CN107723314A - 一种提高天然混合菌源nadh途径产氢量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液；第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢。本发明以NAD⁺合成前体烟酰胺、烟碱、烟酸为生长因子，通过影响天然混合菌源暗发酵NADH产氢途径，能够显著提高产氢量，并大幅降低发酵废液中各种挥发性脂肪酸、醇的浓度，降低了发酵废液后续处理的难度，是NADH产氢途径的创新，为低成本、简单可行的产氢方法提供了新的途径，为生物制氢提供了新的研究方向，具有良好的社会和经济效益。

Description

一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及提高微生物产氢量的方法，尤其是涉及一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法。

背景技术

随着我国工业的迅速发展，各行业对资源的需求日益增加。目前所利用的能源主要是煤炭、石油、天然气等化石资源，但它们的储量有限。尤其是石油资源，据国家统计局官网的数据显示：2016年中国原油进口量为3.76亿吨，对外依存度达到65.5％。国际能源署预测：到2030年我国石油对外依存度将达到80％。另一方面，化石资源的大量开采和使用，造成一系列环境问题，如酸雨、臭氧层空洞、温室效应、大范围持久的雾霾天气等。因此开发清洁、高效的可再生能源势在必行。

众所周知，氢能是一种高效、零污染的清洁能源。可以通过电解水、利用化石能源(如石油裂解制合成气、天然气制氢等)等方法获得氢气。前者能量消耗大，后者受原料价格影响，制氢成本高，应用都受到限制。生物制氢过程条件温和，制氢原料主要为各种废弃的生物质资源，原料来源广泛，廉价易得。因此，生物制氢具有良好的发展前景。生物制氢包括光驱动与厌氧发酵两种方式。绿藻和蓝藻等可通过直接或间接光解水制氢，这两种制氢过程都不能利用有机物，不能减少有机废弃物的污染，同时都需要光照，并且水光解产生的氧气对反应有抑制效应。光合细菌如深红螺菌、深红假单胞菌等可以在光照条件下，利用各种小分子有机酸产生氢气，该过程不存在氧的抑制，但产氢过程需要光照，光能利用率低，也不易进行放大试验。与前三种生物制氢方法相比，暗发酵制氢具有不受光照限制、产氢速率快、稳定性好、发酵设备简单、可利用底物范围广等优点。尤其采用天然混合菌源暗发酵产氢过程，对培养条件要求相对较低，在发酵制氢前不需要对底物进行灭菌处理，更适合工业放大。

目前，暗发酵制氢实现产业化的关键在于底物转化率低，只有探索提高氢转化率的方法和途径，降低暗发酵制氢的生产成本才能促进其早日实现工业化。

日本学者Tanisho等发现兼性厌氧菌Enterobacter aerogenes可以通过甲酸裂解途径及细胞内NADH再生途径产氢。目前，在微生物发酵产氢中对胞内NADH/NAD⁺的调控主要分为内源基因工程改造和外源生化过程调节两种。徐方成通过敲除adhE基因构建得到基因工程菌K.oxytoca ME-3，其甲酸裂解途径产氢活性不变，而NADH途径产氢活性提高，与野生菌株相比总产氢量提高9％。由于辅酶在胞内代谢中的分布相当复杂，对其进行基因改造具有极大的盲目性，尤其对于基因背景信息不确定的菌株，很多情况下难以达到预期的目的。而另一种方法—外源生化过程调节可以作为有效的替代方法。利用生化工程的手段，即采用胞外控制的策略来实现胞内辅酶状态及代谢流的改变。清华大学的张翀在研究Enterobacter aerogenes“NADH途径”产氢的分子机制的基础上，采用外源添加NAD⁺的方法能够强化菌株的产氢代谢，使连续培养体系的产氢率由1.41mol/mol-葡萄糖提高到1.52mol/mol-葡萄糖，产氢量提高了7.8％。张翀等在后续研究中发现，在连续培养时，外源NADH的添加导致菌株“NADH途径”产氢减弱，而“甲酸途径”增强，最终总产氢量降低。而外源添加NAD⁺，效果刚好相反。上述研究结果表明，外源NADH和NAD⁺的添加可能会影响胞内NADH/NAD⁺比值发生改变，进而影响NADH代谢途径。

