋白胨0.5wt％，牛肉膏0.2wt％，K2HPO4 0.1wt％，NaH2PO4 0.1wt％，MgSO4 0.05wt％，余量水。发酵培养后5000r/min离心20min，制得浓缩菌液15mL，其中含有菌体1.6g。向上述浓缩菌液中加入0.1mL的β-巯基乙醇，反应2h，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液，然后，向制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液中加入1.5g麦芽糖，反应12h，离心后，取上清液，即得到含有0.6g海藻糖的海藻糖溶液。
Claims (3)
1.一种利用恶臭假单胞菌生产海藻糖的方法，包括恶臭假单胞菌培养步骤、β-巯基乙醇处理步骤和发酵步骤，其特征在于，β-巯基乙醇处理步骤如下：
将经过恶臭假单胞菌培养步骤获得的菌液进行浓缩，使恶臭假单胞菌菌体占菌液的质量体积比为8％-12％的浓缩菌液，单位为g/ml，然后向浓缩菌液中加入β-巯基乙醇，使菌液中β-巯基乙醇的体积终浓度达到0.1％-1％，反应2小时，制得恶臭假单胞菌透性细胞溶液；
所述的恶臭假单胞菌培养步骤，具体如下：
将恶臭假单胞菌于发酵培养基中，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养72h后即得菌液；
所述的发酵步骤，具体如下：
向经过β-巯基乙醇处理步骤制得的恶臭假单胞菌透性细胞溶液中，加入麦芽糖，使麦芽糖的终浓度为10wt％，培养10-14小时，离心或过滤，得到海藻糖溶液。
2.如权利要求1所述的生产海藻糖的方法，其特征在于，所述恶臭假单胞菌菌体占菌液的质量体积比为10％。
3.如权利要求1所述的生产海藻糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO4 0.1％，NaH2PO4 0.1％，MgSO4 0.05％，水余量。
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