CN102851239A - 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 - Google Patents
一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株壳聚糖酶高产菌株及利用该菌株进行液固发酵制备高活性壳聚糖酶和利用该酶生产壳寡糖的方法。本发明所涉及的壳聚糖酶生产菌株，经16SrDNA鉴定为一株蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus），菌株代码为JBSH-003，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.6129。可应用于生产壳寡糖，获得含量较高，分子量范围1500Dalton～2500Dalton，且分子量范围相对集中的壳寡糖。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株产壳聚糖酶的微生物菌株，特别是涉及一株蜡状芽胞杆菌，及利用该菌生产壳聚糖酶和利用该酶生产壳寡糖的方法。
背景技术
壳寡糖是壳聚糖的低分子化产物，多指聚合度在2～12之间、平均分子量在300～3000Dalton之间的低分子量壳聚糖。因壳寡糖具有比壳聚糖更大的生物学应用价值而日益成为国内外学者研究的热点。目前，壳聚糖低分子化的方式主要有三种，物理法（主要指超声波法）、化学法（主要有化学合成法和化学降解法）以及生物酶法。近20年来，生物酶法制备壳寡糖得到了长足的发展，因其成本低廉，环境污染小，被认为是最有潜力的壳寡糖制备技术。
生物酶法制备壳寡糖的关键点之一就是寻找到产酶活性高、发酵周期短、酸碱耐受范围较广的专一性壳聚糖酶，因此，从自然界筛选高活性壳聚糖酶菌株成为研究人员的重要任务之一。近年来，我国科学家在此领域取得了丰硕的成果，一大批新型菌株不断被发现。专利CN 1884477A公开了一株腐皮镰孢菌突变株CGMCC No.1720，该菌发酵产酶周期为44-50小时，壳聚糖酶活为240mU/mL，在酶解底物为2%的情况下需要5-8小时的酶解时间。专利CN101148646A公开了一株枯草芽孢杆菌，该菌株为诱导性壳聚糖酶产生菌，液体深层发酵所得壳聚糖酶平均酶活518U/mL，在底物浓度为5%，酶-底物比为1:10条件下需要的酶解时间为4-6小时。上述两类壳聚糖酶制剂均为液体酶，虽然应用方便，但不利于保存和运输，在一定程度上限制了该酶的应用。中国专利CN 101397752A中采用基因工程手段，构建壳聚糖酶高效表达菌株，其壳聚糖酶表达载体为大肠杆菌，发酵液折合酶活力为350U/ml，该表达体系所产壳聚糖酶为胞内酶，菌体细胞破碎工艺比较复杂，影响了生产成本的降低。但采用基因工程菌发酵产酶是今后酶制剂发展的一个方向。
以上几个文献所报道的菌株，所产壳聚糖酶的活力远高于其他文献报道的菌株，但是仍存在种种缺陷和不足，主要表现在从酶制剂生产利用的角度看，其酶活性依然较低、生产成本偏高，且液体酶制剂不利于保存和运输等，没有从根本上降低壳寡糖生产成本，限制了其大规模应用。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用蜡状芽胞杆菌Bacilluscereus，通过液体发酵或固体发酵生产非诱导性壳聚糖酶的方法，利用该方法生产的壳聚糖酶为胞外酶，且酶活较之现有壳聚糖酶，提高了数倍，所采用的菌株代码为JBSH-003，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6129。
本发明提供的一株壳聚糖酶高产菌株，其保藏号为CGMCC No.6129；
其来源如下：
壳聚糖酶高产菌株Bacillus cereus JBSH-003的获得：
（1）从黄河三角洲地区的腐败落叶及浅表层土壤中分离出37株能水解壳聚糖胶体平板产生透明圈的菌落，并分别进行分离纯化；
（2）从37株产生水解圈的菌落中选出9株水解圈比较大的菌株；
（3）对9株待选菌进行比较深入的生理生化特性、遗传稳定性、产酶速率等研究，最终筛选出一株产酶能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其初步命名为RH 09。
（4）以该菌株为出发菌株，经UV、化学诱变剂反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株JBSH-003。