众所周知，NADH和NAD⁺分子较大，难以直接通过细胞膜进入胞内产生作用。同时，NADH极不稳定，在光照、酸性条件、有空气或水分存在的条件下其分子结构都会被破坏；同样，NAD⁺也极不稳定，在光照、碱性环境、加热和水分存在下也极易被破坏。为保证其稳定性，NADH和NAD⁺在使用时要求较高，同时也因为NADH和NAD⁺价格昂贵，所以，采用外源添加NADH或NAD⁺的方式来提高菌源产氢量的方法不适合大规模工业生产。目前，迫切需要开发一种低成本的生化工程手段，达到提高菌源产氢量的目的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，该方法具有简单可行、能耗低、生产成本低、可有效提高天然混合菌源产氢量的优点。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，

第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液；

第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢；

所述的NAD⁺合成前体为烟酰胺、烟碱、烟酸。

第一步的具体方法为：将牛粪堆肥和水按照重量比1:4的比例混合，搅拌均匀，密封，采用输出功率为2450W的微波炉处理1.5min后，处理液过60目筛，滤液加入种子培养基进行富集培养，在35-37℃、120rpm的条件下，驯化培养9-10h，制得种子液。

所述的种子培养基成分包括：10g/L蔗糖、1g/L NH₄HCO₃、0.2g/L KH₂PO₄，自然pH。

所述的种子液中菌种总浓度为1×10⁷-1×10⁸cfu/mL。

第二步的具体方法为：将20mL种子液和NAD⁺合成前体加入装有1g葡萄糖、0.5mL营养液的血清瓶中，用蒸馏水补充体积至50mL，再用稀碱或稀酸溶液调节pH7-8，即为发酵体系；在血清瓶中通入氮气后密封血清瓶，振荡培养，进行发酵产氢。

所述的营养液成分包括：2.0g/L NH₄HCO₃、1.0g/L KH₂PO₄、0.1g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L NaCl、0.01g/L Na₂MoO₄·2 H₂O、0.01g/L CaCl₂·2 H₂O、0.015g/L MnSO₄·7 H₂O、0.00278g/L FeCl₂。

优选的，所述的烟酰胺在发酵体系中的初始浓度为8mg/L；所述的烟碱在发酵体系中的初始浓度为2×10^-3mL/L；所述的烟酸在发酵体系中的初始浓度为8mg/L。

所述的振荡培养条件为：温度35-37℃，转速120rpm，时间38h。

与现有的生物制氢方法相比，本发明具有以下优势：

(1)现有报道的提高微生物NADH途径产氢主要针对单一的兼性厌氧纯菌种，为防止杂菌污染，培养基需要经过灭菌处理，发酵过程要求也非常严格。本发明采用天然混合菌源，产氢微生物种类多，对培养基及培养条件要求低，省去了培养基灭菌工序，节省了动力、水等方面的消耗，大大降低了生产成本；

(2)现有报道采用胞外控制策略提高E.aerogenes产氢量的方法是向培养基中添加NADH或NAD⁺，而NADH和NAD⁺具有稳定性差、价格昂贵、不能直接进入微生物细胞等特点，使用受到限制。本发明所添加的NAD⁺合成前体烟酰胺、烟碱和烟酸，可以解决上述直接添加NADH或NAD⁺的不足，并且在成本上更具有优势；

(3)现有报道，在分批培养体系中，外源添加NADH或NAD⁺能够提高E.aerogene的产氢能力，在最优浓度0.7mM下，外源NADH能够使E.aerogene氢气转化率从0.924mol-H₂/mol-葡萄糖提高到1.174mol-H₂/mol-葡萄糖，外源NAD⁺能够提高到1.1mol-H₂/mol-葡萄糖。本发明中采用天然混合菌源，在多种产氢微生物的协同作用下氢气转化率更高，添加适量烟酰胺、烟碱和烟酸的条件下，可使氢气转化率分别由1.46、1.48和1.50mol-H₂/mol-葡萄糖提高到1.84、1.74和1.67mol-H₂/mol-葡萄糖，葡萄糖利用率更高。

本发明以NAD⁺合成前体烟酰胺、烟碱、烟酸为生长因子，通过影响天然混合菌源暗发酵NADH产氢途径，能够显著提高产氢量，并大幅降低发酵废液中各种挥发性脂肪酸、醇的浓度，降低了发酵废液后续处理的难度，是NADH产氢途径的创新，为低成本、简单可行的产氢方法提供了新的途径，为生物制氢提供了新的研究方向，具有良好的社会和经济效益。

