CN103045489B

CN103045489B - 一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法

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Publication number: CN103045489B
Application number: CN201210531671.1A
Authority: CN
Inventors: 刘冬梅; 周康; 范梦珂; 叶嘉伦
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN103045489A

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法，所述黑曲霉（Aspergillus niger）FOS-0620，为需氧菌，孢子为黑色，菌丝为乳白色，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC No.6640。一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，包括以下步骤：（1）利用权利要求1所述的黑曲霉FOS-0620制备黑曲霉全细胞；（2）利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。本发明得到的产品经高压液相色谱法检测，低聚果糖的含量（占总固形物）≥50%，本发明的工艺简单，操作方便，酶活性高，转化效率高，具有重要的工业价值。

Description

一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法

技术领域

本发明属于低聚糖的技术领域，涉及低聚果糖的发酵生产方法，具体涉及一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。

背景技术

低聚果糖，又称蔗果低聚糖（Fructooligosaccharides，缩写为FOS），是由1～3个果糖基通过β-1，2糖苷健与蔗糖结合而生成蔗果三糖（1-Kestose）、蔗果四糖（Nystose）和蔗果五糖（1^F-Fructofuranosylnystose）的混合物。FOS具有促进肠道内益生菌，例如双歧杆菌的增殖，排毒清洁肠道，提高人体免疫力，改善脂质代谢，能预防蛀牙，不被消化道吸收利用等优异性能，现被广泛用于保健食品配料中。

目前生产低聚果糖有两种方法：（1）液体深层发酵法；（2）固定化酶法。这两种方法都是以蔗糖为原料，由β-呋喃果糖苷转移酶（β-Fructofuranosidase）进行果糖基转移反应而合成，蔗糖既是果糖的供应者也是接收者{刘冬梅，于淑娟，李国基，等.一种新型的功能性低聚糖-蔗果低聚糖及其生产方法，食品工业，1998，3：14-16}。得到广泛应用的是液体深层发酵法，是指利用能分泌β-呋喃果糖基转移酶的微生物，经过培养后从培养液分离收集菌丝体，将菌丝体投入到含蔗糖、蛋白质、无机盐的复杂转化溶液中，在一定的条件下转化为含有低聚果糖（FOS）的糖浆。液体深层发酵法需要前期投入大量的发酵设备及其附属设备，所生产出来的产品成分复杂，不仅要除去大量的菌丝体，蛋白质和无机盐等杂质，而且还容易发生美拉德褐变，给后期的分离纯化带来诸多的困难，并且易使产品色度加深，影响感官质量。

而固定化酶的方法，因为固定后的酶容易游离，且底物和产物要不断穿过载体屏障，产率会受到很大的影响。专利号为01128345.9的中国发明专利主要利用固定化果糖基转移酶生产低聚果糖，先培养出大量的菌丝体，将菌丝体破壁后将酶分离纯化，再将酶与有机高聚物进行交联固定化后，用分批或柱式反应法进行固定化果糖基转移酶生产低聚果糖。该方法的不足之处是步骤繁多，酶在固定化过程中非常容易失活，转化率低，由于蔗糖和转化后的产物要穿过固定化的颗粒，传质均匀性受到限制。另外，酶的分离纯化过程复杂且在此过程中酶活性有部分损失，在立体结构环境中不稳定，易失活等缺点，且酶的价格昂贵，造成酶法转化成本较高，这些方面均严重制约了其的工业化应用。

发明内容

本发明针对现有低聚果糖转化的酶制剂及其工艺上的不足，目的在于提供一种黑曲霉及其全细胞催化生产低聚果糖的方法。该种全细胞酶制剂制备方法简单，不涉及到酶的分离纯化。这种全细胞酶制剂具有转化效率高，性能稳定的特点。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种黑曲霉是指黑曲霉（Aspergillus niger）FOS-0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6640。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。所述的黑曲霉具有如下性质：

（1）形态特征：该菌株为需氧菌，菌丝为乳白色，孢子为黑色。

（2）生理特征：最适生长温度为25-30℃，最适合生长pH为5.5-6.0，可将蔗糖转化为低聚果糖的酶活，转化率高达99%，能催化生成FOS的含量为55%以上。

一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，包括以下步骤：

（1）利用权利要求1所述的黑曲霉FOS-0620制备黑曲霉全细胞；

（2）利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。

优选地，所述黑曲霉全细胞的制备，包括如下步骤：

（1）将黑曲霉孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁵个/L～10¹⁰个/L，于25℃-35℃，转速为100r/min～300r/min的条件下培养16h～24h后的菌体溶液为种子液；

（2）以体积比为5~10：100的比例，将步骤（1）所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25℃~35℃，转速为100r/min～300r/min的条件下培养16h～24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞溶液；

（3）收集步骤（2）所得的黑曲霉全细胞溶液，用无菌的200目～400目的滤布过滤、洗涤、再过滤、干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

