CN105713948A - 利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 - Google Patents
利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105713948A CN105713948A CN201410714207.5A CN201410714207A CN105713948A CN 105713948 A CN105713948 A CN 105713948A CN 201410714207 A CN201410714207 A CN 201410714207A CN 105713948 A CN105713948 A CN 105713948A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- dark
- clostridium
- saccharifying
- light
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种利用混合菌种对淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：(1)液化；(2)糖化；(3)暗发酵产氢；(4)光发酵产氢；(5)纯化。本发明的方法产氢率、产氢速率、底物利用率和能量转化效率均十分优异。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源生产技术领域，具体涉及一种利用混合菌种对淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气的方法。
背景技术
化石燃料的使用会导致全球变暖，从而对环境造成巨大影响，而氢气以其清洁、高能量和可循环利用的特点，被普遍认为是化石燃料的理想替代能源。目前，利用生物质原料发酵生产氢气正在吸引越来越多的关注。这是因为生物质发酵不但可以提供清洁的氢能源，同时还可以消除生物质有机废弃物对环境造成的污染。其反应条件温和、能量需求小，具有无可替代的优势。
在生物质发酵产氢领域，昂贵的原料成本和低下的产氢率是制约生物制氢发展和应用的主要因素。而淀粉质原料是一种廉价易得的生物质，在全球范围内均广泛存在。富含淀粉的生物质主要有大米、玉米、小麦等粮食作物，以及马铃薯、山药、薯类等根茎类作物。例如在全世界热带地区广泛种植的木薯(ManihotesculentaCrant)，其主要含有水分(60-70％)、淀粉(15-20％)和游离糖(4-6％)。木薯能在贫瘠和干旱的土地生长，不与粮食作物竞争种植地且产量很高，因而被认为是理想的能源作物。据联合国粮食农业组织(FAO)统计，目前全球木薯年产量约为2.5亿吨，产值约为1000亿美元，其中一半以上分布在非洲地区。尼日利亚是全球最大的木薯生产国，年产量达4500万吨，产值约为180亿美元，占非洲地区总产量的三分之一。亚洲地区鼓励将木薯应用于工业与新能源方面，该地区产量约占全球的三分之一，其中泰国产量2500万吨，80％用于出口，出口额约为80亿美元。印度尼西亚产量约为2200万吨左右。中国木薯年产量在800～900万吨。目前，木薯主要被应用于化工和纺织领域，少部分被用来制取燃料乙醇。将木薯用于生物发酵制取氢气(H2)，将为解决能源问题做出重大贡献。
就产氢率而言，传统的利用生物质的暗发酵产氢由于能源转化效率低，产氢率很低；并且，发酵残余液中含有大量有机酸和醇类等副产物，既浪费了能量又污染了环境。例如，CN102041274A公开了一种利用专性厌氧的丁酸梭菌发酵制氢的方法，应用筛选出的专性厌氧菌丁酸梭菌JCM1391，在无菌厌氧条件下，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示剂和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制取氢气。CN101988075A公开了一种利用专性厌氧的巴氏梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌巴氏梭菌JCM1408T，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等营养物和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵和连续发酵的方式进行制取氢气。CN102373238A公开了一种嗜热芽孢杆菌及其在发酵产氢中的应用，利用筛选出的嗜热芽孢杆菌菌株对污泥进行水解预处理，再利用水解后的污泥/或有机废弃物发酵产氢。上述方法均使用单一菌种，培养和产氢条件苛刻。并且，上述方法的产氢效率易受发酵参数影响，产氢效率不高。CN103290090A构建了一种梭菌、肠杆菌、酵母菌混合菌群生物制氢方法。该方法的产氢效率略有提高，但由于单纯暗发酵制氢的理论产率最高只有4mol/mol六碳糖，所以仅仅使用暗发酵一种发酵方式，产氢效率不可能获得突破性提高。
为提高产氢率和能量利用率，非专利文献1以木薯淀粉为底物，以牛粪堆肥混合菌种作为暗发酵混合菌种，以类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)作为光发酵菌种进行暗-光耦合发酵产氢，然而，该研究在光合发酵时使用单一菌种，对营养条件、生长环境和工艺参数的调控要求很高，上述工艺参数的微小改变均会影响产氢效果。此外，该研究的工作体积只有30-40mL，与小试、中试研究和实际生产相差太远，难以将该制氢工艺直接放大放大或进行工业化应用。
可见，如何将生物制氢的理念实用化，开发稳健(rubustness)、产氢率、产氢速率、底物利用率和能量转化效率高的方法，仍是亟待解决的技术问题。
[非专利文献1]暗—光藕联两步法生物制氢及相关技术的研究，宗文明，2009年安徽农业大学博士论文。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用混合菌种对淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)液化：向作为发酵底物的淀粉质原料溶液中加入α-淀粉酶进行液化；
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后将所述糖化酶灭活；
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，接入暗发酵混合产氢菌种和暗发酵培养基进行暗发酵，将气相产物(主要为H2、CO2)导出；
(4)光发酵产氢：将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵混合产氢菌种和光发酵培养基进行光发酵，将气相产物(主要为H2、CO2)导出；
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化。
在本发明的优选实施方式中，还可包括在步骤(1)的液化之前进行加热糊化的步骤，将作为发酵底物的淀粉质原料溶液加热糊化。
具体而言，本发明是通过如下技术方案实现的：
1.一种利用混合菌种对淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)液化：向作为发酵底物的淀粉质原料溶液中加入α-淀粉酶进行液化；
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后将所述糖化酶灭活；
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，接入暗发酵混合产氢菌种和暗发酵培养基进行暗发酵，将气相产物导出；
(4)光发酵产氢：将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵混合产氢菌种和光发酵培养基进行光发酵，将气相产物导出；
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化。
2.如段落1所述的方法，所述方法还包括在步骤(1)的液化之前进行加热糊化的步骤，将作为发酵底物的淀粉质原料溶液加热糊化。
3.如段落2所述的方法，其中，所述加热糊化在80℃～120℃的高压蒸汽锅或者高温烘箱中进行。
4.如段落2所述的方法，其中，所述加热糊化的时间为5～30分钟。
5.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)的淀粉质原料选自于粮食作物淀粉、根茎类作物淀粉或上述物质的混合物，其中，所述粮食作物为玉米、小麦或大米，所述根茎类作物为马铃薯、山药、木薯或甘薯。
