CN105754925A - 一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，包括以下步骤：（1）酵母菌活化：对库德毕赤酵母进行活化，活化后的库德毕赤酵母接种到液体培养基中培养；（2）酵母菌胁迫处理：将活化的库德毕赤酵母接种到含有0.1?20%物质A的液体培养基中，进行胁迫培养；所述的物质A为盐类；（3）耐高温酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母离心收集菌体，得到的高温耐性库德毕赤酵母。本发明可大幅度提高库德毕赤酵母的高温耐性，有利于解决酵母菌常温发酵产生的高能耗问题，降低发酵成本，对库德毕赤酵母的工业化应用具有重要的推动作用。

Description

一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高酵母菌高温耐性的方法，特别是一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，属于生物化工领域。
背景技术
石油、煤炭等不可再生资源的日益枯竭与环境的日益恶化已经成为影响人类可持续发展的重大障碍。第二代燃料乙醇具有清洁、原料来源广泛、可再生等诸多优点，有望替代传统化石能源，缓解当前人类社会面临的日趋严重的能源危机及环境污染等问题。利用微生物将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为乙醇，已成为解决世界能源危机的一条理想途径。
酵母菌是乙醇发酵生产最常用的微生物，传统酵母菌的发酵最适温度为28-33℃，然而酵母菌发酵属于放热过程，随着发酵的不断进行会造成发酵体系温度升高，为了保持酵母菌的活性，需要大量冷却水降低发酵温度，增加了发酵成本。采用耐高温酵母菌生产乙醇，可以省去传统常温发酵所需要的大量冷却水以及高昂的冷却设备投资和运行费用，对于提高乙醇的发酵效率和乙醇的蒸馏回收都十分有利。尤其是在纤维类废弃物的乙醇生产过程中，耐高温酵母的使用可以更好的适应纤维素酶解温度（45-50℃），有利于同步糖化发酵的进行，极大地增加乙醇的发酵效率。因此，如何提高酵母菌的高温耐性成为当前国内外乙醇发酵行业研究的热点。
目前，国内外的研究人员主要通过适应性驯化或遗传操作策略包括杂交育种、诱变育种、基因工程等方法对酵母菌的高温耐性进行改造。但是这些方法不同程度存在着操作困难、筛选随机性大、酵母菌耐热稳定性差等缺点。通过引入外源耐热基因在分子水平上改造酵母菌高温耐性虽然已有报道，但是研究不系统，而且在重组酵母构建过程中作为标记基因的抗生素抗性基因的引入会对人体健康造成潜在危害。
在对耐性微生物应激防御机制的研究中发现，多种胁迫共同作用会对微生物产生交互保护作用，即当微生物对某一种逆境因子启动防御保护时，会激发多种与压力胁迫相关基因的表达，促使微生物对其他逆境因子的抵抗能力也得到了增强。库德毕赤酵母是一种耐高温酵母菌，该酵母菌在28-44℃下生长良好，在46℃下仍能生长繁殖。据报道，库德毕赤酵母在高温条件下（>40℃）具有良好的乙醇生产能力。另外，库德毕赤酵母还能够耐受多种胁迫条件，如高浓度盐、高浓度乙醇、高渗透压、强酸等，可以适应复杂的乙醇发酵生产环境，在乙醇的工业化生产中有良好的应用前景。如能进一步提高库德毕赤酵母的高温耐性，对于库德毕赤酵母的工业化应用具有重要的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，有利于解决库德毕赤酵母常温发酵产生的高能耗问题，降低发酵成本。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，包括以下步骤：
（1）酵母菌活化：对库德毕赤酵母进行活化，活化后的库德毕赤酵母接种到液体培养基中培养；
（2）酵母菌胁迫处理：将活化的库德毕赤酵母接种到含有0.1-20%物质A的液体培养基中，进行胁迫培养，控制培养条件为：接种量1-10%，恒温26-33℃，摇床转速100-300rpm，培养12-50h；所述的物质A为盐类；
（3）耐高温酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母离心收集菌体，得到的库德毕赤酵母具有更强的高温耐性，可用于后续高温条件下的乙醇发酵生产或其他方面的应用。
所述步骤(1)中活化后的库德毕赤酵母接种到液体培养基中培养的条件：26-33℃恒温摇瓶培养12-30h。
本发明步骤（2）所述盐类包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和硝酸钠中的一种或两种以上的混合物。
步骤（1）中所述活化操作如下：将斜面保藏的库德毕赤酵母接种到新鲜的斜面培养基上，26-33℃恒温培养12-30h。所述斜面培养基为YEPD斜面培养基、麦芽汁斜面培养基或其他适合酵母菌生长的斜面培养基。
所述步骤（1）和（2）所述的液体培养基可以是YEPD培养基、麦芽汁培养基或其他适合酵母菌生长的培养基。
所述步骤(3)中离心速度为1000-12000rpm。