优选地，所述的种子液体培养基为：20～50g/L蔗糖，3g/L～7g/L麦芽粉或10g/L～30g/L玉米粉，5g/L～10g/L蛋白胨和50g/L～100g/L酵母提取物中的一种或两种，1g/L～3g/L NaCl和1g/L～2g/L NaNO₃中的一种或两种。

优选地，所述的产酶诱导剂为蔗糖、淀粉、无机盐和酵母提取物中的两种以上的混合物，所述无机盐为K₂HPO₄、MgSO₄.7H₂O和NaNO₃中的一种或两种以上的混合物。

优选地，所述的含产酶诱导剂的液体培养基为：10g/L～70g/L蔗糖，15g/L～55g/L玉米粉，20g/L～50g/L酵母提取物，0g/L～12g/L K₂HPO₄，0g/L～1.5g/L MgSO₄.7H₂O，3g/L～10g/L NaNO₃。

优选地，步骤（3）所述洗涤采用的是NaCl生理盐水溶液，所述干燥为真空冷冻干燥或真空干燥。

优选地，所述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下：

（1）以重量体积比为1~10：100（m/V）的比例，将所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系中，于pH5.0-7.0，温度45℃~55℃，转速为100r/min～300r/min的条件下进行转化24h～48h；

（2）转化完成后，过滤转化液，回收黑曲霉全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩，即制得低聚果糖。

优选地，所述FOS转化体系的pH是用K₂HPO₄/KH₂PO₄系列缓冲液调节。

优选地，所述FOS转化体系是重量百分比为40%-60%的蔗糖溶液。

本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：

（1）本发明制作方法简单，不涉及到酶繁杂分离纯化的过程，简化了设备的投资。

（2）黑曲霉所需要的营养低，易培养，易操作，制作工艺简单，细胞体相当于酶的天然保护层，可有效避免酶的失活，免去了酶固定化的步骤。

（3）简化了低聚果糖的生产工艺，直接将黑曲霉全细胞投入到转化液中，减少了液体深层发酵培养中发酵罐及其附属设备的投入。

（4）将黑曲霉全细胞投入到FOS的转化体系中，所得的FOS糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即可得到固形物中的总低聚糖的含量≥50%的FOS糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。

附图说明

图1为本发明实施例1利用黑曲霉全细胞催化生产得到的FOS糖浆的HPLC图。

图2为本发明黑曲霉全细胞催化生产FOS糖浆的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1

第一步：将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁵个/L，于33℃，转速为150r/min的摇床上培养16h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为：20g/L蔗糖，30g/L玉米粉，100g/L酵母提取物，2g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步：以体积比为5：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于33℃，转速为150r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；含产酶诱导剂的液体培养基为：70g/L蔗糖，20g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，3g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步：收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步：以重量体积比为1：100（m/V）的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比50%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5.0、于温度为45℃和转速为150r/min的条件下进行转化24h。

第五步：转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。

根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的方法，利用高压色谱法检测FOS糖浆中低聚果糖的含量，如图1所示，其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的出峰时间分别为13.944min、19.044min和26.063min，百分比分别为27.31%、24.43%和3.78%，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为55.52%，果糖、葡萄糖和蔗糖的出峰时间分别为7.084min、7.746min和9.538min，百分含量分别为4.11%、26.76%和13.61%。

实施例2

第一步：将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10¹⁰个/L，于28℃，转速为100r/min的条件下培养24h后的菌液为种子液；所述种子液体培养基为：50g/L蔗糖，7g/L麦芽粉，10g/L蛋白胨，3g/L的NaCl；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步：以体积比为10：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于28℃，转速为100r/min的条件下培养16h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为：70g/L蔗糖，35g/L酵母提取物，15g/L玉米粉，12g/L K₂HPO₄，1.5g/LMgSO₄.7H₂O，10g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步：收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的400目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步：以重量体积比为1：100（m/V）的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比60%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为6.0、于温度55℃和转速为200r/min的条件下进行转化24h。

第五步：转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为55.30%。

实施例3

第一步将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁶个/L，于25℃，转速为120r/min的条件下培养20h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为：30g/L蔗糖，5g/L麦芽粉，7g/L蛋白胨，50g/L的酵母提取物，1.5g/L NaCl，1.5g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步以体积比为8：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25℃，转速为300r/min的条件下培养20h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为：10g/L蔗糖，50g/L酵母提取物，20g/L玉米粉，6g/L K₂HPO₄，0.5g/L MgSO₄.7H₂O，6.5g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的300目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步以重量体积比为5：100（m/V）的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比40%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为7.0、于温度50℃和转速为300r/min的条件下进行转化36h。