6.如段落5所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述淀粉质原料溶液的浓度为5-100g/L。
7.如段落5所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所加入的α-淀粉酶与淀粉质原料的质量比以干重计为0.001～0.1。
8.如段落5所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述液化在50℃～70℃进行。
9.如段落5所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述液化的pH为5.0～7.0。
10.如段落5所述的方法，其中，所述步骤(1)中，所述液化的时间为0.5～5小时。
11.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所加入的糖化酶与淀粉质原料的质量比以干重计为0.001～0.1。
12.如段落11所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述糖化在40℃～65℃进行。
13.如段落11所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述糖化的pH为4.0～5.0。
14.如段落11所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述糖化的时间为5～30小时。
15.如段落11所述的方法，其中，所述步骤(2)中，在所述糖化完成后，通过在100℃加热10分钟对所述糖化酶进行灭活。
16.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为选自于由丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、热纤维梭菌所组成的组中的两种以上菌种的混合物。
17.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌和产气肠杆菌的混合物。
18.如段落17所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与产气肠杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)。
19.如段落18所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与产气肠杆菌的接种量之比为(20％-80％):(20％-80％)。
20.如段落19所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与产气肠杆菌的接种量之比为50％:50％。
21.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的混合物。
22.如段落21所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)。
23.如段落22所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的接种量之比为(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)。
24.如段落23所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的接种量之比为50％:30％:20％。
25.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌和热纤维梭菌的混合物。
26.如段落25所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与热纤维梭菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)。
27.如段落26所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与热纤维梭菌的接种量之比为(20％-80％):(20％-80％)。
28.如段落27所述的方法，其中，所述丁酸梭菌与热纤维梭菌的接种量之比为70％:30％。
29.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的混合物。
30.如段落29所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)。
31.如段落30所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的接种量之比为(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％):(20％-50％)。
32.如段落31所述的方法，其中，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的接种量之比为40％:20％:15％:25％。
33.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵培养基为：4g/L的蛋白胨、0.5g/L的L-半胱氨酸、4g/L的NaCl、0.1g/L的MgCl2、0.1g/L的FeCl2、1.5g/L的K2HPO4、10ml的维生素液、以及10ml的微量元素液；
其中，所述维生素液的成分为：0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；
所述微量元素液的成分为：0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2。
34.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，按照与糖化步骤(2)后得到的溶液相等的体积加入所述暗发酵培养基。
35.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。
36.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵的溶液温度为30℃～37℃。
37.如段落16所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵的发酵溶液pH值为6.0～7.0。
38.如段落1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)中，在将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍，再进行光发酵。
39.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合产氢菌种为选自于由红螺菌属、红假单胞菌属和红杆菌属所组成的组中的两种以上菌种的混合物。
40.如段落39所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合产氢菌种为选自于由深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红杆菌所组成的组中的两种以上菌种的混合物。
41.如段落40所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的混合物。
42.如段落41所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)。
43.如段落42所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的接种量之比为(20％-80％):(20％-80％)。
44.如段落43所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的接种量之比为50％:50％。
45.如段落40所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物。
46.如段落45所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)。