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

种子培养基成分为：10g/L蔗糖、1g/L NH₄HCO₃、0.2g/L KH₂PO₄，自然pH。

营养液成分为：2.0g/L NH₄HCO₃、1.0g/L KH₂PO₄、0.1g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/LNaCl、0.01g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.01g/L CaCl₂·2H₂O、0.015g/L MnSO₄·7H₂O、0.00278g/LFeCl₂。

实施例1、烟酰胺

一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，包括以下步骤：

第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液：将牛粪堆肥和水按照重量比1:4的比例混合，搅拌均匀，密封，采用输出功率为2450W的微波炉处理1.5min后，处理液过60目筛，滤液加入种子培养基进行富集培养，在35-37℃、120rpm的条件下，驯化培养9-10h，制得种子液(种子液中菌种总浓度为1×10⁷-1×10⁸cfu/mL)；

第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体烟酰胺作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢：将20mL种子液和烟酰胺加入装有1g葡萄糖、0.5mL营养液的血清瓶中，用蒸馏水补充体积至50mL，再用稀碱或稀酸溶液调节pH7-8，即为发酵体系，在血清瓶中通入氮气(充入氮气排出空气)后密封血清瓶，在35-37℃、120rpm的条件下振荡培养38h，进行发酵产氢。

烟酰胺在发酵体系中的初始浓度分别为：0mg/L、4mg/L、8mg/L、12mg/L和20mg/L，对应的产氢量结果见表1。

暗发酵制氢过程产生的气体主要为H₂和CO₂，为防止CO₂在水中溶解，本发明中采用排饱和食盐水的方法测定发酵过程中所产混合气体的体积。

累积产氢量的测定方法为：按一定时间间隔用排饱和食盐水的方法排出发酵瓶内气体，测量气体体积；通过气相色谱测定气体中氢气的含量。

累积产氢量按下述公式计算：

V_i＝V_i-1+C_iΔV_i+V₀(C_i-C_i-1) (1)

其中：V_i：累积i次的产氢量(mL)；ΔV_i：第i次排出气体的体积(mL)；C_i：第i次排出的气体中氢气的含量；V₀：反应器液面上空的体积(mL)；

单位累积产氢量的计算公式如下：

H＝V/m (2)

其中:H：单位累积产氢量(mL H₂/g-底物)；V：累积产氢量(mL)；m：反应底物的质量(g)。

表1烟酰胺添加对产氢量及主要副产物的影响

从表1可以看出，当发酵体系中加入NAD⁺合成前体烟酰胺时，能够大幅提高牛粪堆肥的产氢量，同时能够有效降低副产物挥发性脂肪酸、醇的生成，降低后续发酵废液的处理难度。其中，当发酵体系中NAD⁺合成前体烟酰胺的初始浓度为8mg/L时，效果最佳，累积产氢量相对于对照组(烟酰胺0mg/L)提高25.9％，对菌源产氢效果的提高非常明显；发酵废液中主要酸醇如乙醇、乙酸、丙酸和丁酸的浓度较对照组分别下降2.3％、28.8％、7.7％和9.4％。

实施例2、烟碱

一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，包括以下步骤：

第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液：将牛粪堆肥和水按照重量比1:4的比例混合，搅拌均匀，密封，采用输出功率为2450W的微波炉处理1.5min后，处理液过60目筛，滤液加入种子培养基进行富集培养，在35-37℃、120rpm的条件下，驯化培养9-10h，制得种子液(种子液中菌种总浓度为1×10⁷-1×10⁸cfu/mL)；

第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体烟碱作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢：将20mL种子液和烟碱加入装有1g葡萄糖、0.5mL营养液的血清瓶中，用蒸馏水补充体积至50mL，再用稀碱或稀酸溶液调节pH7-8，即为发酵体系，在血清瓶中通入氮气(充入氮气排出空气)后密封血清瓶，在35-37℃、120rpm的条件下振荡培养38h，进行发酵产氢。

烟碱在发酵体系中的初始浓度分别为：0mL/L、10^-4mL/L、10^-3mL/L、2×10^-3mL/L、10^-2mL/L和2×10^-2mL/L，对应的产氢量结果见表2。