第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为55.12%。

实施例4

第一步将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到液种子液体培养基中，接种量为1×10⁷个/L，于35℃，转速为200r/min的条件下培养18h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为：40g/L蔗糖，10g/L玉米粉，3g/L麦芽粉，5g/L蛋白胨，70g/L酵母提取物，2g/L NaCl，1.0g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步以体积比为7：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于30℃，转速为200r/min的条件下培养18h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述含产酶诱导剂的液体培养基为：50g/L蔗糖，40g/L酵母提取物，55g/L玉米粉，3.5g/L K₂HPO₄，0.8g/L MgSO₄.7H₂O，5.5g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的250目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步以重量体积比为8：100（m/V）的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比55%蔗糖溶液中，将FOS该转化体系pH调为7.0、于温度48℃和转速为100r/min的条件下进行转化30h。

第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为55.47%。

实施例5

第一步将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁸个/L，于30℃，转速为300r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基为：45g/L蔗糖，20g/L玉米粉，7.5g/L蛋白胨，60g/L酵母提取物，1.2g/LNaCl，1g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步以体积比为9：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于35℃，转速为250r/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为：45g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，35g/L玉米粉，9.0g/L K₂HPO₄，1.0g/LMgSO₄.7H₂O，5.0g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的350目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空冷冻干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步以重量体积比为7：100（m/V）的比例，将第三步所得黑曲霉全细胞置于为重量百分比53%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5.5、于温度47℃和转速为250r/min的条件下进行转化40h。

第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为55.60%。

实施例6

第一步将黑曲霉FOS-0620的孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁹个/L，于29℃，转速为180r/min的条件下培养22h后的菌体溶液制成种子液；所述种子液体培养基配方为：35g/L蔗糖，15g/L玉米粉，5g/L麦芽粉，8g/L蛋白胨，1.0g/L NaCl，1.2g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第二步以体积比为6：100的比例，将第一步所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于29℃，转速为160/min的条件下培养24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞菌体溶液；所述的含产酶诱导剂的液体培养基为：60g/L蔗糖，45g/L酵母提取物，30g/L玉米粉，9.0g/L NaNO₃；搅拌溶解均匀后用灭菌，冷却后备用；

第三步收集第二步所得的黑曲霉全细胞菌体溶液，用无菌的200目的滤布过滤，用9g/L的NaCl溶液洗涤、再过滤，真空干燥，得到具有转化活性的黑曲霉全细胞。

第四步以重量体积比为9：100（m/V）的比例，将第三步所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系为重量百分比50%蔗糖溶液中，将该转化体系pH调为5.3、于温度52℃和转速为180r/min的条件下进行转化45h。

第五步转化完成后，用板框过滤器过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩成符合要求的FOS糖浆。根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆中低聚果糖（FOS）的总含量（占干物质）为56.11%。

Claims

1.一种黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergillus niger）FOS-0620，已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.6640。

2.一种黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用权利要求1所述的黑曲霉FOS-0620制备黑曲霉全细胞；

（2）利用上述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全细胞的制备，包括如下步骤：

（1）将黑曲霉孢子接种到种子液体培养基中，接种量为1×10⁵个/L～10¹⁰个/L，于25℃-35℃、转速为100r/min～300r/min的条件下培养16h～24h后的菌体溶液为种子液；

（2）以体积比为5～10：100的比例，将步骤（1）所得的种子液接种至含产酶诱导剂的液体培养基中，于25℃～35℃、转速为100r/min～300r/min的条件下培养16h～24h后的菌体溶液制成黑曲霉全细胞溶液；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的种子液体培养基为：20～50g/L蔗糖，3g/L～7g/L麦芽粉或10g/L～30g/L玉米粉，5g/L～10g/L蛋白胨和50g/L～100g/L酵母提取物中的一种或两种，1g/L～3g/L NaCl和1g/L～2g/LNaNO₃中的一种或两种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的含产酶诱导剂的液体培养基为：10g/L～70g/L蔗糖，15g/L～55g/L玉米粉，20g/L～50g/L酵母提取物，0g/L～12g/L K₂HPO₄，0g/L～1.5g/L MgSO₄.7H₂O，3g/L～10g/L NaNO₃。

6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述洗涤采用的是NaCl生理盐水溶液，所述干燥为真空冷冻干燥或真空干燥。

7.根据权利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉全细胞催化生产低聚果糖的步骤如下：

（1）以重量体积比为1～10：100m/V的比例，将所得的黑曲霉全细胞置于FOS转化体系中，于pH5.0-7.0，温度45℃～55℃，转速为100r/min～300r/min的条件下进行转化24h～48h；

（2）转化完成后，过滤转化液，回收全细胞菌体，滤过液经过真空浓缩机浓缩，即制得低聚果糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述FOS转化体系的pH是用K₂HPO₄/KH₂PO₄系列缓冲液调节。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述FOS转化体系是重量百分比为40%-60%的蔗糖溶液。