47.如段落46所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)。
48.如段落47所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为50％:25％:25％。
49.如段落40所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合菌种为球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物。
50.如段落49所述的方法，其中，所述球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)。
51.如段落50所述的方法，其中，所述球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(20％-80％):(20％-80％)。
52.如段落51所述的方法，其中，所述球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为60％:40％。
53.如段落40所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌。
54.如段落53所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)。
55.如段落54所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌的接种量之比为(20％-60％):(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％)。
56.如段落55所述的方法，其中，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌的接种量之比为40％:30％:15％:15％。
57.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵培养基为：0.5g/L的KH2PO4、0.6g/L的K2HPO4、0.2g/L的NaCl、0.2g/L的MgSO4、0.05g/L的CaCl2·2H2O、2.0g/L的NaHCO3、1.87g/L的谷氨酸钠、1.0ml的维生素液、以及1.0ml的微量元素液；
其中，所述微量元素液的成分为：2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；
所述维生素液的成分为：0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12。
58.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，按照与任选稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入所述光发酵培养基。
59.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。
60.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述所述光发酵的溶液温度为28℃～35℃。
61.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵的发酵溶液pH值为6.0～7.0。
62.如段落38所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵的光照度为2000lux～10000lux。
有益效果
本发明对淀粉质原料连续进行加热糊化(任选步骤)、液化和糖化的有益效果在于：通过对淀粉质原料进行加热糊化，淀粉的颗粒状结构被打开，具有长链的大分子淀粉被部分转化为短链的小分子糊精和低聚糖；在随后的α-淀粉酶的作用下，淀粉α-1,4糖苷键被随机地切断，大部分淀粉转化为短链的小分子糊精、低聚糖以及少量单糖；最后，在糖化酶的作用下，小分子糊精和低聚糖从其非还原端开始，α-1,4糖苷键被连续水解，从而释放单葡萄糖分子。链长越短，该过程进行得越快。糖化酶也水解α-1,6糖苷键，但速度较慢。对淀粉质原料底物进行加热糊化、α-淀粉酶水解和糖化酶糖化处理后获得的小分子单糖更加容易被产氢菌利用，显著提高了产氢菌对底物的吸收和利用效率，提高了产氢率和产氢速率。
另一方面，本发明通过利用暗发酵与光发酵耦合的两步产氢，显著提高了发酵过程的整体产氢率、产氢速率、底物利用率和能量转化效率。光发酵的进行使得暗发酵尾液中的小分子有机酸等副产物几乎被全部利用，极大地降低了生物制氢过程中的污染物排放。具体而言，暗发酵结束后，光发酵产氢步骤所使用的光发酵细菌在光照条件下可以利用暗发酵尾液中残留的乙酸、丁酸等小分子有机酸副产物进行再次发酵，生成H2和CO2(反应式1)。暗发酵与光发酵耦合的两步产氢法可以将己糖的理论产氢率从单纯暗发酵的4molH2/mol六碳糖提高到12molH2/mol六碳糖(反应式2)，突破性地提高了整体发酵过程的理论和实际产氢率。
(反应式1)
C6H12O6+6H2O→12H2+6CO2(反应式2)
特别地，通过在暗发酵步骤和光发酵步骤中使用混合产氢菌种替代现有技术中的单一产氢菌种，有效地利用菌群内部不同菌种间的协同产氢机制，解决了单一产氢菌种对培养条件要求严格和产氢率偏低的技术难题，降低了产氢菌的培养难度，显著提高了产氢率、产氢速率、底物转化率和能量转化效率。
附图说明
图1是根据本发明方法的工艺流程图。
具体实施方式
下文将详细阐述本发明。
本发明装置中的暗发酵反应器为现有技术的常规反应器，如塞流式反应器(PFR)、完全混合式反应器(CSTR)、厌氧接触反应器(ACR)、升流式厌氧污泥床(UASB)、升流式固体反应器(USR)、膨胀颗粒污泥床(EGSB)、内循环厌氧反应器(IC)、外循环厌氧反应器(EC)、厌氧序批间歇式反应器(ASBR)、折流式反应器(ABR)、厌氧滤器(AF)、纤维填料床(FPB)、复合厌氧反应器(UBF)、厌氧流化床(FBR)、厌氧膨胀床(ESB)、干发酵反应器(DA)，或本领域已知的其它适合进行暗发酵反应的装置。
本发明装置中的光发酵反应器为封闭式光生物反应器，可以是柱状式光生物反应器或管状式光生物反应器、板式光生物反应器、光源内置发酵罐式光生物反应器或光导纤维光生物反应器，优选光源内置发酵罐式光生物反应器，或本领域已知的其它适合进行光发酵反应的装置。
对于本发明的液化步骤(1)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择淀粉质原料的种类、原料溶液的浓度、α-淀粉酶加入量以及相应的液化条件。在本发明的一个实施方式中，淀粉质原料为：粮食作物淀粉，例如玉米、小麦、大米等的淀粉；以及根茎类作物淀粉，例如马铃薯、山药、木薯、甘薯等的淀粉；或上述物质的混合物。在本发明的一个实施方式中，淀粉质原料溶液的浓度为5-100g/L。在本发明的一个实施方式中，所加入的α-淀粉酶与淀粉质原料(以干重计)的质量比为0.001～0.1。在本发明的一个实施方式中，液化温度为50℃～70℃。在本发明的一个实施方式中，液化pH为5.0～7.0。在本发明的一个实施方式中，液化时间为0.5～5小时。
对于本发明的糖化步骤(2)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择糖化酶加入量、相应的糖化条件以及对糖化酶进行灭活的条件。在本发明的一个实施方式中，所加入的糖化酶与淀粉质原料(以干重计)的质量比为0.001～0.1。在本发明的一个实施方式中，糖化温度为40℃～65℃。在本发明的一个实施方式中，糖化pH为4.0～5.0。在本发明的一个实施方式中，糖化时间为5～30小时。在本发明的一个实施方式中，糖化完成后，通过在100℃加热10分钟对糖化酶进行灭活。