菌株Bacillus cereus JBSH-003的形态特征：革兰氏染色阳性，杆状，菌体大，两端钝圆，呈短链杆状排列，无荚膜。培养6h后可形成小于菌体的圆形芽胞。
该菌株在普通营养琼脂上形成圆形凸起的菌落，表面粗糙有蜡光，不透明，似毛玻璃。BAP上菌落周围形成β溶血环。在卵黄琼脂平板上菌落周围形成乳白色混浊环。
菌株Bacillus cereus JBSH-003的生理生化反应如下：
碳水化合物试验：该菌能分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、水杨苷，能利用柠檬酸盐，产酸不产气，不分解乳糖、木糖、甘露醇，不产生吲哚，VP试验阳性；含氮化合物试验：醋酸铅明胶培养基上，该菌H2S阴性，能液化明胶；乳光反应：10％卵黄琼脂平板上，培养3h无菌落生长，但在点种处可出现混浊环，6h后混浊环直径可扩大至5～6mm；触酶试验阳性。
菌株Bacillus cereus JBSH-003的上述生化反应，与蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）的生化反应一致，所不同的是，明胶穿刺反应中液化明胶的速度稍快，乳光反应中，所产生的混浊环较上述要大，说明有较强的产酶能力。据此，可初步确定筛选所得菌株为蜡状芽胞杆菌。
发明人对其进行了16S rDNA测序，其序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株JBSH-003的16S rDNA的全序列。
所测得的16S rDNA序列进行BLSTN比对，比对结果显示，菌株Bacilluscereus JBSH-003的16S rDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，与其中明确标记为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的5株菌株有100%的同源性，进一步确定为一株蜡状芽孢杆菌。
本发明所获得的菌株，可以应用于日常的生产当中，特别是可以应用于生产高活性的壳聚糖酶，具体步骤如下：
A.菌种活化；
B.液体种子制备；
C.产酶发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用固体发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶；
或经液体发酵扩繁种子液，再经液体发酵放大生产的发酵液，经离心除杂、微滤除菌、纳滤膜超滤浓缩得浓缩液；
D.干燥粉碎：将上述固体发酵的湿固酶进行低温真空干燥、粉碎，得高活性壳聚糖酶制剂；上述通过液体发酵制备的酶浓缩液，通过喷雾干燥方式进行干燥；
其中上述步骤C制备的发酵液浓缩液，和制备的固体粗酶，均可直接用于壳聚糖水解制备壳寡糖。
其中的壳聚糖酶生产的具体步骤是：
（1）菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的CGMCC No.6129试管斜面菌种移至室温条件下（20℃-25℃）活化4h-8h；
（2）液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的CGMCC No.6129试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养12-18h制备种子液；
（3）发酵产酶：取制备好的液体种子以5%-10%（v/w）的接种量接种于灭菌的固体培养基中，固体发酵制备壳聚糖酶；
（4）干燥粉碎：将发酵完成的固体基质在低于60℃的温度下烘干，粉碎后过80目筛，测定酶活，分装即得壳聚糖酶粗酶产品。
菌株CGMCC No.6129产酶条件的确定，其方法如下：
（1）采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装料量和培养时间，确定液体种子最佳培养条件和固体发酵最佳产酶条件；
（2）采用单因子试验和正交试验，通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌株液体种子最佳培养基组成和固体发酵的最佳产酶培养基组成。
经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株CGMCC No.6129液体种子培养基组成及发酵条件如下：