本发明提供了一种简单、安全、高效的提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，本发明基于交互保护作用原理，库德毕赤酵母经一定压力胁迫适应后能够获得更强的高温高温耐性。可大幅度提高库德毕赤酵母的高温耐性，与适应性驯化、杂交育种、诱变育种、基因工程等方法相比，方法简单，操作方便，而且无需进行分子生物学实验，本发明有利于解决酵母菌常温发酵产生的高能耗问题，降低发酵成本，对库德毕赤酵母的工业化应用具有重要的推动作用。
本发明方法所得的高温耐性库德毕赤酵母应用于乙醇发酵生产过程，可大幅度提高酵母菌的乙醇生产能力，降低发酵成本。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细说明。
实施例1
（1）酵母菌活化：将斜面保藏的库德毕赤酵母接种到新鲜的YEPD斜面培养基上，30℃恒温培养24h。将斜面活化后的库德毕赤酵母接种到YEPD液体培养基中，30℃、180rpm恒温摇瓶培养24h。
（2）酵母菌胁迫处理：将活化好的库德毕赤酵母接种到含有6%氯化钠的YEPD液体培养基中，进行胁迫培养，控制培养条件为：接种量2%，恒温30℃，摇床转速180rpm，培养24h。
（3）酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母4000rpm离心收集菌体。
（4）酵母菌高温耐性分析：将获得的库德毕赤酵母以终浓度为0.1g/L（干重）接种到YEPD液体培养基中，恒温45℃，摇床转速180rpm，培养24h，其生物量是未胁迫处理库德毕赤酵母在同等培养条件下生物量的3.1倍。
实施例2
（1）酵母菌活化：将斜面保藏的库德毕赤酵母接种到新鲜的麦芽汁斜面培养基上，28℃恒温培养30h。将斜面活化好的库德毕赤酵母接种到麦芽汁液体培养基中，28℃、150rpm恒温摇瓶培养36h。
（2）酵母菌胁迫处理：将活化好的库德毕赤酵母接种到含有12%氯化钾的麦芽汁液体培养基中，进行胁迫培养，控制培养条件为：接种量6%，恒温28℃，摇床转速150rpm，培养48h。
（3）耐高温酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母3000rpm离心收集菌体。
（4）酵母菌高温耐性分析：将获得的库德毕赤酵母以终浓度为0.1g/L（干重）接种到麦芽汁液体培养基中，恒温45℃，摇床转速150rpm，培养24h，其生物量是未胁迫处理库德毕赤酵母在同等培养条件下生物量的3.7倍。
实施例3
（1）酵母菌活化：将斜面保藏的库德毕赤酵母接种到新鲜的YEPD斜面培养基上，28℃恒温培养18h。将斜面活化好的库德毕赤酵母接种到YEPD液体培养基中，28℃、200rpm恒温摇瓶培养18h。
（2）酵母菌胁迫处理：将活化好的库德毕赤酵母接种到含有6%硝酸钠的YEPD液体培养基中，进行胁迫培养，控制培养条件为：接种量4%，恒温28℃，摇床转速200rpm，培养48h。
（3）耐高温酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母5000rpm离心收集菌体。
（4）酵母菌高温耐性分析：将获得的库德毕赤酵母以终浓度为0.1g/L（干重）接种到YEPD液体培养基中，恒温45℃，摇床转速200rpm，培养24h，其生物量是未胁迫处理库德毕赤酵母在同等培养条件下生物量的2.2倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）酵母菌活化：对库德毕赤酵母进行活化，活化后的库德毕赤酵母接种到液体培养基中培养；
（2）酵母菌胁迫处理：将活化的库德毕赤酵母接种到含有0.1-20%物质A的液体培养基中，进行胁迫培养，控制培养条件为：接种量1-10%，恒温26-33℃，摇床转速100-300rpm，培养12-50h，所述的物质A为盐类；
（3）耐高温酵母菌收集：将胁迫处理完后的库德毕赤酵母离心收集菌体，得到的高温耐性库德毕赤酵母。
2.根据权利要求1所述提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，所述步骤（2）所述盐类包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和硝酸钠中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，所述步骤(1)中活化后的库德毕赤酵母接种到液体培养基中培养的条件：26-33℃恒温摇瓶培养12-30h。
4.根据权利要求1或2或3所述提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，所述步骤（1）和（2）所述的液体培养基为YEPD培养基或麦芽汁培养基。
5.根据权利要求4所述提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，所述步骤（1）中所述活化操作如下：将斜面保藏的库德毕赤酵母接种到新鲜的斜面培养基上，26-33℃恒温培养12-30h。
6.根据权利要求5所述提高库德毕赤酵母高温耐性的方法，其特征是，所述斜面培养基为YEPD斜面培养基或麦芽汁斜面培养基。
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