对于本发明的暗发酵产氢步骤(3)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择暗发酵培养基的组成、暗发酵培养基加入量、暗发酵产氢菌种的种类、暗发酵产氢菌种的接种量以及相应的暗发酵条件等。在本发明的一个实施方式中，暗发酵培养基的组成为：4g/L的蛋白胨；0.5g/L的L-半胱氨酸；4g/L的NaCl；0.1g/L的MgCl2；0.1g/L的FeCl2；1.5g/L的K2HPO4；10ml的维生素液；以及10ml的微量元素液。其中，所述维生素液的成分为(g/L)：抗坏血酸，0.025；柠檬酸，0.02；叶酸，0.01；对氨基苯甲酸，0.01。所述微量元素液(g/L)的成分为：MnCl2，0.01；ZnCl2，0.05；H3BO3，0.01；CaCl2，0.01；AlK(SO4)2，0.01。在本发明的一个实施方式中，按照与糖化步骤(2)后得到的溶液相等的体积加入暗发酵培养基。在本发明的一个实施方式中，暗发酵产氢菌种为选自于由丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)所组成的组中的两种以上菌种的混合物。在本发明的一个实施方式中，暗发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。在本发明的一个实施方式中，暗发酵的发酵溶液温度为30℃～37℃。在本发明的一个实施方式中，暗发酵的发酵溶液pH值为6.0～7.0。在本发明的暗发酵产氢步骤结束后，气相产物主要为H2、CO2，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙酸、丁酸等小分子有机酸。
在进一步优选的实施方式中，暗发酵产氢步骤(3)采用下述菌种混合物之一来进行：(a)丁酸梭菌和产气肠杆菌的混合物，二者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(20％-80％):(20％-80％)、最优选为50％:50％；(b)丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的混合物，三者的接种量之比优选为(5％-90％):(5％-90％):(5％-90％)、更优选为(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)、最优选为50％:30％:20％；(c)丁酸梭菌和热纤维梭菌的混合物，二者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(20％-80％):(20％-80％)；最优选为70％:30％；或(d)丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的混合物，四者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)，更优选为(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％):(20％-50％)、最优选为40％:20％:15％:25％。
对于本发明的光发酵产氢步骤(4)，本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择暗发酵尾液的稀释程度、光发酵培养基的组成、光发酵培养基的加入量、光发酵产氢菌种的种类、光发酵产氢菌种的接种量以及相应的光发酵条件等。在本发明的一个实施方式中，在将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍。在本发明的一个实施方式中，光发酵培养基的组成为：0.5g/L的KH2PO4；0.6g/L的K2HPO4；0.2g/L的NaCl；0.2g/L的MgSO4；0.05g/L的CaCl2·2H2O；2.0g/L的NaHCO3；1.87g/L的谷氨酸钠；1.0ml的维生素液；以及1.0ml的微量元素液。其中，所述微量元素液的成分为(g/L)：EDTA-2Na，2.0；FeSO4·7H2O，2.0；ZnCl2，0.1；Cu(NO3)2·5H2O，0.05；MnCl2·4H2O，0.1；NiCl2·6H2O，0.02。所述维生素液的成分为(g/L):生物素，0.1；烟酸，0.35；对氨基甲苯，0.2；泛酸钙，0.1；维生素B12，0.05。在本发明的一个实施方式中，按照与稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入光发酵培养基。在本发明的一个实施方式中，光发酵混合产氢菌种为选自于由红螺菌属(Rhodospirillum)、红假单胞菌属(Rhodopseudanonas)和红杆菌属(Rhodobacter)所组成的组中的两种以上菌种的混合物，例如深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonaspalustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)、球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)中的两种以上菌种的混合物。在本发明的一个实施方式中，光发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L。在本发明的一个实施方式中，光发酵的发酵溶液温度为28℃～35℃。在本发明的一个实施方式中，光发酵pH值为6.0～7.0。在本发明的一个实施方式中，光发酵的光照度为2000lux～10000lux。
在进一步优选的实施方式中，暗发酵产氢步骤(4)采用下述菌种混合物之一来进行：(a)沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的混合物，二者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(20％-80％):(20％-80％)、最优选50％:50％；(b)沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物，三者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)、最优选为50％:25％:25％；(c)球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物，二者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(20％-80％):(20％-80％)、最优选60％:40％；或(d)沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌，四者的接种量之比优选为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、更优选为(20％-60％):(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％)、最优选为40％:30％:15％:15％。
在本发明的优选实施方式中，还可包括在步骤(1)的液化之前进行的加热糊化步骤，将作为发酵底物的淀粉质原料溶液加热糊化。本领域技术人员可根据本说明书的记载适当地选择相应的加热糊化条件。在本发明的一个实施方式中，加热糊化在80℃～120℃的高压蒸汽锅或者高温烘箱中进行。在本发明的一个实施方式中，加热糊化的时间为5～30分钟。
实施例
借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。
本发明实施例中使用的高压蒸汽锅为上海博迅实验有限公司YXQ-LS-75SII型号，高温烘箱为上海博迅实验有限公司GZX-9070MBE型号。所使用的木薯淀粉购自琼中奔鹿淀粉有限公司，玉米淀粉、小麦淀粉和马铃薯淀粉均购自徐州市绿然食品有限公司，α-淀粉酶为国药集团化学试剂有限公司64003436型号，糖化酶为国药集团化学试剂有限公司64021360型号，光照采用上海博迅实验有限公司SPX-300I-G型号微电脑光照培养箱。
本发明实施例使用的暗发酵反应器为内循环厌氧反应器；光发酵反应器为封闭式光生物反应器。
本发明实施例所采用的菌株来源为：
丁酸梭菌：浙江省微生物研究所，编号为20036；
产气肠杆菌：浙江省微生物研究所，编号为20051；
阴沟肠杆菌：浙江省微生物研究所，编号为10450；
热纤维梭菌：浙江省微生物研究所提供，编号为17261；
沼泽红假单胞菌：浙江省微生物研究所，编号为15007；
球形红杆菌：浙江省微生物研究所，编号为18626；
荚膜红假单胞菌：浙江省微生物研究所，编号为13366；
深红红螺菌：浙江省微生物研究所，编号为15005。
在以下的实施例和对比例中，如果没有其它特别说明，所使用的暗发酵培养基和光发酵培养基的组成如下：