表2烟碱添加对产氢量及主要副产物的影响

从表2可以看出，当发酵体系中加入NAD⁺合成前体烟碱时，能够有效提高牛粪堆肥的产氢量，同时能够有效降低副产物挥发性脂肪酸、醇的生成，降低后续发酵废液的处理难度。其中，当发酵体系中NAD⁺合成前体烟碱的初始浓度为2×10^-3mL/L时，效果最佳，累积产氢量相对于对照组(烟碱0mL/L)提高18.1％；发酵废液中主要酸醇如乙醇、乙酸、丙酸和丁酸的浓度较对照组分别下降3.4％、9.9％、6.2％和12.7％。

实施例3、烟酸

一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，包括以下步骤：

第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液：将牛粪堆肥和水按照重量比1:4的比例混合，搅拌均匀，密封，采用输出功率为2450W的微波炉处理1.5min后，处理液过60目筛，滤液加入种子培养基进行富集培养，在35-37℃、120rpm的条件下，驯化培养9-10h，制得种子液(种子液中菌种总浓度为1×10⁷-1×10⁸cfu/mL)；

第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体烟酸作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢：将20mL种子液和烟酸加入装有1g葡萄糖、0.5mL营养液的血清瓶中，用蒸馏水补充体积至50mL，再用稀碱或稀酸溶液调节pH7-8，即为发酵体系，在血清瓶中通入氮气(充入氮气排出空气)后密封血清瓶，在35-37℃、120rpm的条件下振荡培养38h，进行发酵产氢。

烟酸在发酵体系中的初始浓度分别为0mg/L、4mg/L、8mg/L、12mg/L和20mg/L，对应的产氢量结果见表3。

表3烟酸添加对产氢量及主要副产物的影响

从表3可以看出，当发酵体系中加入NAD⁺合成前体烟酸时，对提高牛粪堆肥的产氢量有良好的促进作用，同时能够有效降低副产物挥发性脂肪酸、醇的生成，降低后续发酵废液的处理难度。其中，当发酵体系中NAD⁺合成前体烟酸的初始浓度为8mg/L时，效果最佳，累积产氢量相对于对照组(烟酸0mg/L)提高11.3％；发酵废液中各种挥发性脂肪酸如乙醇、乙酸、丙酸和丁酸的浓度较对照组分别下降10.2％、12.7％、12.0％和9.0％。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，

第一步，采用堆沤成熟的牛粪堆肥作为天然混合菌源，进行富集培养，制得种子液；

第二步，以种子液作为接种物，NAD⁺合成前体作为生长因子，加入常规暗发酵产氢培养基，进行发酵产氢；

所述的NAD⁺合成前体为烟酰胺、烟碱、烟酸。

2.根据权利要求1所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，第一步的具体方法为：将牛粪堆肥和水按照重量比1:4的比例混合，搅拌均匀，密封，采用输出功率为2450W的微波炉处理1.5min后，处理液过60目筛，滤液加入种子培养基进行富集培养，在35-37℃、120rpm的条件下，驯化培养9-10h，制得种子液。

3.根据权利要求2所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，所述的种子培养基成分包括：10g/L蔗糖、1g/L NH₄HCO₃、0.2g/L KH₂PO₄，自然pH。

4.根据权利要求1-3任一项所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，所述的种子液中菌种总浓度为1×10⁷-1×10⁸cfu/mL。

5.根据权利要求1所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，第二步的具体方法为：将20mL种子液和NAD⁺合成前体加入装有1g葡萄糖、0.5mL营养液的血清瓶中，用蒸馏水补充体积至50mL，再用稀碱或稀酸溶液调节pH7-8，即为发酵体系；在血清瓶中通入氮气后密封血清瓶，振荡培养，进行发酵产氢。

6.根据权利要求5所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，所述的营养液成分包括：2.0g/L NH₄HCO₃、1.0g/L KH₂PO₄、0.1g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L NaCl、0.01g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.01g/L CaCl₂·2H₂O、0.015g/L MnSO₄·7H₂O、0.00278g/L FeCl₂。

7.根据权利要求5所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，所述的烟酰胺在发酵体系中的初始浓度为8mg/L；所述的烟碱在发酵体系中的初始浓度为2×10^-3mL/L；所述的烟酸在发酵体系中的初始浓度为8mg/L。

8.根据权利要求5-7任一项所述的提高天然混合菌源NADH途径产氢量的方法，其特征在于，所述的振荡培养条件为：温度35-37℃，转速120rpm，时间38h。