液体种子培养基组成，按重量份计为：1～3份牛肉膏，0.5～1份酵母粉，1～2份葡萄糖，0.5-1份硫酸铵，3～5份豆粕，2～3份玉米粉，85-92份软化水；
液体种子培养条件：接种量为每个三角瓶接种1只CGMCC No.6129菌株斜面培养物，pH值自然，培养温度33～35℃，摇床转速75-150r/min，培养时间为12h～18h；
经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株CGMCC No.6129固体发酵培养基组成和产酶条件如下：
固体培养基组成，按重量份计为：65～80份麸皮，10～20份豆粕，8～15份玉米粉，1～3份硫酸铵，固体物料与水的重量比为1:1.05～1.5；；
固体发酵条件：接种量为5%-10%（v/w），pH值自然，培养温度为33℃～35℃，发酵时间40h～50h，中间每隔15h翻曲一次。
固体发酵结束以后，将含有壳聚糖酶的发酵湿料于低于60℃的条件下真空干燥，粉碎并过80目筛，即得壳聚糖酶粗品。
菌株CGMCC No.6129所产生的壳聚糖酶酶活采用DNS法检测，具体方法如下：
准确称取0.1g壳聚糖酶粉末于试管中，加10mL去离子水震荡10min，于50℃水浴中保温10min。准确量取上述壳聚糖酶液1mL，加入含5mL 1%的壳聚糖溶液的试管中，50℃下保温30min，用NaOH溶液调节pH值到8，离心去除沉淀。吸取上清液1mL，加入9mL 2M/mL的盐酸，100℃水解2h，DNS法测定其还原糖含量，计算得到酶活。以每分钟内产生相当于1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
在温度55℃-60℃，pH值为5.0，底物浓度4%，酶用量5%（相对于底物，w/w）条件下，对连续生产的8批壳聚糖酶进行测定的结果，其平均酶活为2357U/g，最高为2732U/g。
利用上述过程制备的壳聚糖酶，可以对壳聚糖进行降解，并获得壳寡糖（又称氨基寡糖素、低聚壳聚糖）。
本发明所得壳聚糖酶用于以脱乙酰度高于66%的壳聚糖为原料进行壳寡糖的生产。具体步骤如下：
取壳聚糖，用0.2M的醋酸溶液配制成含6%-10%（w/v）的壳聚糖的溶液，用醋酸调节溶液的pH至4.5-6.5，溶胀充分后，于45℃-65℃水浴中保温30min，准备完毕后按照壳聚糖用量的0.02%-5.0%（w/w）添加上述步骤（1）制备的固体壳聚糖粗酶或者0.05%-5.0%（v/w）的比例添加液体发酵的壳聚糖粗酶，开始计时，反应90min左右开始用氢氧化钠滴定法取样检测，直到反应液刚好不产生沉淀，用碱溶液调节反应液pH值至7.0-8.0，加热煮沸10min灭酶活，终止反应，即可得壳寡糖溶液，上述的反应一般需要1.5h～2.5h，为了加快反应可采用搅拌的方式。对上述完成水解并灭酶的壳寡糖溶液冷却，用高速管式离心机于4000r/min-16000r/min转速下离心，去除絮凝物，即得澄清透明的壳寡糖溶液；对壳寡糖溶液直接喷雾干燥，或用600Dalton的纳滤膜纳滤浓缩后喷雾干燥，即得固体壳寡糖粉末。
上述澄清透明的壳寡糖溶液，其壳寡糖含量为5-8.5%（w/v），纳滤浓缩喷雾干燥得到的固体壳寡糖粉末，其壳寡糖含量为92.5-98.5%（w/w）；
在上述壳聚糖的水解过程中，采用固体发酵粗酶粉，即可达到高效降解壳聚糖的目的，所制备的壳寡糖平均分子量为300-5000Dalton，更优化的结果为所制备的壳寡糖平均分子量为1500～2500Dalton。
上述壳聚糖的水解过程中，也可使用液体粗酶或含有粗酶的发酵液，若使用粗酶提取液或含有粗酶的发酵液，则按照壳聚糖用量的0.05%-5.0%（v/w）添加液体酶制剂。
该酶作用的温度范围为30-65℃，最佳温度为55℃。该酶发挥作用的最适pH值为5.5，但是pH值在4.5～6.5之间壳对壳聚糖酶活的影响不大。
酶用量和酶解时间的选择：酶的用量越大反应时间越短。前述条件下，酶用量为0.05%时，酶解时间为20.5h，酶用量为0.3%时，酶解时间为4.8h，酶用量为1.0%时，酶解时间仅为1.3h。酶在升温灭活过程中酶解反应仍然继续。生产过程中，升温灭酶的过程大约需要0.5h，如果反应速率过高，反应过程不易控制，所以反应时间最好控制在2-3h，既节约反应能耗，又便于控制反应过程。因此，酶用量以0.5%左右较为适宜。