暗发酵培养基：4g/L的蛋白胨；0.5g/L的L-半胱氨酸；4g/L的NaCl；0.1g/L的MgCl2；0.1g/L的FeCl2；1.5g/L的K2HPO4；10ml的维生素液；10ml的微量元素液。其中维生素液的成分为(g/L)：抗坏血酸，0.025；柠檬酸，0.02；叶酸，0.01；对氨基苯甲酸，0.01。微量元素液(g/L)的成分为：MnCl2，0.01；ZnCl2，0.05；H3BO3，0.01；CaCl2，0.01；AlK(SO4)2，0.01。
光发酵培养基：0.5g/L的KH2PO4；0.6g/L的K2HPO4；0.2g/L的NaCl；0.2g/L的MgSO4；0.05g/L的CaCl2·2H2O；2.0g/L的NaHCO3；1.87g/L的谷氨酸钠；1.0ml的维生素液；1.0ml的微量元素液。其中,微量元素液的成分为(g/L)：EDTA-2Na，2.0；FeSO4·7H2O，2.0；ZnCl2，0.1；Cu(NO3)2·5H2O，0.05；MnCl2·4H2O，0.1；NiCl2·6H2O，0.02。维生素液的成分为(g/L)：生物素，0.1；烟酸，0.35；对氨基甲苯，0.2；泛酸钙，0.1；维生素B12，0.05。
在本发明各实施例中，根据如下方法测定发酵尾液中的有机酸：
使用带有氢火焰离子检测器(FID)的气相色谱仪(GC，型号：ThermoFiniganTrace2000，美国)来测定液相成分及其含量。气相色谱仪中的色谱柱型号为DB-Waxtre(φ5mm×2m)，实验中程序升温方法：初始温度50℃，保持2min，升温速率为10℃/min，终止温度为210℃，停留2min。运行时载气为He，流量为50ml/min；H2和空气流量分别为35ml/min和350ml/min，检测器温度为280℃，柱温为240℃。测试样pH调至2.0左右，进样量为1.0μl。实验中标准溶液中含有浓度为0.05％(V/V)的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸，测试样品得到相应色谱图后，通过出峰时间和峰面积对比得到发酵液的各成分及其含量。
在本发明各实施例中，根据公式1计算产氢率：
产氢率＝(步骤(3)产生气体的体积(mL)×步骤(3)气相产物中氢气的体积浓度(％)+步骤(4)产生气体的体积(mL)×步骤(4)气相产物中氢气的体积浓度(％))×氢气的密度(g/mL)/(氢气的摩尔质量(g/mol)×1000×底物固体重量(g)(公式1)
其中，氢气的密度为0.089g/L；氢气的摩尔质量为2g/mol；1000为mol换算为mmol的系数。气相产物中氢气的体积浓度利用气相色谱法测定。
在本发明各实施例中，根据公式2计算产氢速率：
t时刻的产氢速率＝((t+Δt)时刻的总产气量(mL)×(t+Δt)时刻气相产物中氢气的体积浓度(％)-t时刻的总产气量(mL)×t时刻气相产物中氢气的体积浓度(％))/发酵溶液的体积(L)/Δt(h)(公式2)
其中，Δt是t时刻的增量(h)，Δt趋近于0时即为t时刻的产氢速率。计算最大产氢速率时根据不同时刻的总产氢量做出产氢曲线，然后对曲线求导，即可得到不同时刻的产氢速率，据此可得到最大产氢速率。实施例1：利用混合菌种，对木薯淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气
将浓度为10g/L的木薯淀粉溶液置于115℃的高压蒸汽锅中，加热糊化15分钟。然后进行如下步骤：
(1)液化：向经步骤(1)加热糊化后的木薯淀粉溶液中加入α-淀粉酶进行液化；所加入的α-淀粉酶与木薯淀粉的质量比为0.05，控制液化温度为60℃，液化pH为6.0，时间为2小时。
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后，通过在100℃加热10分钟对糖化酶进行灭活；所加入的糖化酶与淀粉的质量比为0.05，控制糖化温度为45℃，糖化pH为4.0，时间为18小时。
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，按照暗发酵培养基与糖化后溶液为1:1的体积比加入暗发酵培养基，随后接入暗发酵混合产氢菌种，所述暗发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；所述暗发酵混合产氢菌种为50％丁酸梭菌和50％产气肠杆菌，控制暗发酵发酵溶液温度为35℃，暗发酵pH值为7.0，保持黑暗厌氧环境，进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙酸、丁酸等小分子有机酸。
(4)光发酵产氢：以转速为8000rpm对步骤(4)的暗发酵尾液沉淀离心10分钟，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，并接入光发酵混合产氢菌种。所述光发酵混合产氢菌种为50％沼泽红假单胞菌和50％球形红杆菌，所述光发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；控制光发酵发酵溶液温度为30℃，光发酵pH值为7.0，光照度为6000lux，保持厌氧环境，进行光发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2和CO2)。
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化，获得H2产品。
对尾液中的有机酸进行测定并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。可以看出，暗发酵尾液中的乙酸、丁酸等小分子有机酸几乎被全部利用。
实施例2：利用混合菌种，对玉米淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气
将浓度为20g/L的玉米淀粉溶液置于120℃的高温烘箱中，加热糊化10分钟。然后进行如下步骤：
(1)液化：向经步骤(1)加热糊化后的玉米淀粉溶液中加入α-淀粉酶进行液化；所加入的α-淀粉酶与玉米淀粉的质量比为0.03，控制液化温度为58℃，液化pH为6.2，时间为4小时。
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后，通过在100℃加热10分钟对糖化酶进行灭活；所加入的糖化酶与淀粉的质量比为0.03，控制糖化温度为40℃，糖化pH为4.3，时间为16小时。
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，按照暗发酵培养基与糖化后溶液为1:1的体积比加入暗发酵培养基，随后接入暗发酵混合产氢菌种，所述暗发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；所述暗发酵混合产氢菌种为50％丁酸梭菌和30％产气肠杆菌和20％阴沟肠杆菌，控制暗发酵发酵溶液温度为33℃，暗发酵pH值为6.8，保持黑暗厌氧环境，进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙酸、丁酸等小分子有机酸。
(4)光发酵产氢：以转速为8000rpm对步骤(4)的暗发酵尾液沉淀离心10分钟，并用去离子水稀释4倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，并接入光发酵混合产氢菌种。所述光发酵混合产氢菌种为50％沼泽红假单胞菌、25％球形红杆菌和25％荚膜红假单胞菌，所述光发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；控制光发酵发酵溶液温度为28℃，光发酵pH值为6.2，光照度为5000lux，保持厌氧环境，进行光发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2和CO2)。
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化，获得H2产品。
对尾液中的有机酸进行测定并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。可以看出，暗发酵尾液中的乙酸、丁酸等小分子有机酸几乎被全部利用。
实施例3：利用混合菌种，对小麦淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气
将浓度为30g/L的小麦淀粉溶液置于105℃的高压蒸汽锅中，加热糊化25分钟。然后进行如下步骤：
(1)液化：向经步骤(1)加热糊化后的小麦淀粉溶液中加入α-淀粉酶进行液化；所加入的α-淀粉酶与小麦淀粉的质量比为0.03，控制液化温度为62℃，液化pH为5.8，时间为1.5小时。
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后，通过在100℃加热10分钟对糖化酶进行灭活；所加入的糖化酶与淀粉的质量比为0.03，控制糖化温度为58℃，糖化pH为4.5，时间为20小时。
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，按照暗发酵培养基与糖化后溶液为1:1的体积比加入暗发酵培养基，随后接入暗发酵混合产氢菌种，所述暗发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；所述暗发酵混合产氢菌种为70％丁酸梭菌和30％热纤维梭菌，控制暗发酵发酵溶液温度为36℃，暗发酵pH值为7.0，保持黑暗厌氧环境，进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙酸、丁酸等小分子有机酸。
(4)光发酵产氢：以转速为8000rpm对步骤(4)的暗发酵尾液沉淀离心10分钟，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，并接入光发酵混合产氢菌种。所述光发酵混合产氢菌种为60％球形红杆菌和40％荚膜红假单胞菌，所述光发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；控制光发酵发酵溶液温度为32℃，光发酵pH值为7.0，光照度为7000lux，保持厌氧环境，进行光发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2和CO2)。
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化，获得H2产品。
对尾液中的有机酸进行测定并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。可以看出，暗发酵尾液中的乙酸、丁酸等小分子有机酸几乎被全部利用。
实施例4：利用混合菌种，对马铃薯淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气
将浓度为40g/L的马铃薯淀粉溶液置于95℃的高温烘箱中，加热糊化18分钟。随后进行如下步骤：
(1)液化：向经步骤(1)加热糊化后的马铃薯淀粉溶液中加入α-淀粉酶进行液化；所加入的α-淀粉酶与马铃薯淀粉的质量比为0.06，控制液化温度为68℃，液化pH为6.5，时间为3小时。
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后，通过在100℃加热10分钟对糖化酶进行灭活；所加入的糖化酶与淀粉的质量比为0.06，控制糖化温度为45℃，糖化pH为4.8，时间为25小时。
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，按照暗发酵培养基与糖化后溶液为1:1的体积比加入暗发酵培养基，随后接入暗发酵混合产氢菌种，所述暗发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；所述暗发酵混合产氢菌种为40％丁酸梭菌、20％产气肠杆菌、15％阴沟肠杆菌和25％热纤维梭菌，控制暗发酵发酵溶液温度为32℃，暗发酵pH值为7.0，保持黑暗厌氧环境，进行暗发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2、CO2)，液相产物为暗发酵尾液，所述暗发酵尾液中含有乙酸、丁酸等小分子有机酸。
(4)光发酵产氢：以转速为8000rpm对步骤(4)的暗发酵尾液沉淀离心10分钟，并用去离子水稀释3倍，随后按照光发酵培养基与稀释后的暗发酵尾液为1:1的体积比加入光发酵培养基，并接入光发酵混合产氢菌种。所述光发酵混合产氢菌种为40％沼泽红假单胞菌、30％球形红杆菌、15％荚膜红假单胞菌和15％深红红螺菌，所述光发酵混合产氢菌种的接种量是整个发酵体积的10％；控制光发酵发酵溶液温度为33℃，光发酵pH值为6.5，光照度为8500lux，保持厌氧环境，进行光发酵产氢。不再产生氢气视为发酵结束。发酵结束后收集气相产物(主要为H2和CO2)，与步骤(3)收集的气相产物合并并纯化，获得H2产品。
对尾液中的有机酸进行测定并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。可以看出，暗发酵尾液中的乙酸、丁酸等小分子有机酸几乎被全部利用。
对比例1：不经过加热糊化的氢气制取结果
与实施例1类似，不经过加热糊化的步骤，直接将10g/L的木薯淀粉进行步骤(1)的液化和步骤(2)的糖化，随后的暗发酵条件、菌种和光发酵条件、菌种均与实施例1相同。对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。
对比例2：暗发酵产氢
与实施例1类似，在与实施例1相同的条件下进行加热糊化、液化、糖化、暗发酵产氢，不进行光发酵产氢。对暗发酵后尾液中的有机酸进行测定并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。暗发酵尾液中有机酸含量为3.65g/L，产氢率和最大产氢速率结果如表1所示。对比例3：采用单一的暗发酵产氢菌种
与实施例1类似，唯一的不同在于，步骤(3)加入的暗发酵产氢菌种为单一菌种丁酸梭菌。在与实施例1相同的条件下进行加热糊化、液化、糖化、暗发酵产氢及光发酵产氢。并对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。
对比例4：采用单一的光发酵产氢菌种
与实施例1类似，唯一的不同在于，步骤(4)加入的光发酵产氢菌种为单一菌种沼泽红假单胞菌。在与实施例1相同的条件下进行加热糊化、液化、糖化、暗发酵产氢及光发酵产氢。对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。
对比例5：采用其它比例
与实施例1类似，唯一的不同在于，步骤(3)加入的暗发酵混合产氢菌种为丁酸梭菌和产气肠杆菌(二者的比例为6.4:4.8，即，非专利文献1中使用的比例)。在与实施例1相同的条件下进行加热糊化、液化、糖化、暗发酵产氢及光发酵产氢。对整个发酵过程中的产氢率、最大产氢速率进行测定。结果如表1所示。
表1产氢率和最大产氢速率
| 产氢率(mmol H2/g) | 最大产氢速率(mL/L/h) | |
| 实施例1 | 17.5 | 119.9 |
| 实施例2 | 17.6 | 138.9 |
| 实施例3 | 17.8 | 188.0 |
| 实施例4 | 18.0 | 229.3 |
| 对比例1 | 14.6 | 98.2 |
| 对比例2 | 12.3 | 80.5 |
| 对比例3 | 15.0 | 102.4 |
| 对比例4 | 15.2 | 99.0 |
| 对比例5 | 15.6 | 105.6 |
Claims (9)
1.一种利用混合菌种对淀粉质原料进行两步法发酵制取氢气的方法，所述方法包含如下步骤：
(1)液化：向作为发酵底物的淀粉质原料溶液中加入α-淀粉酶进行液化；
(2)糖化：向经步骤(1)液化后的溶液中加入糖化酶进行糖化，糖化后将所述糖化酶灭活；
(3)暗发酵产氢：在暗发酵反应器中加入步骤(2)糖化后的溶液，接入暗发酵混合产氢菌种和暗发酵培养基进行暗发酵，将气相产物导出；
(4)光发酵产氢：将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，作为光发酵产氢的底物，接入光发酵混合产氢菌种和光发酵培养基进行光发酵，将气相产物导出；
(5)纯化：将步骤(3)和步骤(4)的气相产物合并，并对H2进行纯化。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在步骤(1)的液化之前进行加热糊化的步骤，将作为发酵底物的淀粉质原料溶液加热糊化；优选地，所述加热糊化在80℃～120℃的高压蒸汽锅或者高温烘箱中进行；更优选地，所述加热糊化的时间为5～30分钟。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(1)具有如下条件中的一个或多个：
所述淀粉质原料选自于粮食作物淀粉、根茎类作物淀粉或上述物质的混合物，其中，所述粮食作物为玉米、小麦或大米，所述根茎类作物为马铃薯、山药、木薯或甘薯；
所述淀粉质原料溶液的浓度为5-100g/L；