上述的制备反应中，所述的配制壳聚糖溶液的壳聚糖，其脱乙酰度在66%以上；所用调节壳聚糖pH至4.5-6.5的物质为乙酸、盐酸、苹果酸中的一种或几种混合物。所述的碱溶液可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种或几种混合物，所述的离心速度为4000r/min-16000r/min。
利用上述方法生产壳聚糖酶，并进一步生产壳寡糖，产物中基本不含单糖还原糖，目标产物壳寡糖的平均分子量在1500Dalton左右，聚合度相对集中，5-8糖的含量居多。许多研究表明，5-8糖的壳寡糖具有较高的生物学活性，免疫调节活性明显，对植物的抗性诱导能力也较强。除此之外，
（1）菌株CGMCC No.6129所产壳聚糖酶是壳聚糖的专一性内切酶，且主要为胞外酶，有利于后期对酶制剂产品的进一步分离和纯化；
（2）菌株CGMCC No.6129产壳聚糖酶的产酶特性为非诱导性产酶，通过液体发酵或固体发酵产酶时，发酵培养基中无需添加壳聚糖等产酶诱导因子进行诱导；
（3）利用该菌株固体发酵所产壳聚糖酶活性高达2732U/g，高于目前国内文献报道的其他菌株。该菌株的应用可大大缩短酶解工序的反应时间，提高了生产效率，客观上节约了生产成本；
（4）该菌株所产壳聚糖酶具有较宽的温度和pH值适应范围，有利于酶活在不同条件下有效发挥作用，在温度30～60℃之间，pH值4.5-6.5之间都具有较高的酶活，这一特性尤其有利于该酶的工业化应用。
（5）该菌株易于培养，固体发酵培养基组成成分简单、廉价易得，产酶条件不苛刻，50℃条件下干燥前后，酶活基本没有损失，因而酶的制取成本较低。
（6）利用固体发酵CGMCC No.6129菌株生产固体壳聚糖酶对壳聚糖进行水解，无需进行产物分离和纯化，固体发酵物直接干燥粉碎过筛后即可直接用于壳聚糖的水解，且对壳寡糖的水解效果和后期分离无较大的影响，进一步降低了工艺复杂性和生产成本。
保藏信息
保藏时间：2012年5月22日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.6129
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
液体种子培养
种子培养基组成（w/w）为：牛肉膏2%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，硫酸铵0.5%，豆粕3%，玉米粉3%，余量为水；初始pH值自然；121℃，0.15Mpa灭菌20min.
种子培养条件：无菌条件下，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的CGMCCNo.6129试管斜面菌种冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，培养温度33～35℃，摇床转速150r/min，培养时间为12～18h；
实施例2
固体发酵培养
固体发酵培养基组成（w/w）：70%麸皮，15%豆粕，13%玉米粉，2%硫酸铵；料水比为1:1.1；初始pH值自然；培养温度为33℃，发酵时间48h；每隔15h翻曲一次。
发酵完成后，55℃烘干、粉碎，过80目筛，即为壳聚糖酶粗酶。抽样并DNS法检测酶活，平均酶活2547U/g。
实施例3
固体发酵培养
固体发酵培养基组成（w/w）：80%麸皮，10%豆粕，7%玉米粉，3%硫酸铵；料水比为1:1.15；初始pH值自然；培养温度为33～35℃，发酵时间48h；每隔15h翻曲一次。
发酵完成后，50℃烘干并粉碎，过筛，即得到壳聚糖酶粗酶，抽样并检测壳聚糖酶活，平均酶活2732U/g。
实施例4：
酶用量的确定
取壳聚糖100g（脱乙酰度为95.7%），用醋酸溶液配制成1L 10%的壳聚糖溶液，添加适量HAc调节溶液的pH值为5.0，溶胀充分后，于55℃水浴中保温30min。按表1所示的比例添加固体壳聚糖酶（酶用量为壳聚糖用量的百分比，W/W），开始计时，反应60min左右开始，用氢氧化钠滴定法取样检测（每5min取样一次），直到不再产生沉淀时为反应终点，加热煮沸10min灭酶。重复此实验3次，记录反应终点所需的时间。结果见表1。
表1壳聚糖酶用量对酶解时间的影响
由表1可见，酶的用量越大反应时间越短，但是酶升温灭活过程中酶解反应仍然继续。生产过程中，升温灭酶的过程大约需要0.5h，如果反应速率过高，反应过程不易控制，所以反应时间最好控制在2-3h，既节约反应能耗，又便于控制反应过程。因此，酶用量以0.5%左右较为适宜。
实施例5