所加入的α-淀粉酶与淀粉质原料的质量比以干重计为0.001～0.1；
所述液化在50℃～70℃进行；
所述液化的pH为5.0～7.0；和/或
所述液化的时间为0.5～5小时。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)具有如下条件中的一个或多个：
所加入的糖化酶与淀粉质原料的质量比以干重计为0.001～0.1；
所述糖化在40℃～65℃进行；
所述糖化的pH为4.0～5.0；
所述糖化的时间为5～30小时；和/或
在所述糖化完成后，通过在100℃加热10分钟对所述糖化酶进行灭活。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)中，所述暗发酵混合菌种为选自于由丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、热纤维梭菌所组成的组中的两种以上菌种的混合物；
优选地，所述暗发酵混合菌种为下述情况中的一种：
所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌和产气肠杆菌的混合物，优选地，所述丁酸梭菌与产气肠杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-80％):(20％-80％)、更优选50％:50％；
所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的混合物，优选地，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌和阴沟肠杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、优选(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)、更优选50％:30％:20％；
所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌和热纤维梭菌的混合物；优选地，所述丁酸梭菌与热纤维梭菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-80％):(20％-80％)、更优选70％:30％；或者
所述暗发酵混合菌种为丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的混合物，优选地，所述丁酸梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和热纤维梭菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％):(20％-50％)、更优选40％:20％:15％:25％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)具有如下条件中的一个或多个：
所述暗发酵培养基为：4g/L的蛋白胨、0.5g/L的L-半胱氨酸、4g/L的NaCl、0.1g/L的MgCl2、0.1g/L的FeCl2、1.5g/L的K2HPO4、10ml的维生素液、以及10ml的微量元素液；其中，所述维生素液的成分为0.025g/L抗坏血酸、0.02g/L柠檬酸、0.01g/L叶酸、以及0.01g/L对氨基苯甲酸；所述微量元素液的成分为0.01g/LMnCl2、0.05g/LZnCl2、0.01g/LH3BO3、0.01g/LCaCl2以及0.01g/LAlK(SO4)2；
按照与糖化步骤(2)后得到的溶液相等的体积加入所述暗发酵培养基；
所述暗发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L；
所述暗发酵的溶液温度为30℃～37℃；和/或
所述暗发酵的发酵溶液pH值为6.0～7.0。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)中，在将步骤(3)得到的暗发酵尾液沉淀、离心后，用去离子水稀释2-6倍，再进行光发酵。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)中，所述光发酵混合产氢菌种为选自于由红螺菌属、红假单胞菌属和红杆菌属所组成的组中的两种以上菌种的混合物；优选地，所述光发酵混合产氢菌种为选自于由深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红杆菌所组成的组中的两种以上菌种的混合物；
优选地，所述光发酵混合产氢菌种为下述情况中的一种：
所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的混合物，优选地，所述沼泽红假单胞菌和球形红杆菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-80％):(20％-80％)、更优选50％:50％；
所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物，优选地，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、优选(30％-70％):(20％-60％):(15％-50％)、更优选50％:25％:25％；
所述光发酵混合菌种为球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的混合物，优选地，所述球形红杆菌和荚膜红假单胞菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-80％):(20％-80％)、更优选60％:40％；或者
所述光发酵混合菌种为沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌，优选地，所述沼泽红假单胞菌、球形红杆菌、荚膜红假单胞菌和深红红螺菌的接种量之比为(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％):(5％-95％)、优选(20％-60％):(20％-50％):(10％-40％):(10％-40％)、更优选40％:30％:15％:15％。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述步骤(4)具有下述条件中的一个或多个：
所述光发酵培养基为：0.5g/L的KH2PO4、0.6g/L的K2HPO4、0.2g/L的NaCl、0.2g/L的MgSO4、0.05g/L的CaCl2·2H2O、2.0g/L的NaHCO3、1.87g/L的谷氨酸钠、1.0ml的维生素液、以及1.0ml的微量元素液；其中，所述微量元素液的成分为2.0g/LEDTA-2Na、2.0g/LFeSO4·7H2O、0.1g/LZnCl2、0.05g/LCu(NO3)2·5H2O、0.1g/LMnCl2·4H2O、以及0.02g/LNiCl2·6H2O；所述维生素液的成分为0.1g/L生物素、0.35g/L烟酸、0.2g/L对氨基甲苯、0.1g/L泛酸钙、以及0.05g/L维生素B12；
按照与任选稀释后的暗发酵尾液相等的体积加入所述光发酵培养基；
所述光发酵混合产氢菌种的接种量为：菌种的种子培养液占整个发酵体积的10％(v/v)，并且所述种子培养液中所述菌种种子的浓度不低于2.0g/L；
所述所述光发酵的溶液温度为28℃～35℃；
所述光发酵的发酵溶液pH值为6.0～7.0；和/或
所述光发酵的光照度为2000lux～10000lux。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410714207.5A CN105713948A (zh) | 2014-12-01 | 2014-12-01 | 利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410714207.5A CN105713948A (zh) | 2014-12-01 | 2014-12-01 | 利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105713948A true CN105713948A (zh) | 2016-06-29 |
Family