取100g壳聚糖（脱乙酰度为95.7%），用醋酸溶液配制成1L10%的壳聚糖溶液，添加适量HAc调节溶液的pH值为5.0，溶胀充分后，于55℃水浴中保温30min。准备完毕后按壳聚糖用量的0.5%（w/w）添加自制固体壳聚糖酶，开始计时，反应120min左右开始检取样测（每5mi n取样一次）直到刚好不产生沉淀为止，加热煮沸10min灭酶,终止反应。重复此实验3次，酶解所用时间分别为145min，150min，140min。酶解产物经乙酰丙酮法检测平均分子量为1736Dalton。
比较例
取取100g壳聚糖（脱乙酰度为95.7%），用醋酸溶液配制成1L10%的壳聚糖溶液，添加适量HAc调节溶液的pH值为5.0，溶胀充分后，于55℃水浴中保温30min。准备完毕后按壳聚糖用量的0.5%（v/w）添加市售液体酶制剂和本发明实施例所获得的壳聚糖酶，开始计时，反应120min左右开始检取样测（每10min取样一次）直到刚好不产生沉淀为止，反应终止，加热煮沸10min灭酶。重复此实验3次，酶解所用时间分别为10.5h，10.6h，10.2h。酶解产物经乙酰丙酮法检测平均分子量为2659Dalton。实验结果如表2。
表2不同来源的酶制剂酶解效果比较
从表2可以看出，市售的浓缩液体酶反应需要10h，而自制粗酶仅需要2.4h，极大地缩短了生产时间，节约了生产成本；且液体酶为浓缩酶，需要低温保存，而自制酶是粗酶，仅需烘干即可，制剂成本有较大的差异，综合这两点，可以大大降低壳寡糖生产成本。
Claims (7)
1.一株壳聚糖酶生产菌株，其保藏号为CGMCC No.6129。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶高产菌株，其特征在于：蜡状芽孢杆菌，Bacillus cereus，菌株代码为JBSH-003，该菌株的16S核糖体DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No:1所示。
3.利用如权利要求1所述菌株，生产壳寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）壳聚糖酶粗酶的制备：
A.菌种活化；
B.液体种子制备；
C.产酶发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用固体发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶；
D.干燥粉碎：将上述固体发酵的湿固酶进行低温真空干燥、粉碎，得高活性壳聚糖酶制剂；
（2）对壳聚糖水解生产壳寡糖：
取壳聚糖，用0.2M的醋酸溶液配制成含重量分数为6%-10%的壳聚糖的溶液，用酸调节溶液的pH至4.5-6.5，溶胀充分后，于45-65℃水浴中保温30min，准备完毕后按照壳聚糖用量的0.02%-5.0%（w/w），添加上述步骤（1）制备的固体壳聚糖粗酶，开始计时，反应90min后开始用氢氧化钠滴定法取样检测，直到反应液刚好不产生沉淀，用碱溶液调节反应液pH值至7.0-8.0，加热煮沸10min灭酶活，终止反应，即可得壳寡糖溶液。
4.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于：所获得的壳寡糖溶液冷却后，用高速管式离心机离心，去除絮凝物，即得澄清透明的壳寡糖溶液；对壳寡糖溶液直接喷雾干燥，或用600Dalton的纳滤膜纳滤浓缩后喷雾干燥，即得固体壳寡糖粉末。
5.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于：所述的配制壳聚糖溶液的壳聚糖，其脱乙酰度在66%以上；所用调节壳聚糖pH至4.5-6.5的物质为醋酸、盐酸、苹果酸中的一种或几种混合物；所用调节反应液pH值至7.0-8.0的碱溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种或几种混合物的水溶液。
6.根据权利要求4所述生产方法，其特征在于：所述的离心速度为4000-16000r/min。
7.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于：所述的壳聚糖粗酶，还可以采用液体发酵的壳聚糖粗酶，具体制备方法如下：
经液体发酵放大生产的发酵液，经离心除杂、微滤除菌、纳滤膜超滤浓缩得浓缩液。
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