ID=56145833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410714207.5A Pending CN105713948A (zh) | 2014-12-01 | 2014-12-01 | 利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105713948A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107723314A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-02-23 | 河南工程学院 | 一种提高天然混合菌源nadh途径产氢量的方法 |
| CN107981039A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-05-04 | 吴豪 | 一种利用餐厨垃圾生产高纯度氢气和动物饲料的方法 |
| CN109438069A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-08 | 中山市承铭农业技术开发有限公司 | 一种利用糖厂下脚料制作氨基酸液体肥料的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101041832A (zh) * | 2007-04-20 | 2007-09-26 | 重庆大学 | 一种利用沼泽红假单胞菌制氢的方法 |
| CN102061279A (zh) * | 2010-11-22 | 2011-05-18 | 河北省微生物研究所 | 高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法 |
| CN102181485A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-14 | 同济大学 | 一种促进有机废水光合细菌产氢的方法 |
| CN103290090A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 甘肃省商业科技研究所 | 一种利用梭菌、肠杆菌、酵母菌混合菌群发酵制氢的方法 |
-
2014
- 2014-12-01 CN CN201410714207.5A patent/CN105713948A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101041832A (zh) * | 2007-04-20 | 2007-09-26 | 重庆大学 | 一种利用沼泽红假单胞菌制氢的方法 |
| CN102061279A (zh) * | 2010-11-22 | 2011-05-18 | 河北省微生物研究所 | 高密度发酵生产沼泽红假单胞菌发酵液的方法 |
| CN102181485A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-14 | 同济大学 | 一种促进有机废水光合细菌产氢的方法 |
| CN103290090A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 甘肃省商业科技研究所 | 一种利用梭菌、肠杆菌、酵母菌混合菌群发酵制氢的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘维: "固定化包埋细胞颗粒暗发酵及光合产氢与降解特性", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技II辑》 * |
| 刘颖: "暗发酵细菌与光发酵细菌两步法联合产氢研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊） 工程科技I辑》 * |
| 钟耕主编: "《谷物科学原理》", 31 December 2012, 郑州大学出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107723314A (zh) * | 2017-11-27 | 2018-02-23 | 河南工程学院 | 一种提高天然混合菌源nadh途径产氢量的方法 |
| CN107723314B (zh) * | 2017-11-27 | 2020-09-04 | 河南工程学院 | 一种提高天然混合菌源nadh途径产氢量的方法 |
| CN107981039A (zh) * | 2017-12-20 | 2018-05-04 | 吴豪 | 一种利用餐厨垃圾生产高纯度氢气和动物饲料的方法 |
| CN109438069A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-08 | 中山市承铭农业技术开发有限公司 | 一种利用糖厂下脚料制作氨基酸液体肥料的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Fermentative hydrogen production from macro-algae Laminaria japonica using anaerobic mixed bacteria | |
| Ngo et al. | Thermophilic fermentative hydrogen production from xylose by Thermotoga neapolitana DSM 4359 | |
| CN104130952B (zh) | 一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用 | |
| CN102746992B (zh) | 一种利用污泥水解液异养培养小球藻的方法 | |
| CN103045489B (zh) | 一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法 | |
| CN105713926A (zh) | 一种利用纤维素作为原料制取氢气的方法 | |
| CN102206687B (zh) | 一种植物乳杆菌生物转化共轭亚油酸的方法 | |
| CN109355318A (zh) | 一种发酵生产丁酸的方法 | |
| CN101831474B (zh) | 一种海藻糖的生产方法 | |
| CN105713948A (zh) | 利用混合菌种对淀粉质原料进行发酵制取氢气的方法 | |
| CN101608192A (zh) | 一种利用玉米芯生产丁二酸的方法 | |
| CN105754925A (zh) | 一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法 | |
| CN102433262B (zh) | 一种适用于低温沼气发酵的复合微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN105713927A (zh) | 利用包埋菌种发酵制取氢气的方法 | |
| CN105713925A (zh) | 一种利用纤维素作为原料制取氢气的方法 | |
| CN105567779A (zh) | 一种高产低分子量热凝胶的发酵方法 | |
| CN104073524B (zh) | 一种富碳微藻固体酸糖化发酵制备燃料乙醇的方法 | |
| CN102417888B (zh) | 一株利用木薯为原料生产丁醇的丙酮丁醇梭菌及其应用 | |
| CN102337305B (zh) | 丙酮丁醇产生菌发酵菊芋生产丁醇的方法 | |
| CN106755184B (zh) | 干巴菌菌丝体多糖及其制备方法和应用 | |
| CN103255084B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌7172及其应用 | |
| CN102161971B (zh) | 一种用于生产纤维素酶和半纤维素酶的发酵菌剂 | |
| CN102660584B (zh) | 一种利用海洋脱硫酸基卡拉胶进行乙醇转化的方法 | |
| CN103834698B (zh) | 一种通过温度转换发酵生产含γ‑亚麻酸油脂的方法 | |
| CN102154249A (zh) | 一种生产高活力β-葡萄糖苷酶的培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160629 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |